Introducción

Las garrapatas ocasionan pérdidas económicas en el ganado a nivel mundial, parasitan una amplia gama de huéspedes vertebrados y transmiten una gran variedad de agentes patógenos, más que cualquier otro grupo de artrópodos (^{Prudencio et al., 2010}).

La garrapata Rhipicephalus microplus se alimenta de la sangre del ganado bovino, su hospedero definitivo, y es considerada como uno de los parásitos más dañinos en el ganado de zonas tropicales y subtropicales (^{Antunes et al., 2014}).

La infestación por garrapata R. microplus afecta negativamente la productividad del ganado, transmite enfermedades tales como la babesiosis y la anaplasmosis (^{Jonsson, 2006}). Las pérdidas económicas anuales en la industria ganadera son estimadas entre veintidós a treinta billones de dólares (Tabor et al., 2016), las cuales son resultado de la actividad directa en la alimentación de las garrapatas en su hospedero y del costo que ocasiona controlar tanto a las garrapatas como a las enfermedades producidas por los patógenos que ellas transmiten (^{Manjunathachar et al., 2014}).

El método tradicional para el control de garrapatas está basado en el uso de químicos acaricidas a los cuales las garrapatas han desarrollado resistencia (^{Graf et al., 2004}). Esto dificulta la erradicación y el control de las garrapatas, por lo que el uso de productos químicos no representa la mejor opción (^{Sonenshine y Roe, 2013}). Tomando en cuenta la creciente preocupación por la seguridad del medio ambiente, la salud humana y la salud animal, se han vuelto necesarias las medidas de control alternativas (^{Abbas et al., 2014}). Actualmente una estrategia para el control de la garrapata es el desarrollo de la inmunidad en el hospedero al administrar antígenos de la garrapata por medio de vacunas (^{Walker, 2009}). La vacunación es considerada como una alternativa rentable, amigable con el medio ambiente, no genera contaminación residual en los productos de origen animal, es de fácil aplicación y es tecnología económica (^{Jonsson, 2006}).

En los años noventa aparecieron comercialmente las vacunas contra la garrapata del ganado (^{Kaewmongkol et al., 2015}). Estas vacunas están basadas en la forma recombinante del antígeno oculto Bm86 del intestino de R. microplus (^{García-García et al., 1998}). Sin embargo, la eficacia de esta vacuna varía de acuerdo a los aislados existentes en las diferentes zonas geográficas (de la ^{Fuente et al., 2007}), lo cual puede ser debido a variaciones alélicas en el gen bm86 (^{De La Fuente y Kocan, 2006}) (^{Sossai et al., 2005}). Una diferencia del 3.4% en la secuencia de Bm86 entre las diferentes cepas puede ser suficiente para causar una respuesta inmune ineficiente (^{García-García et al., 1999}). Se sugiere que existe una correlación inversa entre la eficacia de la vacuna y la variación del locus de bm86 (^{Freeman et al., 2010}). Todo esto sugiere que un candidato vacunal debe ser conservado en su secuencia de aminoácidos entre distintas cepas o aislados para poder ser eficaz.

Existe un gran número de proteínas de garrapatas que han sido evaluadas como componentes para las vacunas, obteniendo diferentes porcentajes de protección, entre las que se encuentran BmVDAC y Subolesina (^{Taheri et al., 2014}). La proteína BmVDAC está presente en las células del intestino de la garrapata, es una porina mitocondrial, interviene en regulación de la apoptosis en células infectadas, y tiene una sobre expresión importante durante la invasión de Babesia bigemina (^{Rodríguez-Hernández et al., 2015}). La proteína Subolesina se localiza en diferentes órganos de la garrapata como los ovarios, las glándulas salivales y el intestino. Además, interviene en la digestión de la sangre, la reproducción y el desarrollo de la garrapata (de la ^{Fuente et al., 2008}). Un aspecto importante en la selección de antígenos que protejan contra las garrapatas, es la evaluación de la variabilidad alélica de los candidatos vacunales en las cepas de garrapatas de diferentes zonas geográficas; la identificación de secuencias peptídicas conservadas en estos candidatos vacunales permitirá obtener una vacuna con una protección elevada contra las diferentes cepas (^{de la Fuente y Kocan, 2003}) (^{Manjunathachar et al., 2014}). Derivado de lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue analizar la variabilidad alélica en las secuencias de los antígenos vacunales BmVDAC y Subolesina de R. microplus en cepas provenientes de diferentes estados de México.

Método

Resultados

Los aislados de R. microplus fueron obtenidos de diferentes zonas geográficas de México como se muestra en la Tabla 1.

La secuencia utilizada como referencia para bmvdac corresponde a un fragmento de 819 pares de bases y va de los nucleótidos 1 al 819 de la cepa Media Joya de Tapalpa, Jalisco, reportada previamente (^{Rodríguez-Hernández et al., 2015}), y de ese fragmento fueron amplificadas 750 pares de bases para el presente estudio. Este fragmento corresponde al 91.57% de la secuencia de referencia, y para subolesina la secuencia de referencia corresponde al fragmento de 442 pares de bases y va del nucleótido 1 al 442 de la cepa Munoz usada como referencia y publicada anteriormente (^{Almazán et al., 2010}). De ese fragmento fueron amplificados 438 pares de bases que corresponden al 99.3% de la secuencia utilizada como referencia.

Para el alineamiento múltiple de bmvdac, se analizaron ocho aislados de R. microplus además de la secuencia de referencia reportada en GenBank (Fig. 1). En donde se observan las zonas conservadas entre las diferentes secuencias, los aislados que presentan diferencias en este alineamiento son, Jalisco, Tabasco, Sinaloa, Nayarit y Chiapas, las cuales presentan solamente un aminoácido diferente.

Fig. 1 Alineamiento múltiple de las secuencias de Jalisco, Tabasco, Chiapas, Nayarit, Querétaro, Tamaulipas, Guerrero, Sinaloa y la cepa de referencia GU994210.1. En amarillo están marcadas las regiones conservadas de las diferentes secuencias para el gen bmvdac. Se utilizó el programa CLUSTAL O (1.2.4) múltiple sequence alignment. 

En promedio de observa un porcentaje del 99.79% de identidad y similitud. En seis de las nueve secuencias utilizadas provenientes de las diferentes zonas geográficas de México, se observó un porcentaje tanto de identidad como de similitud del 99.87% en las secuencias de aminoácidos de Chiapas, Nayarit, Media Joya, Querétaro, Tamaulipas y Guerrero. En las secuencias provenientes de Jalisco, Tabasco y Sinaloa presentaron el 99.56% en identidad y similitud. En promedio se observa un porcentaje de variabilidad de 0.21% entre las secuencias de bmvdac, como se indica en Tablas 2 y 3.

En el alineamiento múltiple de subolesina con siete diferentes aislados provenientes de Yucatán, Nayarit, Querétaro, Chiapas, Sinaloa, Veracruz y Tamaulipas y la cepa Muñoz de referencia (Fig. 2), se observan las zonas conservadas entre las diferentes secuencias, los aislados que presentan diferencias en este alineamiento son, Sinaloa, Nayarit y Yucatán.

Fig. 2 Alineamiento multiple de las secuencias de Yucatán, Nayarit, Querétaro, Sinaloa, Veracruz, Tamaulipas y la cepa de referencia ABA62328.1. En amarillo se encuentran marcadas las regiones conservadas de las diferentes secuencias para el gen subolesina. Se utilizó el programa CLUSTAL O (1.2.4) múltiple sequence alignment. 

Además, se observó un porcentaje promedio de identidad del 99.87% y similitud del 100% entre las secuencias de aminoácidos. De las ocho secuencias, siete de ellas presentaron procentaje de identidad del 99.91%, mientras que para la secuencia de Nayarit el porcentaje fue de 99.39% (Tabla 4 y 5). La variabilidad promedio observada entre las secuencias de aminoácidos fue del 0.13%.

Tanto los alineamientos multiples como los porcentajes de identidad y similitud resultantes en el presente estudio muestran la presencia de zonas conservadas entre las diferentes secuencias tanto para BmVDAC como para Subolesina; con base en lo reportado por ^{García et al. (1999)} y ^{Freeman et al. (2010)}, referente a que el polimorfismo puede ser la causa de la variabilidad en la eficacia de la vacuna con el antígeno Bm86. BmVDAC y Subolesina, por su parte, presentan potencial para ser considerados como candidatos vacunales para el control de la garrapata R. microplus en México.

Los análisis filogenéticos mostraron similitudes muy elevadas en el árbol diseñado utilizando el método UPGMA. En el filograma construido para bmvdac con los aislados incluidos en el presente estudio se observan tres ramificaciones principales (Fig. 3), en la primera de ellas se encuentran, Chiapas, la cepa de referencia GU994210.1, Tamaulipas, Guerrero, Nayarit y Querétaro, las cuales presentan una misma secuencia genética localizada en diferentes zonas geográficas. Por otra parte, Sinaloa comparte una gran similitud con Tabasco y Jalisco. La segunda y tercera ramificación están conformada por las secuencias utilizadas como grupo externo (Amblyomma variegatum e Ixodes Scapuraris). El porcentaje obtenido del método Bootstrap de 10000 réplicas es mayor al 50% como se observa en los nodos respectivos (^{Xiong, 2006}).

Fig. 3 Relación filogenética de los aislados de R. microplus para el gen bmvdac. El árbol filogenético fue construido utilizando el método UPGMA. Al lado izquierdo del nodo se encuentra el porcentaje de soporte del método Bootstrap utilizando 10000 réplicas. 

El árbol filogenético para subolesina presenta tres ramificaciones (Fig. 4), en la primera, se encuentran una misma secuencia genética en los aislados de Sinaloa, Yucatán, Veracruz, Tamaulipas, Querétaro, Chiapas y la cepa de referencia ABA62328, por una parte y por la otra, se encuentra Nayarit. En la segunda y tercera ramificación se encuentra la secuencia de Amblyomma cajennense e Ixodes ricinus respectivamente, ambas utilizadas como grupo externo. El porcentaje obtenido del método Bootstrap de 10000 réplicas es del 82%.

Fig. 1. Relación filogenética de los aislados de R. microplus para el gen subolesina. El árbol filogenético fue construido utilizando el método UPGMA. Al lado izquierdo del nodo se encuentra el porcentaje de soporte del método Bootstrap utilizando 10000 réplicas. 

Discusión y Conclusiones

Este reporte representa la primera investigación de la caracterización de la variabilidad alélica para para los genes bmvdac y subolesina, dos antígenos vacunales contra R. microplus entre aislados de diferentes estados en México. De acuerdo a lo reportado por ^{Kaewmongkol et al., 2015}, la variabilidad en la secuencia obtenida de la garrapata R. microplus para Bm86 es una posible explicación referente al rango de eficacia presentada en la vacuna contra este parásito, utilizando como antígeno la proteína recombinante Bm86. Debido a esto, para amplificar bmvdac y subolesina se seleccionaron aislados representativos de diferentes áreas geográficas de México, para de esta manera determinar la variabilidad entre las secuencias provenientes de diferentes estados del país.

De acuerdo a los datos publicados por ^{García-García et al., 1999}, la variabilidad superior al 3.4% entre las diferentes secuencias es suficiente para producir una respuesta inmune ineficiente, por lo que es importante destacar que la variabilidad entre las secuencias de aminoácidos de los aislados en el presente estudio es de un 0.21% para bmvdac y para subolesina se observa una variabilidad del 0.13%. Por consiguiente, con este análisis se considera que bmvdac y subolesina son antígenos que se encuentran conservados en las secuencias de las poblaciones de R. microplus de las diferentes zonas geográficas del país.

En el árbol filogenético para bmvdac se observa que las secuencias incluidas en la construcción del árbol presentan una misma secuencia genética localizada en seis diferentes zonas geográficas, lo cual indica que su alto porcentaje de similitud se encuentra disperso en las diferentes poblaciones de R. microplus; se observan diferencias en las secuencias de Jalisco, localizado en la zona oeste de México, Tabasco en el sureste y Sinaloa en el noroeste. En el árbol filogenético para subolesina, de las ocho secuencias incluidas para la construcción del árbol, siete de ellas provenientes de diferentes zonas geográficas comparten una misma secuencia genética, mientras que solo una de ellas, en este caso Nayarit localizado en la zona oeste del país, presenta variabilidad en su secuencia. Las diferencias observadas tanto bmvdac como en subolesina pueden ser debidas a la movilización del ganado del sur del país hacia los estados del norte y no a las diferentes zonas geográficas de donde provienen los aislados utilizados en el presente estudio, lo cual difiere de lo sugerido por De la ^{Fuente et al., 2007}. El porcentaje obtenido del método Bootstrap utilizando 10000 réplicas tanto para bmvdac como para subolesina es superior al 50%, lo cual indica un soporte estadístico fiable, de acuerdo a lo reportado por ^{Xion et al., 2006}.

Considerando la baja variabilidad alélica presentada entre las secuencias de los aislados de R. microplus de los diferentes estados de México, se concluye que tanto BmVDAC como Subolesina son antígenos que presentan secuencias altamente conservadas en aislados de México, por lo que pueden ser considerados como potenciales candidatos vacunales de acuerdo a lo reportado por ^{Freeman et al., 2010}, donde sugiere que existe una correlación inversa entre la eficacia de la vacuna y la variación del locus; por lo tanto, esta información es relevante para la selección de antígenos empleados en las vacunas contra garrapatas R. microplus. Se sugiere la realización de evaluaciones in vivo para determinar su efectividad como inmunógenos.