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Introducción
La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos más importantes en el mundo. De acuerdo con Fernie y Willmitzer (2001) ocupa el cuarto lugar en producción anual después de arroz (Oryza sativa L.), trigo (Triticum aestivum L.) y cebada (Hordeum vulgare L.). Por esto, las estrategias que permitan mejorar su producción son necesarias. El tubérculo de papa que se consume como alimento, es un tallo subterráneo acortado y ensanchado, derivado de la división y alargamiento celular de la región subapical de estolones. Los estolones son tallos producidos por el alargamiento y desarrollo de las yemas laterales subterráneas de la base del tallo principal de la planta (Xu et al., 1998).
Las yemas de estolones se forman de tejidos no diferenciados resguardados en las zonas axilares del tallo, los que se distinguen de otros tejidos aledaños por sus células con núcleos grandes. Después de formarse, la yema del estolón tiende a formar y desarrollar entrenudos sucesivos. El ápice del estolón origina un par de primordios foliares inicialmente opuestos, luego alternos y entre ellos se ubica el domo del meristemo apical; con las divisiones continúa la diferenciación de otros tejidos en la porción proximal de este órgano (Salas et al., 2003).
La producción de estolones y tubérculos varía con la variedad de papa (Hernández, 2012). Ágata es una variedad comercial que se caracteriza por su porte bajo (30 a 40 cm), ciclo de producción de 90 días (después de siembra, DDS), producción de 10 a 13 estolones por tallo vegetativo, y tasa mayor de inducción de estolones y tuberización en la etapa vegetativa (2 a 10 días después de la emergencia, DDE). En contraste, la variedad Fianna presenta plantas de porte mediano (50 a 80 cm) con ciclo de producción de 120 a 150 DDS, producción de seis a ocho estolones por tallo vegetativo, y tasa de inducción mayor de estos y tuberización en la segunda mitad de la etapa vegetativa (30 a 50 DDE). Según Trindande et al. (2003), los tubérculos se desarrollan a partir de las células de la médula de la región subapical del estolón, seguidos de la división celular rápida de la mayoría de células del parénquima; las divisiones cesan cuando el tubérculo tiene peso aproximado de 30 a 40 g.
Uno de los factores principales que afectan directamente la inducción de estolones y la formación de los tubérculos es el balance hormonal y de sustancias con efectos reguladores (Van den Berg et al., 1996). Los reguladores de crecimiento vegetal que participan en el crecimiento y desarrollo de la planta son: auxinas, giberelinas, citocininas, brasinosteroides, ácido abscísico, etileno y ácido jasmónico (Davies, 1988; Tanimoto, 2005), y las giberelinas parecen ser las más activas en regular el proceso de la tuberización (Jackson, 1999).
Ortiz y Flórez (2008) detectaron a las fitohormonas trans-zeatina ribósido (ZR), 6-dimetilaminopurina ribósido (iPA) y 6-dimetilaminopurina (iP) en la etapa de tuberización de algunas variedades de papa. Suttle et al. (2011) reportaron que la concentración de ácido tuberónico (TA) disminuye progresivamente en tubérculos semilla con la pérdida de su latencia, e incrementan las concentraciones de ácido jasmónico, N-jasmonoyl-L-isoleusina y ácido abscísico.
Sonnewald y Sonnewald (2014) afirmaron que un prerrequisito para el brotado de tubérculos es que haya suficiente sacarosa, que ABA y etileno funcionan como hormonas inhibidoras de la brotación de yemas, que AG y CK son hormonas promotoras de ruptura de latencia e iniciadores del estolón, y que las auxinas estimulan el desarrollo vascular del brote.
Dutt et al. (2017) describieron la tuberización de la papa como un fenómeno biológico complejo que involucra factores ambientales, genéticos y nutricionales. En él los principales metabolitos que regulan la tuberización de la papa son la proteína StSP6A, los ARN StBEL5 y miR172 y las giberelinas. Sevcikova et al. (2017) concluyeron que las señales predominantes para la tuberización parece que son la disponibilidad de carbohidratos y giberelinas. Los resultados de estudios in vitro e in vivo permitieron asegurar a Teo et al. (2017) que la floración y la formación de tubérculos en papa involucran las señales florígeno y tuberígeno, provenientes de las hojas; de éstas, el complejo activador de tuberígeno incluye proteínas como StSP6A, St 14-3-3s y StFDL1 que regulan la formación de tubérculos.
Kolachevskaya et al. (2017) propusieron un modelo de acción multi-hormonal que controla la formación de tubérculos, en el que las giberelinas inhiben la inducción e iniciación de tubérculos, las citocininas promueven ambos procesos, y las auxinas estimulan el crecimiento y desarrollo posterior de los tubérculos iniciados. Kolachevskaya et al. (2015) reportaron que el gen tms1 se expresa más en tubérculos que en tallos, y que en tubérculos aumenta la síntesis de auxinas durante su formación; además, documentaron la correlación positiva entre la expresión de ese gen y el contenido de la auxina AIA y crecimiento del tubérculo.
El AG3, mezclado con sulfato de zinc, asperjado después del brotado de los tubérculos aumentó 38 % el rendimiento de tubérculo e incrementó (8.37 %) la expresión de proteína cruda (Javanmardi y Rasuli, 2017). Este tratamiento influyó en el crecimiento de estolones y tubérculos, pero no en su inducción.
En la planta medicinal Tulipa edulis, la disponibilidad alta de azúcares solubles es esencial para el desarrollo inicial del estolón (Miao et al., 2016). Esto lo confirmó la actividad alta de sacarosa sintasa (SS) y almidón soluble sintasa (SSS), y la expresión de los genes SS, SSSI y SSSII. Además, las giberelinas y la zeatina ribósido alcanzaron sus máximos contenidos al inicio de la formación de estolones; en cambio, los niveles de AIA y ABA permanecieron altos del inicio a la mitad del periodo, y decrecieron significativamente al final de la formación de estolones.
En tubérculos de Helianthus tuberosus L. la acumulación de biomasa y de azúcar correlacionó positivamente con el contenido endógeno de zeatina y negativamente con el de AG3, AG3/ABA y AIA/ ABA. Las proporciones AG3/ABA y AIA/ABA disminuyeron, los contenidos endógenos de zeatina, y ABA incrementaron durante el crecimiento del tubérculo, y AG3 y AIA decrecieron durante el estudio, excepto en las primeras dos semanas (Li et al., 2017).
Actualmente no se han identificado con certeza las hormonas que regulan la iniciación de estolones en papa. Este aspecto conviene dilucidarse porque la formación de tubérculos depende de la formación de estolones. La detección de este tipo de compuestos químicos, que están en concentraciones bajas incluye purificación, cuantificación e identificación que puede hacerse mediante cromatografía. Entre los métodos más usados para la detección de los reguladores de crecimiento vegetal está la cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés) (Arteca, 1996) con detector UV-VIS (Olivella et al., 2001; Oliveros et al., 2011).
El objetivo de este estudio fue analizar los reguladores del crecimiento vegetal de ápices de estolones en estadios tempranos de desarrollo, de la fase latente a la diferenciación en estolón, mediante HPLC. Al respecto, se postuló que con lo anterior se detectarán los reguladores de crecimiento responsables de la diferenciación de estolón.
Materiales y Métodos
Material vegetal
En el estudio se evaluaron las variedades comerciales de papa Ágata y Fianna. Ellas contrastan en hábito de crecimiento y cantidad de tubérculos. Los tubérculos semilla, sanos y en apariencia libres de patógenos y de plagas, de ambas variedades se obtuvieron del municipio de Zaragoza, Puebla, México.
Las semillas se sembraron en bolsas de polietileno negro de 4 L de capacidad y se mantuvieron en un invernadero, con cubierta plástica y malla anti-áfidos para el control de plagas y enfermedades, hasta la producción. El sustrato fue perlita y a 10 cm de profundidad se depositaron tres tubérculos. Las bolsas se mantuvieron en una cámara con ambiente controlado (GCA® modelo Freas 815; EE.UU.) a 20±1 °C, 50 % de humedad relativa y en completa oscuridad. Diez días después de la siembra (dds) se muestrearon los tubérculos con brotes vegetativos (Figura 1): Estos se colocaron en hielera (6±1 °C) para su identificación en laboratorio. El muestreo de brotes continuó hasta 30 dds. Los tubérculos madre se lavaron tres veces con agua destilada para eliminar las partículas de sustrato. De cada uno de esos tubérculos se extrajeron los brotes vegetativos, con bisturí de hoja 11 y un microscopio estereoscópico (OLYMPUS modelo SZ-CTV; EE.UU.).
Figura 1 A) Tubérculo semilla con brotes vegetativos de S. tuberosum L. var. Ágata 15 días después de la siembra; B) Brote vegetativo; y C) Corte longitudinal del tallo de un brote vegetativo teñido con fuscina ácida al 0.05 % (microscopio estereoscópico; Carl Zeiss® SZ60). CA: catáfilo que cubre a la yema del estolón (Y), RA: raíces adventicias y TS: tallo subterráneo. La orientación del ápice de crecimiento lo indica la flecha negra.
Las muestras de yemas en cuatro estadios del desarrollo del estolón se extrajeron de los brotes de la zona media basal del tallo con microscopio estereoscópico (Carl Zeiss modelo SZ60®; Alemania): E1) yema de estolón en etapa inicial, aplanada y latente, E2) yema de estolón en etapa hinchada y aún latente, E3) yema brotada de estolón, también llamada rudimento estolonífero, en la que el estolón inicia su alargamiento y desarrollo y E4) estolón en etapa temprana de su formación.
Doscientos mg de las yemas (con tejido no meristemático mínimo) se colocaron en tubos Eppendorf de 2 mL. Esa cantidad se obtuvo de 50 yemas de cada variedad y en cada evento de desarrollo. Los tubos con las yemas se mantuvieron a -20 °C (en congelador; Puffer Hubbard® modelo IUF1821; EE.UU.) hasta que los tejidos se evaluaron.
Las etapas E1, E2, E3 y E4 se extrajeron mediante cortes (con navaja metálica; Guillette®) anatómicos longitudinales de yemas axilares de tallos subterráneos de ambas variedades, Ágata y Fianna, seguida de tinción con fuscina ácida (0.05 %).
Extracción de reguladores de crecimiento (fitohormonas)
Antes de la extracción las muestras se deshidrataron 12 horas en una liofilizadora (Labconco® modelo FreeZone 4.5; EE.UU.). De cada tipo de yema liofilizada se colocaron 10 mg en un tubo plástico y se le agregaron 500 μL de solución de extracción, según el protocolo propuesto por Pan (2010). La solución de extracción contenía 2-propanol grado HPLC (J. T. Baker®), agua desionizada y HCl concentrado grado reactivo (J. T. Baker®), en proporción 2:1:0.002. Los tubos se agitaron 30 min en vórtex (Scientific Industries, modelo G560®; EE.UU.) a 100 rpm y refrigeración (6±1 °C). Después, a cada tubo se le agregaron 1000 μL de diclorometano grado HPLC (J. T. Baker®), se agitó 30 min a 100 rpm y centrifugó a 716 g por 10 min (Hettich®, modelo EBA 21; EE.UU.). Luego, la fase orgánica (la inferior) se extrajo con una micropipeta Eppendorf® (EE.UU.) y se depositó en un tubo limpio. El disolvente se evaporó totalmente, con corriente de gas nitrógeno (grado alta pureza; Infra®) y se agregaron 500 μL de metanol filtrado grado HPLC (J.T. Baker®) al residuo de cada tubo. Los tubos se almacenaron hasta el análisis cromatográfico.
Preparación de soluciones de estándares analíticos
Los estándares cuantitativos de fitohormona fueron ácido giberélico 3 (AG3, pureza 90 %), ácido indol-3-acético (AIA, pureza 98 %) pureza 98 %), (±)-ácido abscísico (ABA, pureza (98.5 %), cinetina (KIN, pureza ≤98 %), 6-(γ,γ -dimetilalilamino)-purina (2-iP, y 6-bencilaminopurina (BAP, pureza ≥99 %) (Sigma-Aldrich®). De ellos se prepararon diluciones con 0.01, 0.1 y 1.0 mg por mL de metanol grado HPLC (J.T. Baker®).
Análisis cromatográfico
El cromatógrafo para el estudio (Agilent, modelo 1100®) estuvo equipado con un detector UV-Vis y una columna Agilent® (modelo 866953-906 Rx/SB-C8 de 4.6x75 mm). La fase móvil fue la mezcla de las soluciones A y B (80:20). La solución A contenía acetonitrilo grado HPLC (J. T. Baker®) y ácido trifluoroacético grado espectrofotométrico (Sigma-Aldrich®) en proporción 1:0.001; la solución B contenía agua desionizada y ácido trifluoroacético grado espectrofotométrico (Sigma-Aldrich®) en proporción 1:0.001. Ambas soluciones se filtraron con membranas Millipore® tipo HV de 0.45 μm (protocolo adaptado de Pan et al., 2010)
El flujo de la fase móvil fue de 2 mL min-1. Con un inyector manual (Rheodyne®, modelo 755) se inyectaron 20 μL de cada extracto en triplicado. Las lecturas se hicieron en tres longitudes de onda y se eligió la de absorción máxima. Ellas fueron: 206 nm para giberelinas, 254 nm para auxinas y ácido abscísico (Harborne, 1994), y 280 nm para citocininas. La respuesta se expresó en mili-unidades de absorbancia por segundo (mAU·s) (Ortiz y Flórez, 2008). La identidad de las fracciones se determinó por comparación con los tiempos de retención y la longitud de onda de máxima absorción de los estándares. Además, las curvas de calibración se obtuvieron con los estándares.
Resultados y Discusión
Identificación y clasificación de yemas de estolones
La pérdida de latencia de la yema del estolón y su brotado se detectó en la etapa E3 (Figura 2).
Figura 2 Cortes longitudinales de yemas de estolónes axilares de tallos subterráneos de S. tuberosum L. var. Ágata, teñidos con fucsina ácida (0.05 %), vistos con microscopio (10X, Carl Zeiss®). E1) Yema de estolón en etapa inicial, aplanada y latente, con restos del catáfilo (CA) que cubre a la yema del estolón (Y), raíces adventicias (RA); el eje del tallo subterráneo y la orientación del ápice de crecimiento los señala la flecha. E2) Yema de estolón en etapa hinchada pero aún latente. E3) Yema brotada de estolón o rudimento estolonífero (RE) en etapa posterior a la pérdida de latencia e iniciando su alargamiento y desarrollo. E4) Estolón (E) en etapa temprana de desarrollo.
El método de extracción y análisis estuvo diseñado para detectar y cuantificar hormonas; por lo que, en cada longitud de onda las fracciones correspondieron a compuestos con características físicas, químicas (tamaño y carga) similares a los estándares (Figura 3 y Cuadro 1). En este estudio ninguna fracción cromatográfica de ninguna longitud de onda se traslapó con otra; por lo que, cada pico, de las ocho fracciones que se obtuvieron, se consideró independiente (Cuadro 2).
Figura 3 Cromatogramas de los estándares analíticos. A) AG3 a 206 nm. B) AIA, ABA, AIB y ANA a 254 nm. C) Kin, 2-iP y BAP a 280 nm obtenidos por HPLC.
Cuadro 1 Tiempo de retención y longitudes de onda de absorbancia máxima de estándares cuantitativos de fitohormonas.
| Compuesto | Tiempo de retención promedio (min) | Desviación estándar (min) | Longitud de onda (nm) |
| Cinetina (Kin, 6-furfurilaminopurina) | 0.784 | 0.0095 | 280 |
| 6-(γ,γ-Dimetilalilamino)-purina (2Ip) | 1.133 | 0.0410 | 280 |
| Ácido giberélico 3 (AG3) | 1.337 | 0.0123 | 206 |
| 6-Bencilaminopurina (BAP) | 1.407 | 0.0069 | 280 |
| Ácido indol-3-acético (AIA) | 2.977 | 0.0012 | 254 |
| (±)-Ácido abscísico (ABA) | 5.638 | 0.0052 | 254 |
Cuadro 2 Tiempos de retención (±desviación estándar) y longitud de onda de las fracciones de las muestras de S. tuberosum L. de las variedades Ágata y Fianna.
| Fracción | Tiempo de retención promedio (min) | Longitud de onda (nm) |
| 1 | 0.556±0.0032 | 254 |
| 2 | 0.628±0.0058 | 280 |
| 3 | 0.859±0.0015 | 280 |
| 4 | 1.001±0.0010 | 280 |
| 5 | 1.580±0.0177 | 206 |
| 6 | 1.713±0.0132 | 206 |
| 7 | 2.199±0.0257 | 206 |
| 8 | 14.914±0.1693 | 254 |
Las fracciones F-1 y F-8 coincidieron con las auxinas y su absorción fue máxima a 254 nm. Las fracciones F-2, F-3 y F-4 coincidieron con las citocininas, cuya máxima absorción ocurrió a 280 nm. Las fracciones F-5, F-6 y F-7 coincidieron con las giberelinas, por su absorción máxima a 206 nm (Cuadro 2).
Las ocho fracciones cambiaron su concentración entre los eventos del desarrollo del estolón de las dos variedades (Figura 4). Cuatro de las ocho fracciones parecieron estar directamente asociadas con el brotado de estolones al pasar de E2 a E3, donde E3 es el evento clave en la formación de tubérculos. Las fracciones involucradas fueron F-3, F-4, F-7 y F-8.
Figura 4 Cambios de concentración (±desviaciones estándar) en las fracciones extraídas de estolones en cuatro etapas de desarrollo. Variedades Ágata (---) y Fianna (—).
En ambas variedades la fracción F-7, de tipo giberelina, se redujo casi totalmente en E3 (a menos de 1000 mAU·s) y representó 17 % del contenido en la yema latente E1 (Figura 4); F-8, de tipo auxina, se expresó en E1 y E2 y no se detectó en E3. Esto permite sugerir que ambos reguladores del crecimiento (F-7 y F-8) actúan como inhibidores del brotado de yemas de estolones en las variedades Ágata y Fianna, y posiblemente en otras variedades de papa.
Las hormonas detectables durante el desarrollo de la formación de estolones de H. tuberosus L. fueron AG3 y zeatina. La primera aumentó su contenido inicial y disminuyó continuamente en etapas de inducción y crecimiento de tubérculos. La segunda incrementó durante todas las etapas, por lo que su contenido menor fue durante la iniciación de estolones (Li et al., 2017).
De acuerdo con Taiz y Zeiger (2002), niveles bajos de auxina promueven el desarrollo de una yema vegetativa, y el incremento en su concentración inhibe la brotación; en contraste, la giberelina AG1 en concentraciones bajas favorece el alargamiento de los tallos y las concentraciones altas tienden a disminuir drásticamente su tasa de crecimiento.
El aumento del número de brotes vegetativos de papa puede lograrse en menos tiempo con aplicaciones de AG3 en bajas concentraciones, lo que evidencia el papel de las giberelinas en el desarrollo de la papa (Alexopoulos et al., 2007; Salimi et al., 2010). Abdala et al. (2000) demostraron, mediante la comparación de los órganos de papa, que las giberelinas influyen en el desarrollo del estolón en etapas posteriores a la brotación. Ellos obtuvieron las concentraciones mayores de jasmonatos, AG1 y AG3 en los estolones ya brotados y en pleno desarrollo, y los niveles fueron mayores durante la fase de tuberización.
Contrario a lo reportado por otros investigadores, en nuestro estudio la fracción de tipo giberelina (F-7) participó como represora en el brotado de las yemas de estolón (Figura 4). Esta fracción F-7 no correspondió al AG3, pues el estándar de esta hormona mostró un pico con tiempo de retención diferente al de F-7 (Cuadro 2 y Figura 4).
En contraste, solamente en la var. Fianna las fracciones F-3 y F-4, del tipo de citocinina, no estuvieron en los eventos de desarrollo E1 y E2, pero sí se expresaron en E3 y E4. Esto puede indicar que las dos fracciones promueven la brotación de estolones solo en algunos genotipos. Dado que en las etapas E3 y E4 de la var. Ágata no aparecieron las F-3 y F-4, cuando el estolón rompió la latencia y originó un estolón, es probable que en esta variedad estas citocininas sean innecesarias para inducir la brotación de estolones. Estos resultados coinciden con los de Ortiz y Flórez (2008); ellos señalaron que la interacción genotipo(citocininas no fue significativa entre las variedades de papa de su estudio, después de detectar y cuantificar diferentes tipos y concentraciones de hormonas.
Lo anterior permite inferir que el brotado de estolones, en ambas variedades de papa ocurre cuando la giberelina F-7 se reduce y la auxina F-8 está ausente, pues estos dos reguladores del crecimiento inhiben o reprimen la brotación de estolones. También puede deducirse que la acción probable de citocininas en la brotación de estolones la requieren solo algunos genotipos de papa, y que la interacción citocininas(genotipo está asociada con los hábitos de expresión de estolones. Este sería el caso de la var. Ágata, en la que la inducción de estolones fue precoz y abundante respecto a Fianna; pues, en esta última ese proceso ocurrió paulatinamente y en una etapa tardía.
Los resultados del presente estudio permiten avanzar en el conocimiento del proceso de iniciación de estolones de papa; pero, más estudios son necesarios para conocer la estructura química de los compuestos en las fracciones descritas en los párrafos anteriores, y también es necesario efectuar bioensayos con esos compuestos para establecer su efecto.
Conclusiones
De las ocho fracciones descritas, las identificadas como F-7 (tipo giberelina) y F-8 (tipo auxina) son inhibidoras de la formación de estolones. Para que la yema brote y forme un estolón es necesario que en el ápice de la yema se reduzca la concentración de F-7 y que la fracción F-8 sea indetectable. Las fracciones F-3 y F-4 (tipo citocinina) regulan la diferenciación del estolón en interacción con el genotipo de papa, ya que estas fracciones se detectaron solo en la var. Fianna.
