Localización del experimento

El experimento se realizó en un invernadero tipo túnel con cubierta plástica de color blanco, que proporcionó 30 % de sombreo, y con malla antiáfidos en las paredes laterales, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, México (18° 58’ 51’’ LN y 99° 13’ 55’’ LO, a 1,866 m s. n. m.). Las condiciones ambientales en el invernadero se monitorearon con un datalogger modelo U12 (Hobo®, Massachusetts, EUA): temperatura promedio de 25 °C, humedad relativa promedio de 55 % y una media de radiación solar de 514 µmol·m^-2·s^-1.

Tratamientos evaluados

Los tratamientos evaluados fueron: 1) sin inocular microorganismo (testigo), 2) Rhizophagus intraradices, 3) Funneliformis mosseae, 4) consorcio de HMA Cerro del Metate, 5) Azospirillum brasilense, 6) R. intraradices + A. brasilense y 7) sin inocular microorganismo e irrigado con solución nutritiva de Steiner al 100 % de concentración.

Los tratamientos del 1 al 6 se regaron diariamente de forma manual con 0.5 L de solución nutritiva de ^{Steiner (Steiner, 1984}) al 50 % durante los primeros 21 días después del transplante (ddt), y se regaron con 1.5 L de solución nutritiva durante el periodo de 22 a 50 ddt, momento en que se realizó la cosecha de plantas. El tratamiento 7 se usó para comparar el efecto de la concentración nutritiva y las inoculaciones con los microorganismos sobre el crecimiento de las plantas.

Unidad y diseño experimental

La unidad experimental fue una maceta que contenía una planta de albahaca. Se utilizó un diseño completamente al azar con seis repeticiones.

Material vegetal, microbiológico y siembra de las plantas de albahaca

Se utilizó el cultivar de albahaca ‘Sweet Nufar’ (SunLine AG Inc, EUA). Las semillas se sembraron el 29 de marzo de 2019 en bandejas de poliestireno de 200 cavidades con sustrato de germinación Sunshine^® Mix 3, previamente esterilizado en una autoclave (cv 300, AESA) durante 15 min a 120 °C (0.98 a 1.05 kg·cm^-2 de presión de vapor), de acuerdo con la metodología descrita por ^{Zulueta-Rodríguez et al. (2016}). La cepa Cd de Azospirullum brasilense fue proporcionada por el Centro de Biotecnología de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, y los HMA, por el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ). El inóculo de Funneliformis mosseae se aisló del consorcio Cerro del Metate, la cepa de Rizhophagus intraradices se aisló del producto Micorriza INIFAP, y el consorcio Cerro del Metate se aisló de la montaña Cerro del Metate, ubicada en Michoacán, a partir de la rizosfera de Agave cupreata (^{Trinidad-Cruz, Quiñones-Aguilar, Hernández-Cuevas, López-Pérez, & Rincón-Enríquez, 2017}).

Inoculación de las plantas de albahaca con los hongos micorrícicos arbusculares

El trasplante se realizó el 4 de mayo de 2019 (38 días después de la siembra [dds]). Las plántulas de albahaca se colocaron en macetas de plástico con capacidad de 5 L, las cuales contenían tezontle con granulometría de 1 a 5 mm de diámetro, previamente esterilizado en autoclave durante 15 min a 120 °C (0.98 a 1.05 kg·cm^-2 de presión de vapor). Los tratamientos se establecieron al momento del trasplante, los HMA se aplicaron en dosis de 150 esporas por planta directamente a la raíz desnuda. Los hongos se encontraban en arena de río como medio de inoculación.

Inoculación de las plantas de albahaca con A. brasilense

Las plantas de albahaca se inocularon con la cepa Cd de A. brasilense a una concentración de 1.04 x 10⁹ unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de sustrato seco (^{Bashan, 1986}). El conteo de las UFC se efectuó de acuerdo con la metodología descrita por ^{Peña-Cortés, Peña-Cortés, y Gonzalo-Moreno (2011}). Las macetas tuvieron 3 kg de tezontle, y las inoculaciones se realizaron cada dos semanas a partir del 14 de mayo de 2019 hasta la cosecha, a los 50 ddt.

Variables de crecimiento vegetal

La cosecha se realizó a los 50 ddt y se determinaron las siguientes variables: altura de planta (AP, cm), diámetro basal de tallo (DT, mm), peso de biomasa aérea fresca (PBF, g), peso de biomasa aérea seca (PBS, g) y área foliar (AF, cm²).

Disminución de crecimiento en albahaca por efecto de la reducción en la concentración de nutrientes de la solución nutritiva

Se determinó la reducción porcentual de los caracteres altura de planta, peso de biomasa fresca y área foliar, al disminuir la concentración de la solución nutritiva de 100 % (tratamiento 7) a 50 % (tratamientos 1 a 6) mediante la siguiente fórmula:

donde Ȳ ₇ es la media del tratamiento siete (100 % de concentración de solución nutritiva) y Y _ij es la observación del i-ésimo tratamiento en su j-ésima repetición (50 % de concentración de solución nutritiva).

Posteriormente, se realizaron comparaciones múltiples de medias de Tukey (P ≤ 0.05).

Concentración de macronutrientes

La biomasa seca aérea (hojas y tallos) de las seis repeticiones se molió con un molino eléctrico (004108-013-000, Osterizer®, EUA). Posteriormente, se determinó la concentración de N (por el método microkjeldahl), P (por colorimetría), K (por flamometría), Ca y Mg (ambos por espectrofotometría de absorción atómica) (^{Cruz-Álvarez et al., 2020}).

Colonización micorrícica y número de esporas

Como indicador de eficiencia y funcionalidad de los inóculos en las plantas de albahaca, se determinó el porcentaje de colonización micorrícica (PCM) por estructura fúngica a los 50 ddt. Para ello, se recolectaron raíces de cada repetición al finalizar el experimento, las cuales se fijaron en FAA (formaldehído: ácido acético: etanol, 2:1:10:7); posteriormente, las raíces se clarearon y tiñeron (^{Phillips & Hayman, 1970}). El porcentaje de colonización micorrícica se evaluó en 30 segmentos de raíz de 1 cm, de acuerdo con el método descrito por ^{McGonigle, Miller, Evans, Fairchild, y Swan (1990}), y con un microscopio (modelo k7, Zeiss, Alemania) se determinó el PCM.

El número de esporas en 100 g de suelo seco se determinó a partir de la extracción realizada por el método de tamizado húmedo y decantación (^{Gerdemann & Nicolson, 1963}). El conteo de esporas se realizó de manera visual con un microscopio estereoscópico (VE-S5C, Velab™). El tamizado húmedo se observó en una caja de Petri cuadriculada (90 mm) y se registró el número de esporas.

Análisis estadístico

Los datos expresados en porcentaje se transformaron con la función raíz cuadrada del arcoseno. La normalidad y homogeneidad de varianza se comprobaron mediante la prueba de Levene y Kolmogorov-Smirnov. Posteriormente, se realizó el análisis de varianza y las comparaciones múltiples de medias de Tukey (P ≤ 0.05) mediante el programa Statistical Analysis System versión 9.1 (^{SAS Institute Inc., 2004}).

Crecimiento de albahaca inoculada con HMA y A. brasilense

Al considerar los tratamientos con 50 % de solución nutritiva (tratamientos 1 a 6) y compararlos con el testigo (sin microorganismos) (Cuadro 1), solo A. brasilense mejoró significativamente el desarrollo de las plantas de albahaca ‘Sweet Nufar’, al incrementar la AP, el DT, el PBF, el PBS y el AF (P ≤ 0.05), en un 15, 18, 28, 27 y 24 %, respectivamente. La aplicación de Rizhophagus intraradices y R. intraradices + A. brasilense incrementaron el PBF y el AF (P ≤ 0.05); en tanto que Funneliformis mosseae solo mejoró el DT y el AF (P ≤ 0.05). El consorcio Cerro del Mate no mostró ventajas sobre el testigo sin microorganismos.

^{Cruz-Romero, Barrios-Díaz, Rodríguez-Mendoza, Espinoza-Victoria, y Tirado-Torres (2016}) reportaron efectos similares sobre el crecimiento al inocular plantas de brócoli con A. brasilense; los incrementos fueron de 11 % en DT, 38 % en AF y 29 % en PBS. Asimismo, se ha documentado que A. brasilense incrementa la asimilación de nitrógeno en especies como maíz y trigo (^{Mariani-Zeffa et al., 2019}; ^{Shintate-Galindo et al., 2020}), lo cual favorece el desarrollo de las plantas, incluso cuando los niveles de fertilización son limitados. Lo anterior coincide con los resultados del presente estudio, ya que se observó un incremento de 15 % en la concentración de nitrógeno en los tejidos de las plantas inoculadas con A. brasilense con respecto al testigo (Cuadro 2). Al respecto, ^{Pereira-Coelho et al. (2021}) mencionan que A. brasilense forma simbiosis con algunas plantas e incrementa su capacidad de asimilación de agua y nutrientes, lo cual mejora el crecimiento y el rendimiento de los cultivos agrícolas.

La inoculación de R. intraradices mejoró en 7 % el PBF y 22 % el AF, mientras que F. mosseae incrementó el DT 12 % y 17 % el AF en comparación con el testigo (Cuadro 1). Efectos favorables por el uso de HMA también se han reportado en tomate (^{Bona et al., 2017}) y en haba (^{Abd-Alla, El-Enany, Nafady, Khalaf, & Morsy, 2014}). Esto implica que las especies R. intraradices y F. mosseae también son una opción para mejorar el desarrollo del cultivo de albahaca, aunque su efecto es menor que el logrado con A. brasilense.

La combinación entre R. intraradices + A. brasilense incrementó 24 % el PBF y 24 % el AF en comparación con el testigo. Esto coincide con lo reportado por ^{Mujica-Pérez, Medina-Carmona, y Rodríguez-Guerra (2017}), quienes señalan que la inoculación de bacterias promotoras de crecimiento en combinación con HMA genera un efecto sinérgico que se refleja en un mejor desarrollo de las plantas.

Crecimiento en albahaca por efecto de la reducción en la concentración de la solución nutritiva

Al comparar el efecto de la concentración nutritiva (100 y 50 %) en el desarrollo del cultivo, la inoculación con A. brasilense tuvo la menor disminución en el crecimiento (P ≤ 0.05) de albahaca por efecto de la reducción de nutrientes en las variables AP, PBF y AF; no obstante, su respuesta fue similar a la disminución en el crecimiento con la inoculación de HMA y la combinación de R. intraradices + A. brasilense (Figura 1). Las mayores disminuciones del desarrollo ocurrieron cuando no se inoculó algún microorganismo benéfico. De esta manera, las plantas sin microorganismos tuvieron una disminución de 15.6 % en AP, 49.9 % en PBF y 46.6 % en AF. Lo anterior indica que la inoculación con rizobacterias promotoras de crecimiento tiene la capacidad de mejorar el desarrollo de plantas de albahaca e incrementar la AP y el PBF, variables determinantes en el crecimiento de dicho cultivo (^{Chiquito-Contreras et al., 2018}).

Figura 1 Disminución de crecimiento en albahaca ‘Sweet Nufar’ cultivada con solución nutritiva al 50 % en comparación con el tratamiento al 100 % de solución nutritiva, 50 días después del trasplante. Cada barra representa el promedio de seis repeticiones ± error estándar. R.+ A.: R. intraradices + A. brasilense. Barras con la misma letra entre cada variable respuesta no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

Concentración de macronutrientes

El uso de microorganismos benéficos mejoró la concentración de nutrientes en el tejido de las plantas de albahaca, principalmente de N y K (P ≤ 0.05), respecto del testigo sin microorganismos (Cuadro 2). La concentración de N incrementó (P ≤ 0.05) en las plantas inoculadas con R. intraradices (17 %), A. brasilense (16 %) y con la combinación de ambos microorganismos (15 %). En cuanto al P, solo A. brasilense incrementó (P ≤ 0.05) en 11 % su concentración en los tejidos de las plantas, mientras que la concentración de K no tuvo modificaciones significativas por efecto de la inoculación de microorganismos. Las mayores concentraciones de Mg ocurrieron con la inoculación de R. intraradices y F. mosseae, con incrementos significativos (P ≤ 0.05) de 18 y 20 %, respectivamente, en comparación con el testigo. Se ha reportado que el uso de microorganismos benéficos como rizobacterias y HMA permiten a las plantas absorber cantidades mayores de nutrientes esenciales (^{Díaz-Hernández et al., 2018}). En el caso de la concentración de Ca, no hubo efectos significativos por la inoculación de microorganismos.

Colonización micorrícica y número de esporas de HMA

En la Figura 2A se muestra un corte longitudinal de raíz del testigo, donde no se observó ninguna estructura de los HMA. En la colonización de los hongos micorrícicos R. intraradices (Figura 2B), F. mosseae (Figura 2C) y consorcio Cerro del Metate (Figura 2D) en raíces de albahaca se observó la presencia de algunas estructuras características de los HMA, como hifas intrarradicales, vesículas y arbúsculos (Figuras 2E, 2F y 2G). La funcionalidad de las micorrizas sobre la nutrición de la planta se asocia con el grado de madurez de la micorriza y con las condiciones en las que se desarrolle (^{Lara-Pérez et al., 2014}).

Figura 2 Secciones longitudinales de raíces de albahaca ‘Sweet Nufar’ colonizadas con hongos micorrícicos arbusculares (HMA): A) testigo (cv = cilindro vascular), B) Rhizopagus intraradices, C) Funneliformis mosseae, D) consorcio de HMA Cerro del Metate, E) hifas intrarradicales (hi), F) vesículas (v), y G) arbúsculos (a) y base del arbúsculo (ba). 

Los inóculos de HMA colonizaron las raíces de las plantas, ya que los porcentajes de colonización micorrícica por hifas fueron los más altos (35.9 - 37.7 %), seguidos por los arbúsculos (13.0 - 14.8 %); sin embargo, no hubo diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre ellos (Figura 3). En cuanto a las vesículas, el intervalo fue de 4 a 8 %, y se encontraron diferencias (P ≤ 0.05) entre R. intraradices y el resto de los HMA. Estos resultados difieren con los reportados por ^{Elhindi, El-Din, y Elgorban (2017}), quienes encontraron un PCM entre 60.6 y 71.1 % en albahaca ‘Nano Compatt’; en tanto que Zulueta et al. (2016) reportaron PCM de entre 75 y 87 % en albahaca ‘Nufar’. Estas diferencias se pueden atribuir a las condiciones de cultivo, al uso de diferentes sustratos, a los HMA inoculados y al tiempo de exposición de las plantas al inóculo, ya que en esos estudios la duración de los experimentos fue de 70 y 120 días, respectivamente.

Figura 3 Colonización micorrícica en raíces de albahaca ‘Sweet Nufar’ inoculada con hongos micorrícicos arbusculares (HMA) a 50 días después del trasplante. Cada barra representa el promedio de seis repeticiones ± error estándar. R. + A.: Rizhophagus intraradices + Azospirillum brasilense. Barras con la misma letra entre cada variable respuesta no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05). 

Con la coinoculación de R. intraradices + A. brasilense no hubo un efecto positivo sobre el PCM del HMA, lo cual contrasta con lo reportado por ^{Meng et al. (2015}) en maíz y soya, ya que la interacción de HMA y bacterias promotoras de crecimiento tiende a incrementar la población de ambos individuos en la rizosfera y, en consecuencia, se pueden presentar incrementos en el PCM. Además, se confirmó que el testigo y el tratamiento con A. brasilense presentaron 0 % de colonización, ya que estos tratamientos no contenían HMA.

Otro indicador para determinar la eficiencia micorrícica es el número de esporas presentes en el sustrato donde se desarrollaron las plantas. A los 50 ddt, no se encontraron diferencias (P ≤ 0.05) en el número de esporas, donde los valores oscilaron entre 240 y 272 esporas por cada 100 g de sustrato. Estos valores se consideran bajos comparados con los reportados por ^{Quiñones-Aguilar, López-Pérez, Hernández-Acosta, Ferrera-Cerrato, y Rincón-Enríquez (2014}), quienes en el cultivo de papaya encontraron de 1,000 a 4,500 esporas después de 120 días de inoculación en sustratos orgánicos.

Resulta importante señalar que la esporulación de los HMA es un mecanismo de supervivencia (^{Johnson, 1984}), el cual podría ser influenciado por el tipo de sustrato. ^{Corbera, Paneque, Calaña, y Morales (2008}) señalan que las propiedades físicas y biológicas del sustrato son determinantes en el buen desarrollo de los HMA, así como la edad de la planta (^{Agüero-Fernández et al., 2016}). En el presente estudio, se utilizó tezontle como medio de crecimiento y, debido a que es un sustrato inerte, pudo haber interferido en el proceso de esporulación; no obstante, esa misma característica inerte garantizó que los resultados obtenidos se deben al efecto de los microorganismos y a su interacción con las plantas de albahaca.