Introducción

En el estado de Oaxaca, México, el Agave angustifolia Haw. ocupa 80 % de las 10 mil ha cultivadas con agaves. De esta especie se obtienen fibras y azúcares, y es materia prima para elaborar mezcal ^{(Jarquín-Rosales et al., 2022)}. Las plantaciones de A. angustifolia se establecen con plantas obtenidas de propágulos vegetativos, como vástagos de rizomas y bulbilos de inflorescencia ^{(Enríquez, 2008}; ^{Garnica-García et al., 2020}; ^{Sánchez et al., 2020)}. También se han desarrollado protocolos para la micropropagación de A. angustifolia ^{(Arzate-Fernández et al., 2016}; ^{Enríquez et al., 2005}; ²⁰¹⁸⁾, así como en A. tequilana ^{(Valenzuela-Sánchez et al., 2006)}, A. fourcroydes ^{(Abreu et al., 2007}; ^{Garriga et al., 2010)}, A. sisalana ^{(Nikam et al., 2003)} y A. potatorum ^{(Bautista-Castellanos et al., 2020)}.

En los esquemas de micropropagación, las plantas son transferidas en la etapa de aclimatación de las condiciones in vitro a contenedores con sustrato y ambiente de invernadero, para que éstas desarrollen características morfológicas y fisiológicas que les permitan adaptarse al ambiente ex vitro y reinicien su crecimiento. Durante la aclimatación se controlan condiciones ambientales como: 1) sustrato, que debe tener buen drenaje y retención de humedad para permitir el desarrollo de raíces eficientes para la absorción de nutrientes y agua ^{(Sánchez et al., 2020)}; 2) humedad relativa, que debe ser alta al inicio de la aclimatación y en el transcurso de 90 días debe reducirse en forma gradual; 3) temperatura, en el intervalo de 15 a 28 ºC; 4) radiación solar, que al inicio de la aclimatación debe ser baja (300-400 µmol fotón m^-2 s^-1) y en el transcurso de la misma se incrementa gradualmente ^{(Enríquez-del Valle et al., 2016)}; 5) abastecimiento nutrimental, en plantas de A. angustifolia micropropagadas se ha determinado que la cantidad de nutrimentos proporcionados mediante fertirriego debe ser de acuerdo con el sustrato utilizado ^{(Enríquez, 2018}; ^{Enríquez-de Valle et al., 2009}; ²⁰²¹⁾. Dado que los ambientes in vitro y ex vitro son contrastantes, debe haber una adecuada transición de las condiciones que predominan in vitro a las del invernadero o campo ^{(Enríquez-del Valle et al., 2021)}.

^{Cruz et al. (2017)} observaron que las plantas de Agave americana var. oaxacensis micropropagadas tenían hojas delgadas de consistencia herbácea y flácidas al inicio de su aclimatación, y durante las primeras tres a cuatro semanas de este periodo no crecieron, e incluso disminuyó la cantidad de hojas, debido a la senescencia gradual y muerte de las hojas que la planta había formado in vitro. Las hojas fueron reemplazadas por otras nuevas, más grandes en longitud, ancho y grosor, de consistencia herbácea pero más rígidas y características relacionadas con su adaptación. En las hojas que murieron no ocurrieron los cambios morfológicos y fisiológicos que implica la adaptación al ambiente ex vitro.

En Musa ^{(Da Silva et al., 2005)} y Agave americana var. oaxacensis ^{(Miguel et al., 2013)}, los brotes regenerados fueron enraizados in vitro en presencia de radiación solar disminuida al 50 % mediante malla sombra, para su pre-aclimatación. Cuando las plantas se extrajeron del cultivo in vitro y se establecieron en sustrato e invernadero para su aclimatación, mayor número de éstas sobrevivió; la mayor parte de sus hojas fueron menos propensas a senescencia y tuvieron mayor actividad fotosintética y cutícula cerosa.

El objetivo de este estudio fue determinar la influencia del ambiente de incubación y del sustrato utilizado para la aclimatación de las plantas de A. angustifolia obtenidas in vitro, sobre su supervivencia, características morfológicas y crecimiento.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Las primeras plantas micropropagadas de Agave angustifolia se obtuvieron en 1986, éstas se transfirieron a contenedores con sustrato y aclimataron durante 60 días en invernadero, después estuvieron un año en vivero y luego se establecieron en campo ^{(Enríquez, 2008)}. La micropropagación de Agave angustifolia se ha realizado mediante embriogénesis somática ^{(Arzate-Fernández et al., 2016)}, en Agave potatorum se indujo la formación de brotes adventicios en medios de cultivo semisólidos ^{(Bautista-Castellanos et al., 2020)}; en A. tequilana, se indujo la embriogénesis somática en medios de cultivo líquidos utilizando sistemas de inmersión temporal ^{(Portillo y Santacruz-Ruvalcaba, 2006)}; lo anterior muestra que es posible aplicar innovaciones en las diversas etapas de micropropagación para mejorar la eficiencia de propagación, supervivencia y calidad de las plantas.

Las plantas de agave obtenidas de cultivos in vitro incubados en el laboratorio y las plantas obtenidas de cultivos in vitro incubados en una estructura de sombra parcial, al inicio de la aclimatación mostraban características morfológicas significativamente diferentes (t, P ≤ 0.05), 7.0 y 5.9 cm de altura, 3.0 y 2.5 raíces, 2.3 y 2.1 hojas desplegadas, respectivamente. A los 65 días de aclimatación, del 86.6 a 100 % de las plantas provenientes de los cultivos in vitro incubados en laboratorio con iluminación LED (Figura 1A) y de 80 a 100 % de las plantas provenientes de cultivos in vitro incubados en una estructura de sombra parcial (Figura 1B) se aclimataron al ambiente ex vitro (Figura 1C).

Figura 1 Propagación in vitro de Agave angustifolia. A) Cultivos in vitro incubados en laboratorio con iluminación LED, B) cultivos in vitro incubados en una estructura con radiación solar disminuida con malla sombra, C) plantas micropropagadas establecidas en diversos sustratos, aclimatadas durante 95 días dentro del vivero. 

Los análisis de varianza indicaron que el ambiente de incubación (AI) del que provenían las plantas tuvo efecto significativo sobre la altura de la planta, mientras que el tipo de sustrato afectó significativamente el número de hojas, altura de la planta y ancho de la hoja. La interacción entre el ambiente de incubación in vitro y sustrato de aclimatación tuvo efecto significativo sobre el número de hojas (Cuadro 1). Todas las plantas provenientes de cultivos in vitro incubados en laboratorio o en una estructura de sombra parcial, que se transfirieron al sustrato 50T:50P, se adaptaron a las condiciones ex vitro (Cuadro 2). Las plantas obtenidas de cultivos in vitro incubados en una estructura de sombra parcial, establecidas en el sustrato 25T:75P, sobrevivieron en un 80 % después de 65 días de aclimatación. Las plantas de los diversos tratamientos tuvieron de 4.0 a 5.1 hojas, de 8.6 a 11.1 mm de ancho de la hoja y de 11.0 a 14.6 cm de altura de la planta (Cuadro 2).

A los 95 días de aclimatación en vivero (expuestas a mayor irradiancia), el ambiente de incubación del que provenían las plantas tuvo efectos altamente significativos en el número de hojas, altura de la planta y longitud de la raíz. El factor sustratos afectó significativamente la altura de la planta, diámetro del tallo, volumen de la raíz, peso seco de raíz, peso seco de la parte aérea y longitud de la raíz. La interacción de los ambientes de incubación y los sustratos mostró efecto significativo en la longitud de raíz, volumen de raíz, área foliar y peso seco de la parte aérea (Cuadro 2). Al término de la aclimatación las plantas tenían de 4.5 a 5.8 hojas, de 10.8 a 12.3 mm de ancho de la hoja, de 12.5 a 16.8 cm de altura, 7.4 a 9.0 mm diámetro de tallo, de 5.3 a 8.2 raíces y las raíces de 3.5 a 4.3 cm de longitud (Cuadro 3).

En la aclimatación de plantas de A. marmorata micropropagadas, 100 % de éstas sobrevivió cuando se establecieron en sustrato de turba-perlita (1:1) o turba-arena de río (1:1), mientras que sólo sobrevivió 72.4 % de las plantas establecidas en un sustrato a base de perlita, 38.7 % arena de río y 35.7 % de grava volcánica (tezontle) ^{(Aguilar y Rodríguez, 2018)}; asimismo, 100 % de las plantas de A. marmorata micropropagadas se adaptaron cuando estuvieron en macetas con grava volcánica (tepojal) en un sistema semi-hidropónico; estas plantas tuvieron mejor desarrollo que aquellas cultivadas en un sustrato compuesto por tierra agrícola y perlita en proporción 1:1. Las plantas alcanzaron 7 cm de altura, 6 hojas, 15 mm de diámetro de tallo, 10 raíces con longitud de 9.5 cm ^{(Álvarez-Aragón et al., 2020)}. Plantas de Agave potatorum Zucc micropropagadas sobrevivieron de 87 a 97 % cuando se establecieron en perlita (100 %) y fueron irrigadas diariamente con solución nutritiva Steiner ^{(Enríquez-del Valle et al., 2021)}.

Las características físicas y químicas del sustrato son importantes para la adaptación y desarrollo de las plantas micropropagadas en la etapa de aclimatación. El sustrato proporciona soporte a la planta y debe proveer condiciones estables de aireación, retención de humedad y drenaje, así como capacidad de intercambio catiónico ^{(Lazcano-Bello et al., 2021)}. Se deben conocer las características que poseen materiales orgánicos e inertes como base para la preparación de un sustrato que posea propiedades físicas, químicas y biológicas apropiadas ^{(Cruz et al., 2010}; ^{Pérez et al., 2017)}. La turba es un sustrato que destaca por su alta retención de humedad y porosidad (88-91 %) ^{(Núñez, 2009)}, además de contener nutrientes como nitrógeno, fósforo, calcio, magnesio y azufre, donde están más disponibles en relación con otros sustratos ^{(Benavides et al., 2016)}. La perlita es un material inerte constituido por 85 a 96 % de espacios porosos, de los cuales 35 % son espacios de retención de humedad, y el resto de aireación, motivo por el cual este material se usa frecuentemente en las mezclas de sustratos.

Después de 95 días de aclimatación, las plantas de A. angustifolia provenientes de cultivo in vitro incubadas en laboratorio y establecidas en sustrato 50T:50P mostraron los valores más altos en ancho de la hoja mayor (12.3 mm), área foliar (52.6 cm²) y altura de la planta (16.8 cm), pero sin diferencias significativas con las plantas de otros tratamientos provenientes de la misma condición de incubación. Las plantas de cultivo in vitro incubadas en una estructura con sombra parcial y establecidas en perlita (100 %) tuvieron el mayor diámetro de tallo (9.0 mm), número de raíces (8.2), volumen de raíz (0.9 cm³), peso seco de raíz (0.09 g) y peso seco de la parte aérea (0.4 g) que las plantas cultivadas en tezontle-perlita 25:75 (Cuadro 3).

El sustrato y el abastecimiento nutrimental son condiciones importantes para la aclimatación de las plantas micropropagadas. En A. americana var. oaxacensis se observó que las vitroplantas que permanecieron en aclimatación por 290 días en dos mezclas de sustratos (turba 66.6 % + arena 33.3 %, y turba 75 % + arena 25 %), fertirrigadas con solución nutritiva Steiner, tenían 5.6 y 5.5 hojas, tallos de 2.5 y 2.4 cm de diámetro, área de 122.7 y 112 cm², y peso seco de raíz de 1.7 y 1.4 g, respectivamente ^{(Cruz et al., 2019)}.

Las plantas micropropagadas se obtienen en condiciones controladas, con medios de cultivo que contienen concentraciones altas de azúcares, nutrimentos y reguladores de crecimiento; además, se encuentran en recipientes cerrados con humedad relativa alta, temperaturas constantes, bajo intercambio de gases y crecimiento heterótrofo debido a la baja intensidad de luz dentro del cuarto de crecimiento ^{(Silva et al., 2018}; ^{Xiao et al., 2011)}. Las plantas que crecen en estas condiciones tienen hojas delgadas de consistencia herbácea, con pobre desarrollo de cutícula y sus raíces pueden llegar a ser ineficientes; asimismo, estas plantas, presentan baja actividad fotosintética y sus estomas son poco funcionales en cuanto a su apertura y cierre, además de que tienen control mínimo de la transpiración. Estas características en las plantas micropropagadas limitan su supervivencia cuando se transfieren al ambiente ex vitro, donde imperan condiciones de humedad relativa baja, mayor intensidad lumínica, variaciones de temperatura en intervalos más amplios y menor disponibilidad de nutrimentos, como se observó en A. tequilana ^{(Rescalvo-Morales et al., 2019)}, Passiflora edulis ^{(Manokari y Shekhawat, 2017)} y Genvuina avellana ^{(Alvarez et al., 2012)}. En la presente investigación, al inicio de la aclimatación, las plantas obtenidas de cultivos in vitro incubados en laboratorio presentaban mayor cantidad y tamaño de raíces que las incubadas en la estructura de sombra parcial, pero estas últimas presentaban hojas más rígidas y gruesas con espinas en los bordes.

Las plantas de agave micropropagadas, durante su aclimatación desarrollan nuevas hojas con estomas funcionales para el control de la transpiración y de ceras epicuticulares que evitan la pérdida de agua; asimismo, forman raíces más eficientes y cambian su metabolismo de C₃ a CAM ^{(Rescalvo-Morales et al., 2019)}. Modificando gradualmente las condiciones ambientales de incubación de los cultivos in vitro al reducir la humedad relativa, incrementar la intensidad, calidad y tiempo de exposición a la luz durante la incubación, es posible inducir que las plantas desarrollen metabolismo autótrofo ^{(Alvarez et al., 2012}; ^{Schmildt et al., 2015)}; entonces, exponer los cultivos in vitro a radiación solar disminuida, como una condición de pre-adaptación, ocasiona que las plantas micropropagadas adquieran características morfológicas y fisiológicas que podrían mejorar su adaptación al ambiente ex vitro ^{(Alvarez et al., 2012}; ^{Ferreira et al., 2021}; ^{Pospíšilová et al., 2007)}. La luz, además de ser fuente de energía que se aprovecha durante los procesos fotosintéticos y acumulación de biomasa, es un factor determinante para el desarrollo de las plantas al intervenir en la fotomorfogénesis ^{(Arena et al., 2016}; ^{Wang et al., 2016)}. Los resultados de la presente investigación muestran que las condiciones de incubación a las que se expongan las vitroplantas antes de que sean trasplantadas al suelo afectan sus características morfológicas y su capacidad de adaptación a las condiciones ex vitro. Incubar los cultivos in vitro dentro de una estructura con sombra parcial, donde se expongan a radiación solar disminuida, podría ser una condición que reduzca los costos de producción de las vitroplantas.

^{Martins et al. (2015)} evaluaron el crecimiento de plantas micropropagadas de Neoregelia concentrica expuestas a diferentes niveles de irradiancia (30, 50, 70 y 100 % de radiación solar) durante su aclimatación. Estos autores observaron que sólo 67 % de las plantas que permanecieron en 100 % de radiación solar sobrevivió, mientras que todas aquellas que se mantuvieron en 30 y 70 % de irradiancia se adaptaron. El incremento en el nivel de irradiancia de 30 a 70 % provocó que las plantas formaran más hojas, área foliar, peso fresco de la parte aérea y masa seca total.

Conclusiones

Las plantas de Agave angustifolia provenientes de cultivos in vitro que permanecieron en condiciones de laboratorio con iluminación LED durante 31 días alcanzaron mayor altura que las incubadas en la estructura de sombra parcial. El mejor sustrato para aclimatación fue la mezcla a base de 50 % turba y 50 % perlita, permitiendo que 100 % de las plantas sobrevivieran. Después de 95 días de aclimatación, las plantas provenientes de cultivos in vitro incubadas en laboratorio fueron 13.5 % más altas, con 13 % más hojas y con raíces 16 % más largas que las crecidas en la estructura de sombra parcial. Los resultados indican que es factible incubar los cultivos in vitro en una estructura o invernadero con radiación solar disminuida, sin afectar significativamente la calidad de las plantas, incrementando con ello su adaptación al ambiente ex vitro y reduciendo el uso de iluminación artificial, consumo de energía eléctrica y costos de producción.