INTRODUCCIÓN

El arándano (Vaccinium corymbosum L.) es un cultivo de alto valor socioeconómico a nivel mundial, su consumo se ha incrementado debido a sus propiedades nutricionales y medicinales (^{Smith et al., 2000}). En México, la producción de arándano aumentó 800 % en los últimos 10 años, posicionando al país como cuarto productor a nivel mundial; los principales estados productores son Jalisco, Colima y Michoacán (^{SIAP, 20019}). En San Pedro Nexicho, Sierra Norte del estado de Oaxaca, el cultivo de arándano se introdujo en 2015 (^{Zárate et al., 2017}). En el ciclo productivo 2018 se observó la muerte de retoños en plantas del cv. Biloxi, cultivadas bajo cubierta o a cielo abierto; la incidencia estimada fue de 40 a 60 %. Esta incidencia posiblemente se relaciona con la existencia de plantas silvestres de zarzamora (Rubus spp.) con síntomas de muerte de retoños, tizón floral y moho gris de frutos asociados a Botrytis sp. En los cultivos de arándano de otras regiones de Oaxaca la incidencia de muerte de retoños fue de 2 a 5 %, por lo que no se considera de importancia económica.

La muerte del retoño del arándano puede ser inducida por Phomopsis vaccinium y P. columnaris (^{Farr et al., 2002}), Lasiodiplodia theobromae (^{Wang et al., 2016}), Neopestalotiopsis (Lee et al., 2019) o Colletotrichum acutatum (^{Yoshida et al., 2007}). Los retoños sufren marchitez, necrosis y muerte (^{Zhao et al., 2019}). En Oaxaca no se conoce con precisión al agente causal de la muerte del retoño del arándano. El objetivo del presente estudio fue identificar morfológica y molecularmente el agente causal de la muerte de retoños de plantas de arándano cv. Biloxi, así como describir los daños histológicos que induce el fitopatógeno. El conocimiento del agente causal permitirá establecer estrategias efectivas de control y contribuirá al mejoramiento de la producción de arándano en la Sierra Norte del estado de Oaxaca, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

En un huerto comercial de arándano cv. Biloxi; ubicado en San Pedro Nexicho (17° 05’ N, 96° 31’ O, 2120 msnm), municipio de Santa Catarina Ixtepeji, Oaxaca; en el ciclo productivo 2018, se muestrearon 20 retoños con síntomas de marchitez y necrosis descendente. Por cada retoño se obtuvieron cinco secciones de tejido de 5 mm². Las muestras se desinfestaron por inmersión en NaClO 2 % durante 3 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron sobre toallas de papel estéril. El tejido se sembró en medio de cultivo agar-dextrosa-papa (PDA) 2 %, Bioxon^® y se incubó durante 10 d a 25 °C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad. Los hongos que crecieron a partir de tejido enfermo se aislaron y se purificaron por la técnica de cultivo monoconidial. Las pruebas de patogenicidad se realizaron con una colonia de 10 d de crecimiento de donde se preparó una suspensión de conidios (1 × 10⁴ conidios mL^-1) y el conteo de conidios se realizó con la cámara de Neubauer (Blaubrand^®, Wertheim, Alemania). En San Pedro Nexicho se adquirieron cinco plantas asintomáticas de arándano cv. Biloxi de 1.5 años de edad, sembradas en contenedores plásticos de 30 L con una mezcla de suelo agrícola (30 %) y corteza de pino (70 %); se llevaron al laboratorio de Fitopatología del CIIDIR Unidad Oaxaca del Instituto Politécnico Nacional; se seleccionaron 20 ramas asintomáticas con retoño; las ramas se lavaron con agua destilada estéril y etanol 70 % y se inocularon por aspersión con 5 mL de la suspensión conidial. Se utilizó agua destilada estéril como control. El material vegetal inoculado se mantuvo en cámara húmeda por 48 h con fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad. La cámara húmeda consistió de una bolsa de polipapel transparente y estéril que cubrió la rama inoculada. De los retoños que se enfermaron se aisló nuevamente el patógeno y se comparó morfológica y molecularmente con el hongo originalmente inoculado.

La extracción de ADN se realizó con bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) 2 % (^{Doyle y Doyle, 1990}) adicionado con acetato de amonio 3 M. La amplificación de la región del espaciador transcrito interno (ITS) se realizó con los iniciadores universales ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990}). La reacción de amplificación consistió de un volumen final de 25 µL [3 µL de ADN genómico (50 ng), 12.5 µL de GoTaq^® Green Master Mix (Promega, Madison, Wisconsin, EUA), 1 µL de cada iniciador y 8.5 µL de agua libre de nucleasas]. El protocolo de termociclado incluyó desnaturalización inicial de 2 min a 95 °C; 35 ciclos de desnaturalización de 1 min a 95 °C, 30 s a 58 °C y una extensión de 20 s a 72 °C, y extensión final a 72 °C durante 5 min. Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de etidio. El producto de PCR fue purificado y secuenciado en Macrogen (Seoul, República de Corea del Sur). Las secuencias de ADN fueron editadas y ensambladas con el programa BioEdit v7.0.5 (^{Hall, 1999}). Las secuencias consenso se compararon con las secuencias depositadas en el GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

El estudio histopatológico se realizó siguiendo la técnica de inclusión en parafina (^{Johansen, 1940}) y tinción diferencial con safranina O ácida y verde rápido (^{Curtis et al., 1986}). Veinte muestras de retoños sintomáticos se fijaron en solución FAA (50 % de etanol absoluto, 5 % de ácido acético glacial, 10 % de formaldehído y 35 % de agua destilada) durante 48 h a 4 °C. La técnica de inclusión en parafina incluyó tres lavados de las muestras con alcohol etílico al 50 %, cada lavado duró 15 min; la deshidratación se hizo con alcohol etílico en concentraciones ascendentes de 50, 70, 96 y 100 %; las muestras estuvieron inmersas durante 3 h en cada alcohol; la clarificación se efectuó con alcohol etílico 100 % y con xileno, cada paso duró 2 h. La infiltración se hizo introduciendo las muestras en parafina histológica líquida Hycel^® a 70 °C, el proceso se realizó dos veces, cada uno duró 3 h; la inclusión de las muestras en parafina se realizó en cubos de papel de 3 cm³; dentro de los cubos se colocaron las muestras y se cubrieron con parafina histológica líquida Hycel^® a 70 °C; la parafina se dejó solidificar a 4 °C.

El tejido se cortó en un micrótomo (Bright Instruments Co. Ltd., Luton, Bedfordshire, Inglaterra) a 10 μm de espesor, los cortes se colocaron en baño de flotación (agua a 70 °C + 3 g de grenetina L^-1) durante 1 min y se montaron en portaobjetos; posteriormente, los portaobjetos se colocaron en una estufa a 45 °C durante 20 min para eliminar el exceso de parafina; las muestras se lavaron tres veces consecutivas con xileno; cada lavado duró 3 min; se hidrataron con alcohol en concentraciones descendentes al 100, 96, 70 y 50 % durante 3 min por concentración. La técnica de tinción diferencial incluyó la tinción de las muestras con safranina O ácida, donde estuvieron inmersas durante 4 h; la deshidratación se realizó con alcohol en concentraciones gradualmente ascendentes al 50, 70 y 96 % durante 3 min por concentración; la segunda tinción se realizó con verde rápido durante 20 s; luego, se deshidrataron con alcohol al 96 y 100 % durante 3 min por concentración y se lavaron con xileno tres veces. Sobre la muestra se agregó resina sintética y se colocó un cubreobjetos. Las preparaciones se observaron con un microscopio de luz (Carl Zeiss Primo Star^®, White Plains, New York, EUA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Del tejido sintomático obtenido en campo (Figuras 1A y 1B) se aisló consistentemente (97 %) a Botrytis sp. En las pruebas de patogenicidad, el aislado inoculado indujo inicialmente pequeñas lesiones necróticas que después aumentaron de diámetro hasta coalescer con otras; las hojas sufrieron marchitez y necrosis; el daño se extendió al tejido de ramas adyacentes. Estos síntomas se observaron a los 10 días después de la inoculación. En el tratamiento testigo no se observaron síntomas. Los síntomas de muerte de retoños en especies de Vaccinium se ha atribuido a Phomopsis vaccinium y P. columnaris (^{Farr et al., 2002}), Lasiodiplodia theobromae (^{Wang et al., 2016}), Neopestalotiopsis (Lee et al., 2019) y a Colletotrichum acutatum (^{Yoshida et al., 2007}).

Figura 1 Muerte de retoño en Vaccinium corymbosum cv. Biloxi. A y B) retoños con necrosis descendente, C) Botrytis cinerea en medio de cultivo PDA con formación de esclerocios después de 30 días de incubación, D) conidióforo y conidios en racimos, E) conidios unicelulares, hialinos y elipsoidales, F) corte histológico longitudinal de una ramita de retoño de arándano, se observa degradación, lisis y desorganización celular de la epidermis, G) células de la epidermis conteniendo cuerpos amorfos que posiblemente corresponden a polifenoles. 

El micelio de Botrytis fue de aspecto algodonoso; en los primeros 3 d el cultivo fue de color blanco y después se tornó café oscuro; a los 10 d se observó abundante producción de conidios. Después de 30 d la cepa produjo en promedio 45 esclerocios por caja de Petri de 100 × 15 mm; los esclerocios fueron de forma irregular, oscuros y compactos, de 1.5 a 2.5 mm (Figura 1C). El hongo aislado produjo hifas septadas, conidióforos septados con pared lisa y en los ápices conidios en racimos (Figura 1D); los conidios fueron unicelulares, hialinos y elipsoidales de 7.8 a 12.0 × 9.6 a 17.7 μm largo-ancho (Figura 1E). Con base en las características morfológicas, el aislado coincidió con las características de B. cinerea descritas por Mansouripour y Holmes (2002). La secuencia de ADN obtuvo una similitud del 100 % con la secuencia MN589850 (569 pb) depositada en el NCBI, correspondiente a la especie B. cinerea.

En cortes histológicos de tejido de retoños necróticos (rama tierna) se observó degradación, lisis y desorganización celular de la cutícula y epidermis (Figura 1F); dentro de ellas, se observaron cuerpos amorfos de color rojo que probablemente correspondieron a polifenoles (Figura 1G), los cuales están estrechamente relacionados con la defensa de la planta contra patógenos necrotróficos (^{AbuQamar et al., 2017}). No se observaron estructuras de penetración del hongo, lo cual sugiere posibles daños por degradación enzimática de pectinasas, celulasas y hemicelulasas. Botrytis cinerea se caracteriza por la producción de compuestos fitotóxicos de tipo lactonas y sesquiterpenos durante la infección, por lo que es capaz de causar muerte celular antes de invadir a las células del hospedante por el hábito nutricional necrotrófico del patógeno (^{AbuQamar et al., 2017}; ^{Dinh et al., 2011}).

Se identificó morfológica y molecularmente a Botrytis cinerea como agente causal de la muerte de retoños de arándano cv. Biloxi. El hongo causó desorganización, lisis y muerte de las células de la cutícula y epidermis de los retoños con síntomas de necrosis. La identificación precisa del hongo fitopatógeno permitirá plantear estrategias de manejo y control integrado para disminuir las pérdidas por B. cinerea en el cultivo de arándano cv. Biloxi en la Sierra Norte del estado de Oaxaca.