La palma fénix o palma canariense (Phoenix canariensis) es nativa de las Islas Canarias (archipiélago de España) y puede alcanzar de 12 a 15 m de altura (^{Broschat, 2013}). Se introdujo ampliamente a varios países y es una de las especies ornamentales comúnmente cultivadas y apreciadas en el mundo (^{CABI, 2016}). Uno de los problemas sanitarios que principalmente afecta a esta especie es la marchitez, la cual se ha documentado en varios países alrededor del mundo, en Francia (1973), el agente causal fue identificado como Fusarium oxysporum f. sp. canariensis; así mismo, se reportó en Italia, Japón (1977) (^{Arai y Yamamoto, 1977}; ^{Feather et al., 1979}), Islas Canarias y California. En este último lugar se ha reportado en palmas sembradas en campos y en viveros de Florida (^{Garofalo y McMillan, 2003}). En el caso de Italia se ha documentado la presencia de Phytophthora palmivora como agente causal de la pudrición de cogollo de la palma canariense (^{Pane et al., 2007}).

^{Garofalo y McMillan (1999}) indicaron, que la pudrición del cogollo es causada por Phytophthora sp., uno de los patógenos más comunes de las palmas que se encuentran en el trópico húmedo; y mencionan que entre las especies susceptibles se encuentra P. canariensis. Otras especies de hongos que se han registrado como causantes de la pudrición del brote en las palmas, a menudo como infecciones secundarias en las últimas etapas de desarrollo de la enfermedad o justo antes de la muerte de la palma, son los géneros Botryodiplodia, Chalara (Thielaviopsis) y Colletotrichum.

En América, la enfermedad se ha extendido en Panamá, Costa Rica, Nicaragua, Ecuador, Brasil, Surinam, Perú y Venezuela (^{Franqueville, 2001}). En el caso particular de México, de acuerdo con información proporcionada por Romero-Valencia (com. Personal 2019), en la ciudad de Santiago de Querétaro, la muerte regresiva de la palma se empezó a observar desde 2009, con antecedentes en Guanajuato; sin embargo, no se ha estudiado al agente causal. La muerte regresiva de la palma canariense se ha dispersado rápidamente en la ciudad de Santiago de Querétaro, matando decenas de palmas en avenidas, parques públicos, instituciones, jardines privados, afectando ejemplares con edades desde los cuatro hasta más de 80 años según registros de los propietarios, independientemente del tipo de manejo. Debido a la variación de los patógenos que se han encontrado en diferentes estudios y lugares del mundo, el objetivo de este trabajo fue determinar el agente(es) causal(es) asociados a la muerte regresiva de la palma canariense (P. canariensis) en la zona conurbada de Santiago de Querétaro, Querétaro.

El área de estudio fue la ciudad de Querétaro y áreas circunvecinas, que comprende los municipios de Querétaro, El Marqués y Corregidora. Se dividió en cuatro cuadrantes, tomando como punto medio la zona centro y como referencia el norte magnético. Durante la investigación se realizaron recorridos (septiembre de 2014 a agosto de 2015) en las avenidas, bulevares principales, parques públicos, así como sitios de propiedad privada cuando se observaron palmas canarienses. Los recorridos iniciaron en el cuadrante I y terminaron en el IV, de esta forma se tomaron en cuenta palmas sanas, muertas y con síntomas iniciales clasificándose en: a) palmas con hojas basales muertas, b) hoja bandera muerta (meristemo apical) y c) la combinación de ambos síntomas.

Para realizar el muestreo se derribaron palmas enfermas en los cuatro cuadrantes, de manera que al menos dos palmas por cuadrante fueron seccionadas. Las palmas seleccionadas, se derribaron con motosierra Still MS660^® y con tijeras Felco® se cortaron las hojas que presentaron los síntomas de cambio de color en el raquis (Figura 1 A y D). Para obtener el meristemo apical de las palmas derribadas, se seccionaron para conseguir el cogollo (Figura 1 B y C). Todas las muestras se preservaron en bolsas de papel y a su vez dentro de bolsas de plástico en hielera con gel congelado para el análisis microbiológico.

Figura 1 Palma canariense (Phoenix canariensis) asociada a la muerte regresiva colectada en la zona conurbada de la ciudad de Querétaro, Querétaro. A) Raquis con cambio de color café a lo largo de la parte central. B) Sección del meristemo apical con pudrición blanda. C) Se observa el corte longitudinal del meristemo apical y hoja bandera muerta. D) Corte transversal del mismo raquis, se aprecia un color con tendencia rosa en la sección superior. 

Las muestras se analizaron en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro. Se cortaron tejidos de raquis de la hoja y meristemo (<0.8 cm) que presentaron la transición de tejido sano-enfermo, los cuales, fueron desinfestados con hipoclorito de sodio al 2% por 2 min y lavados en agua destilada estéril (tres lavados), posteriormente, se dejaron secar en sanitas estériles. Los fragmentos se colocaron en cámaras húmedas en cajas Petri preparadas con papel filtro estéril y humedecido con agua destilada estéril. Del total de palmas muestreadas, se prepararon seis cámaras húmedas con cinco trozos de raquis por planta y tres cámaras con cinco piezas de meristemo apical por planta. Como testigo se prepararon dos cajas Petri en cámara húmeda con tejido asintomático, una de tejido de raquis y otra de meristemo. Las cámaras húmedas se incubaron a temperatura ambiente durante tres días.

Una vez detectada la presencia de crecimiento de hongos, se prepararon laminillas utilizando microscopio de disección Leica® Zoom 2000 y se realizó la determinación morfológica con las claves de ^{Barnett y Hunter (2003}) y ^{Booth (1971}). Las colonias de hongos se transfirieron por punta de hifa a cajas Petri con medio de cultivo PDA (Papa Dextrosa Agar) (Bioxon®), mientras que las colonias bacterianas obtenidas de los meristemos apicales con pudrición blanda, se sembraron en cajas Petri con medio agar nutritivo (Bioxon®).

Para la identificación molecular de los hongos, se realizó la extracción del ADN usando el método por ^{Mirhendi et al. (2010}). Se utilizaron los siguientes cebadores: ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG y ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC; el cual amplifica un tamaño de 500 pb de la región ITS de ADNr. Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, seguidos de 25 ciclos a 58 °C por 30 segundos (alineamiento), 72 °C por 2 min (extensión), 95 °C por 30 s (desnaturalización) y una extensión final a 72 °C por 10 minutos (^{White et al., 1990}). Los productos amplificados de PCR se mandaron a secuenciar al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO), del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV), Irapuato, Guanajuato, México para su identificación. Las secuencias de los hongos se compararon con la base de datos depositadas en GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Con las secuencias generadas en este trabajo y las del banco de genes (NCBI) se construyó una matriz en el programa McClade 4.0 (^{Maddison y Maddison, 2000}). Se construyeron dendogramas usando los principios de parsimonia, máxima verosimilitud y bayesiano. Para la construcción del árbol de parsimonia se usó el programa de PAUP 4.0b10 (^{Swofford, 2002}), con una búsqueda heurística de 1000 réplicas, así como de un bootstrap. El árbol de máxima verosimilitud se construyó con el programa RaxML (^{Stamatakis, 2006}), usando el modelo GTRGAMMA, con 1000 réplicas y un bootstrap de 1000 réplicas. Finalmente, el árbol de Bayes se construyó usando el programa MrBayes 3.1.2 (^{Ronquist y Helsenbeck, 2003}), con el modelo GTR invgamma, con cuatro corridas simultáneas y una frecuencia de muestreo de 100.

Por otro lado, se realizó los postulados de Koch con una de las cepas de los hongos obtenidos. Para ello, se utilizaron plántulas de P. canariensis de dos años de edad, mismas que fueron desinfectadas por inmersión a raíz desnuda con una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 2 min; posteriormente, se lavaron por inmersión en agua estéril y trasplantaron en sustrato estéril. Se realizaron los riegos solo con agua estéril. Se inocularon 30 plántulas por aspersión con una solución de 1x10⁶ conidios en las raíces, adicionalmente se les hizo una punción en el raquis de las hojas para facilitar la infección por el hongo, es decir a los ejemplares de prueba se les realizó doble inoculación. Como testigo se usaron cinco plántulas y se mantuvieron a temperatura ambiente en laboratorio. Las plántulas se revisaron cada tercer día hasta observar síntomas visibles y característicos de la enfermedad, posteriormente, se tomaron muestras de las plantas con síntomas para volver a aislar el hongo.

Para el caso de la identificación de bacterias se usaron las pruebas básicas de identificación con el manual de ^{Schaad et al. (2001}). Se hicieron aislamientos en medios selectivos como en B de King y prueba de oxidación y fermentación (Huge y Leifson). Posteriormente, se utilizaron placas Biolog, con las pruebas de acidificación de azúcares (salicina, melibiosa, lactosa, raffinosa, sorbitol, maltosa e inositol). Adicionalmente, se hicieron pruebas complementarias: producción de gas a partir de glucosa, licuefacción de la gelatina, producción de indol, agar citrato de Simmons, tolerancia a NaCl al 5%, crecimiento a temperaturas de 30 y 37 °C y agar hierro triple azúcar indicadas por Schaad et al. (2001).

Además, una muestra de meristemo (hoja bandera muerta) y de peciolo se envió al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) para su análisis en los laboratorios de micología, bacteriología y virología. Finalmente, para determinar la correspondencia de los tres tipos de síntomas que presentaron las plantas durante el muestreo, se realizó una prueba de Chi cuadrada (X ²) para determinar cuál síntoma es el que se presentó con mayor frecuencia en la zona urbana.

En los recorridos se muestrearon 262 palmas, de las cuales 95 fueron asintomáticas (36.3%), 122 muertas (46.6%) y 45 se observaron enfermas (17.2%), solo 42 presentaron síntomas combinados de hojas basales muertas y hoja bandera muerta, dos presentaron solo las hojas basales muertas y una presentó la hoja bandera muerta. La prueba de Chi cuadrada indicó que la combinación de la muerte de hojas basales y de la hoja bandera son los síntomas de las plantas enfermas con un 95% de confianza (0.03 ≤ 0.04). De las 12 palmas analizadas, se prepararon 72 cámaras húmedas para la búsqueda de hongos en el raquis y 36 para la búsqueda de bacterias en el meristemo apical. De las cámaras húmedas, solo 24 se observó crecimiento de hongos, y a partir del aislamiento por punta de hifa, se obtuvo consistentemente al género Fusarium correspondiendo a dos aislamientos por cada palma derribada (12 aislamientos). De los 12 aislamientos, solo cuatro se identificaron molecularmente, que correspondió a Fusarium sp. en el complejo F. incarnatum (F1) con una coloración beige micelial, de conidios con célula pedicelada; mientras que tres de ellas correspondieron a Fusarium sp. en el complejo F. verticillioides de color violeta micelial y de microconidios formados en cadenas (F2, F3 y F4) (Figura 2). Así mismo, un aislamiento se determinó morfológicamente identificándose como F. solani con color micelial morado pálido y abundantes microconidios ovalados. Las características morfológicas y de colonias se respaldaron por ^{Booth (1971}). Parte del material vegetal del que se obtuvo F. solani, fue aislado y confirmado por el Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), quienes aislaron e identificaron a la misma especie de hongo.

Figura 2 Árbol de máxima verosimilitud, con la posición filogenética de las cuatro cepas de Fusarium (señalado en negritas). Los valores de las ramas corresponden al soporte de bootstrap de parsimonia/bootstrap de máxima verosimilitud/probabilidades posteriores. 

Este problema fitosanitario se encuentra distribuido en toda la mancha urbana de la ciudad de Querétaro ya que en los cuatro cuadrantes se encontraron plantas enfermas y muertas. Es importante resaltar que cuando los síntomas se presentan en la hoja bandera el daño es irreversible, es decir, la muerte de la planta es inminente, así como menciona ^{Tomlinson (2012}) quien señala que dentro de la corona en sí, se compone de tejidos meristemáticos y diferenciadores, este último deriva del primero y consta de células en estado de recambio mitótico y las células que forman los tejidos jóvenes del tronco; así pues conforme a lo observado en esta investigación, al estar necrosado el meristemo apical, la palma se considera muerta.

Por otra parte, la prueba de patogenicidad se realizó únicamente con F. solani debido la alta frecuencia encontrada en las cámaras húmedas. A los 30 días, las plántulas inoculadas mostraron el cambio de color en el raquis de las hojas donde las partes apicales se empezaron a marchitar y posteriormente avanzó hacia la base del mismo; adicionalmente, se observó marchitez en los foliolos. Todas las plantas murieron a los 60 días después de la inoculación, mientras que las plantas testigo permanecieron sanas. El hongo se volvió a reaislar de las plantas inoculadas confirmándose la presencia de F. solani (Figura 3 A).

Figura 3 Síntomas en palma canariense (P. canariensis). A) Se observa el cambio de color en el raquis de la hoja inoculada lo cual indica un proceso de infección. B) Ejemplar de P. canariensis afectado en hojas basales y hoja bandera. C) Mismo ejemplar un mes después. D) Palma joven con la hoja bandera muerta. 

Aunque ^{Elliott (2015}) señala a F. oxysporum f. sp. canariensis como el agente causal de la marchitez en P. canariesis, en este estudio se amplía el rango de patógenos como F. solani (prueba de patogenicidad) y los hongos Fusarium spp. (sin prueba de patogenicidad) asociados a la muerte regresiva de P. canariensis en la zona urbana de Querétaro. Al respecto ^{Mansoori y Kord (2006}) encontraron que F. solani, ataca a la palma datilera (Phoenix dactylifera) en Irán ocasionando la “muerte amarilla”; con los síntomas de un severo amarillamiento generalizado y hojas secas adheridas a la planta; no obstante, estos síntomas no concuerdan a lo observado en esta investigación, ya que los síntomas observados coinciden con lo descrito por ^{Broschat (2013}) en Estados Unidos y Elliott (2015) en Florida, donde se reporta a F. oxysporum f. sp. canariensis atacando a esta especie de palma.

Por otro lado, durante la disección del meristemo apical de las palmas analizadas, se detectó un aroma fétido, así como el arribo de moscas de las familias Muscidae y Calliphoridae característico en las pudriciones blandas de origen bacteriano, como lo indican los estudios por ^{Pérez-Aragón et al. (2013}), quienes determinaron a Erwinia sp., el cual, fue identificada en esta investigación. Esta bacteria ocasiona pudrición blanda en el meristemo apical, las palmas a las que se tiene acceso a la hoja bandera, se desprenden con facilidad ya que su unión al ápice del tallo se necrosa. En el caso de la siembra del meristemo apical para determinar la presencia de bacterias, se obtuvo 19 (19/36) colonias de las cámaras húmedas, las cuales correspondieron a 11 de las 12 palmas analizadas. De acuerdo con ^{Rivas y Herrera (2015}) identificaron también a Erwinia spp., en la palma aceitera (Elaeis guineensis) sugiriendo que la bacteria puede contribuir en las fases finales del proceso de pudrición del cogollo de la planta.

Por otro lado, la muestra de meristemo enviada al CNRF para la detección de bacterias resultó positiva por el protocolo de PCR para la detección del fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero (ALC), lo cual corresponde con lo reportado por ^{Harrison et al. (2002}) donde detectaron alta mortalidad de P. canariensis con síntomas similares a los del ALC (Texas Phoenix decline) en Texas. Este problema fitosanitario es estudiado también por ^{Gurr et al. (2016}) en Puerto Rico y Florida de la Unión Americana, así como en México, y corresponde al grupo IV-D del gen 16Sr; aunque en el caso de México los análisis de detección fueron principalmente en palmas diferentes a P. canariensis, como lo indica ^{Aviña-Padilla y colaboradores (2011}) que analizaron muestras positivas al fitoplasma en P. dactilyfera y Sabal mexicana. ^{Mora-Aguilera et al. (2016)} indican que los síntomas típicos de ALC consisten en necrosis de la inflorescencia en desarrollo, caída de frutos pequeños, amarillamiento de las frondas iniciando por las inferiores, defoliación total y muerte. En la Figura 3 (B y C) se aprecia un ejemplar de la palma canaria de al menos 30 años de edad, con las hojas basales y la hoja bandera muerta. Por otro lado, en la Figura 3 (D), se observa una palma joven (>ocho años) que presenta muerte de la hoja bandera con hojas basales asintomáticas.

Los resultados de este estudio indican que la muerte regresiva de P. canariensis en la zona conurbada de la ciudad de Querétaro está asociada por un complejo microbiano: fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero (confirmado por CNRF), Erwinia sp. así como hongos, en un complejo de especies Fusarium spp. y F. solani, este último confirmado por postulados de Koch. No obstante, es importante resaltar que se requieren más estudios para conocer la etiología de este síndrome; al igual de realizar pruebas con todos los aislamientos obtenidos en este estudio para evaluar la patogenicidad en las palmas; así mismo, la evaluación en un mayor número de plantas para corroborar la presencia del fitoplasma, ya que plantas de todas las edades han muerto en toda la zona conurbada de la ciudad de Querétaro.