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Introducción
Los trastornos que afectan al SNC tienen actualmente gran repercusión social y económica en la población mundial. La epilepsia es una enfermedad que afecta aproximadamente a 50 millones de personas en el mundo7, a pesar del desarrollo de nuevos medicamentos antiepilépticos en las últimas décadas, el 30% de los pacientes con epilepsia no responden adecuadamente al tratamiento de primera línea8. La actividad cerebral anormal puede propagarse desde su foco de origen hacia otras áreas cerebrales, por lo que el SNC puede ser afectado con la recurrencia de episodios convulsivos dejando consecuencias y secuelas neurológicas9. La frecuencia de las convulsiones en algunos casos complica su tratamiento, lo que conlleva a la epilepsia resistente al tratamiento (TRE). En este tipo de epilepsia se recomienda la administración de al menos dos fármacos anticonvulsivos, o bien recurrir a la intervención quirúrgica10.
La depresión es otro trastorno que afecta a más de 300 millones de personas a nivel mundial11, es una de las principales causas de discapacidad, morbilidad e incluso comorbilidad de la epilepsia, que puede ser recurrente y crónica12. De acuerdo con la OMS, afecta más a mujeres que a hombres y está caracterizada por la presencia de intensa tristeza, insatisfacción, baja autoestima, insomnio, anorexia o bulimia, cansancio y dificultad de concentración que afectan el desempeño laboral, escolar y personal, que puede culminar con el suicidio12. Cada año se suicidan cerca de 800,000 personas, siendo el suicidio la segunda causa de muerte en personas de 15 a 29 años. Aunque la mayoría de los fármacos antidepresivos mejoran los síntomas depresivos se sabe que ejercen múltiples efectos no deseado13.
México se caracteriza por ser un país con una extensa herbolaria, que no solamente sirve para consumo alimenticio, también se pueden utilizar con fines terapéuticos alternativos o complementarios14, la Red de Annonáceas15 recolectó 547 accesiones de cuatro especies de las 12 reportadas en México, las cuales corresponden 7 de A. muricata, 267 de A. cherimola, 241 de A. diversifolia 32 de A. squamosa16, la especie de A. reticulata se localiza en el Estado de Morelos y alrededores, es una especie endémica que no se encuentra en resguardo, pero con los resultados de éstos estudios preliminares del efecto depresor en el SNC, se podría aportar la información a la red de annonaceas y proteger la especie. De las especies del género Annona: tales como: la A. diversifolia17,18,19, la sobre el SNC como ansiolíticos y anticonvulsivos preparados en extractos polares.
Se ha reportado que la A. reticulata tiene propiedades hipoglucemiantes22, antihelmínticas, analgésicas-antiinflamatorias23, antipiréticas y cicatrizantes, aunque también se han reportado efectos citotóxicos. De estudios fitoquímicos previos, se sabe que esta especie contiene compuestos como: taninos, alcaloides, fenoles, glucósidos, flavonoides y esteroides, además se ha estudiado la actividad inhibitoria sobre el SNC, en estudios de sueño inducido6, pero no en modelos de epilepsia y depresión, por lo anterior en este estudio se realizó el discernimiento para conocer sus posibles efectos como anticonvulsivo y antidepresivo utilizando modelos experimentales en rata.
Objetivo
Evaluar el efecto inhibidor del SNC del extracto etanólico de A. reticulata, al realizar un análisis del potencial de la especie A. reticulata como tratamiento en el modelo experimental de epilepsia y depresión.
Material y método
Animales: Ratas de la cepa Wistar (200-250 g) se utilizaron como material biológico, alojados en cajas de acrílico en grupos de seis animales, sin restricción de alimento y agua y mantenidos a una temperatura controlada de 22ºC con ciclo de luz/oscuridad de 12:12h. Los experimentos se realizaron en conformidad con los estándares éticos de investigación (NOM-062ZOO-1999), aprobados por el Comité Nacional de Cuidados Animales y contenidos en la Ley General de Salud. Los animales fueron obtenidos del Bioterio de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, de acuerdo al protocolo aprobado por el CICUAL-UAMXochimilco No. 115/2018. Todas las administraciones se realizaron durante 5 días diariamente a la misma hora antes de la evaluación de los modelos experimentales.
Material vegetal
Annona reticulata se colectó en los meses de septiembre a noviembre, en Yautepec Morelos, una de las regiones de México donde se utilizan varias especies de plantas en la medicina tradicional, originaria de América central, su fruto es aromático de sensación suave y sabor dulce, el mayor y más importante uso de esta fruta, es para elaborar ricas aguas frescas, helados y dulces, se encuentra en forma de arbustos y árboles, su producción es endémica, y se puede conseguir en los mercados y viveros locales de Yautepec. Preparación del extracto: se colectaron hojas maduras y se pusieron a secar bajo sombra en un cuarto oscuro, libre de humedad, a temperatura ambiente, una semana después cuando las hojas se secaron, se trituraron en un mortero hasta obtener un polvo fino (271.45 g). El polvo se colocó en maceración en etanol absoluto (1 L) por una semana a temperatura ambiente. El solvente se filtró y evaporó a presión reducida, utilizando un Rotavapor R-300 Buchi, a 45°C para obtener un rendimiento de 19.8 g (7.3%) del extracto etanólico crudo (Figura 1). Los extractos se resuspendieron en Tween 80 al 0.5% en solución salina (0.9% NaCl). Los fármacos de referencia fueron: valproato de sodio y clorhidrato de imipramina adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis MO, USA). Las soluciones o suspensiones de los fármacos y los extractos se prepararon el mismo día de la administración y se administraron en sus respectivas dosis bajo un volumen de inyección de 0.1 mL/100 g.
El diseño del estudio consistió en 2 ensayos
Prueba de crisis tónico-clónicas inducidas con pentilentetrazol (PTZ). Se utilizaron 18 ratas Wistar de 250 g, divididas en grupos de 6 ratas: grupo control, solución salina 0.9% NaCl, grupo referencia, valproato de sodio (60 mg/Kg) y grupos experimentales, A. reticulata 800mg/Kg y 1600mg/Kg, después de 30 minutos de administrar, se indujeron las crisis convulsivas con 60 mg/Kg de pentilentetrazol, vía intraperitoneal, y se midió la latencia a la primera crisis tónico-clónica 24.
Prueba de nado forzado. Se utilizaron 30 ratas colocadas aleatoriamente en grupos de 6 ratas, para realizar la prueba de nado forzado se utilizó un cilindro de vidrio transparente (40 cm de alto x 20 cm de diámetro), el cual se llenó a – de su capacidad con agua a temperatura de 23°C; se realizó un entrenamiento previo de 10 minutos, después del nado las ratas se secaron con una toalla y se colocaron en una jaula individual; después de 24 h se realizó la prueba de nado forzado durante 5 minutos, la evaluación del comportamiento de la rata, se realizó a través de videograbaciones en un lugar aislado de movimientos y ruido; en la prueba de nado forzado las ratas generalmente adoptan ciertas actitudes, una de ellas es que simplemente se mantienen a flote, lo que sugiere una actitud para conservar energía, otra respuesta es que hacen mínimos movimientos para mantener la nariz por fuera de la superficie del agua e incluso estiran las extremidades posteriores o el rabo, manteniendo el cuerpo en un ángulo entre 30 y 45 grados. En este segundo caso se asume que el animal ha encontrado una forma de resolver el conflicto, mediante la adopción de la inmovilidad, pero que ha abandonado la motivación por escapar de la situación, un indicador de “desesperanza”, latencia a la inmovilidad, otro parámetro que se contabilizó fue las veces que la rata trato de escalar para escapar y las vueltas que dio (nado)25,26,27,28 (Figura 2). Se utilizaron 30 ratas, 6 en cada grupo, la administración se realizó media hora antes del ensayo: grupo control, solución salina 0.9% NaCl, referencia imipramina 20 mg/Kg y A. reticulata 400, 600 y 800 mg/Kg, administrados por vía oral.
Se realizaron pruebas preliminares de toxicidad hepática y de inducción del sueño, para ver si producía efectos colaterales. Se utilizó el modelo de daño hepático inducido por acetaminofén: Se utilizaron 18 ratas hembra Wistar de 250 g de peso; grupo control: solución salina 0.9% 1ml/Kg de peso durante 6 días; grupo daño hepático: acetaminofén 400 mg/kg de peso por 2 días y 600 mg/kg por 4 días; grupo daño hepático/ hepatoprotector: 400 mg/kg por 4 días de acetaminofén y 200 mg/Kg de annona reticulata y por 2 días más 600 mg/kg de acetaminofén y 200 mg/Kg de annona reticulata, todos las administraciones fueron por vía oral29,30. Se realizó la disección del hígado y se observaron los efectos macroscópicos, además se realizaron cortes histológicos que se observaron por microscopía.
Prueba de sueño inducido por pentobarbital
Se utilizaron 18 ratas Wistar hembra de 250 g de peso, 6 ratas por grupo; grupo control: pentobarbital sódico 35 mg/Kg de peso; grupo benzodiacepinas: pentobarbital sódico 35 mg/Kg de peso y diazepam 1 mg/Kg de peso; grupo annona: pentobarbital sódico 35 mg/kg y 200mg/Kg) de annona reticulata. El tiempo desde la inyección a la pérdida de la postura (tiempo de inducción) y el tiempo desde la pérdida de la postura hasta el despertar (tiempo de sueño en minutos) 31.
Resultados
Prueba de crisis tónico-clónicas inducidas con pentilentetrazol (PTZ): El extracto de A. reticulata (800 mg/Kg) incrementó significativamente (P <0.05) la latencia a la primera crisis tónico-clónica inducida con el PTZ de 1 ± 0.01 a 34 ± 3.26 minutos (Figura 3), igual a lo observado con el fármaco de referencia valproato de sodio 30 ± 0.96. La dosis de A. reticulata de 1600 mg/Kg tuvo una latencia de 43.93 ± 2.32 minutos. Se puede observar que los tratamientos, incrementaron la latencia a la crisis convulsiva de PTZ, y que no hay diferencias significativas entre los grupos de tratamiento de annona, se observa que entre la dosis de A. reticulata de 1600 mg/Kg. Sin embargo ésta dosis presento efectos colaterales, como incoordinación motora y sueño.
Prueba de nado forzado:Las ratas permanecieron inmóviles (Figura 4a), nadaron (Figura 4b) y escalaron (Figura 4c) al ser expuestas a la prueba de nado forzado durante 5 minutos; el grupo control permaneció inmóvil 4.37 ± 0.22 min, al inicio de la prueba se movió con mucha rapidez, dando giros enérgicamente, con un tiempo de nado de 0.41 ± 0.03 min, y un tiempo de escala de 0.38 ± 0.02, durante las vueltas de nado también escalaban con gran velocidad de manera simultánea, tratando de huir desesperadamente, por lo que se cansaron muy rápido, y dejaron de nadar y de escalar.
El grupo control antidepresivo que fue el de imipramina 20 mg/kg, un antidepresivo tricíclico, prolongó el tiempo de inmovilidad en el agua 4.37 ± 0.03 y el tiempo de nado 2.66 ± 0.06, pero no el de escalamiento 0.48 ± 0.03, que no hubo diferencias significativas con el grupo control (p <0.05), sin embargo; éste grupo tuvo un comportamiento diferente al colocarlos en el agua, se movieron nadando y escalando, inspeccionando el área e hicieron el intento de huir y de escalar, pero sin agresividad, ni de forma violenta, casi mitad del tiempo permanecieron explorando, hasta que adoptaron una conducta de inmovilidad.
El análisis de datos de los grupos tratados fue el siguiente: tiempo de inmovilidad A. reticulata 400 mg/kg, 2.62 ± 0.28; 600 mg/kg, 0.62 ± 0.01, 800 mg/kg 4.63 ± 0.05, todos los grupos con respecto al grupo control de solución salina, pero no con imipramina fueron estadísticamente significativos (p <0.05); sin embargo, el comportamiento fue diferente; al principio, los grupos de 400 mg/Kg y 600 mg/Kg empezaron a nadar con fuerza y rapidez, después comenzaron a moverse y escalar más lento y continuaron explorando, tiempo de nado de la dosis de 400mg/kg fue de 2.02 ± 0.25, éste grupo tuvo mucha variabilidad, tiempo de escalamiento 0.41 ± 0.03; el tiempo de nado de la dosis de 600 mg/ Kg fue de 3.97 ± 0.08 y el de escalamiento de 0.35 ± 0.02; ambas dosis fueron diferentes significativamente con el control de solución salina. La dosis de 800 desde que se colocó en el agua, se mantuvo tranquilo, no nadaron ni exploraron, pero se mantuvieron a flote durante todo el ensayo, el tiempo de nado fue 0.33 ± 0.05 sin escalamiento.
Prueba de sueño inducido por pentobarbital sódico Se observa que no hubo diferencias significativas con respecto al control, comportamiento parecido al de las benzodiacepinas, lo que si se observó fue que la desviación estándar fue grande comparada con el diazepam y el control, en lo que respecta al tiempo de sueño no existen diferencias significativas respecto al grupo blanco, con la dosis ensayada, lo que sugiere que el extracto de A. reticulata no tiene efecto depresor a nivel del sistema nervioso central, (Figura 5a y 5b).
El resultado macroscópico, (Figura 6a) indica que el grupo administrado con A. reticulata, no presenta inflamación, varices o abscesos que indiquen algún daño, el color que se aprecia es parecido al grupo control que solo se le administró solución salina. En el resultado por microscopia se observa congestión y tumefacción en el hígado dañado con acetaminofén, en cambio en A. reticulata, los daños disminuyeron, (Figura 6b).
Discusión y conclusiones
En el presente estudio se demuestra que el extracto etanólico de las hojas de A. reticulata posee propiedades como anticonvulsivo y antidepresivo como lo observado en el discernimiento con diferentes modelos experimentales.
En este estudio se evidenció que el extracto de las hojas de A. reticulata produce diversos efectos sobre el SNC semejantes a los reportados para otras especies de annona, de los que se han aislado principios activos como palmitona, 1,2-dimetoxi-5, 6, 6a,7-tetrahidro-4H-dibenzoquinolina-3,8,9,10-tetrol, anonaína, nornuciferina y liriodenina, es probable que el efecto del extracto sea debido alguna de éstas sustancias, los resultados que se presentan avalan el empleo del extracto etanólico de annona reticulata, se espera que se realicen más investigaciones sobre la extensa herbolaria mexicana, ya sea como medicamentos alternativos o complementarios.
Sin embargo; se debe considerar que, los productos herbolarios, pueden presentar efectos adversos, debido a los efectos depresores; por lo que debe tomarse con cautela la administración de los extractos, en la interacción con sustancias depresoras del SNC, ya que pueden presentarse efecto de antagonismo o sinergismo. Los resultados hepatotóxicos y de inducción del sueño, dan soporte para recomendar el uso del extracto.
En conclusión, éste discernimiento farmacológico de los efectos depresores en el SNC del extracto etanólico de las hojas de A. reticulata da evidencia preliminar de que esta especie de A. reticulata comparte las propiedades como anticonvulsivo y antidepresivo, igual que otras especies del género Annona.
