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Introducción
La degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) es una enfermedad neurodegenerativa de la retina, caracterizada por una disminución progresiva de la visión central. Representa la principal causa de pérdida visual en personas mayores de 50 años1.
La DMRE puede presentarse en dos formas clínicas bien diferenciadas, cada una con diferentes características patológicas. La DMRE atrófica no exudativa se caracteriza por una atrofia progresiva del epitelio pigmentario de la retina, de los fotorreceptores y de la coriocapilar. Por el contrario, en la forma neovascular, exudativa o húmeda de la DMRE (DMRE-NV), se ha desarrollado neovascularización coroidea (NVC) y tejido fibroso neovascular subretiniano debido a la fuga de líquido y lípidos dentro de la retina1,2.
La DMRE es una enfermedad multifactorial. Algunos de los factores de riesgo asociados son la edad, el tabaquismo, la exposición a la luz solar, la dieta y la genética. Diferentes estudios han demostrado el importante papel que juegan los factores genéticos en la fisiopatología de la DMRE3-5. Se han involucrado varios genes en diferentes vías biológicas, como las vías inmunes y del complemento (CFH, C2/CFB, CFI, C3, y C9), el transporte de lípidos (APOE, LIPC, CETP y BAIAP2L2), la remodelación de la matriz extracelular (COL8A1, COL10A1, TIMP3, ADAMTS9, TGFBR1, HTRA1 y B3GALTL) y la angiogénesis (VEGFA, TGFBR1, y ADAMTS9)6. El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es una de las principales citocinas involucradas en las vías de angiogénesis y NVC, presente en la DMRE-NV.
La familia de citocinas del VEGF incluye: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E y factor de crecimiento placentario (PGF). Estos factores son críticos para el desarrollo y mantenimiento de la función vascular normal, y afectan directamente la proliferación, supervivencia y migración de las células endoteliales. Respectivamente, cada isoforma del VEGF puede tener una función angiogénica o antiangiogénica. Con respecto al efecto angiogénico, VEGF-A es el mediador principal. La angiogénesis ocurre como resultado de varios estímulos, como la hipoxia tisular, el estrés por cizallamiento y el desarrollo de células tumorales; en consecuencia, mejorando la perfusión sanguínea7-9. Más recientemente, en diferentes poblaciones, se ha observado previamente la asociación entre ciertos polimorfismos del VEGF y su papel como factores de riesgo genéticos en la DMRE-NV10,11. Sin embargo, los resultados son controvertidos. Por ejemplo, el polimorfismo con rs833061 ubicado en la región promotora del gen VEGF, que se ha relacionado con una mayor actividad promotora12,13 y con incremento en el riesgo de presentar DMRE-NV en población étnica Tujia de China y en población polaca14. Por el contrario, otros estudios no han encontrado correlación con la susceptibilidad a la DMRE-NV en las poblaciones chinas de Taiwán, Han y de España15-17.
Existen más de 100 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) identificados en el gen VEGF hasta la fecha (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). Muchos de ellos están asociados con diferentes patrones de expresión de esta citocina, y comúnmente se denominan polimorfismos funcionales. En este estudio, consideramos 4 SNP funcionales en el gen VEGF que se encuentran en la región promotora (rs699947 A/C, rs833061 C/T, rs1005230 C/T y rs1570360 A/G) y dos en la región 5 no traducida (rs2010963 C/G y rs25648 C/T), que se han relacionado positivamente con la transcripción del gen VEGF15-22. Todo esto, con el propósito de establecer un patrón genético de una población mexicana, que podría determinar el riesgo de desarrollo de DMRE exudativa.
Pacientes y métodos
Pacientes
Un total de 105 pacientes que no estaban relacionados (44 hombres y 61 mujeres; edad, 74.28 ± 8.32 años) se incluyeron en el grupo de casos. Fueron diagnosticados con DMRE-NV en el Centro Médico Nacional de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Jal., México. Los criterios para clasificar a un paciente como caso fueron: examen oftalmológico con datos de DMRE-NV, líquido subretiniano, hemorragias y lípidos asociados con una membrana macular de color gris-marrón y hallazgos en la angiografía con fluorescencia retiniana de NVC. Los pacientes fueron excluidos si tenían diagnóstico de NVC secundaria a trauma o no asociada con la edad. Un total de 41 hombres y 61 mujeres con una edad promedio de 67.41 ± 5.78 años se incluyeron en el grupo control. Los criterios de inclusión para el grupo control fueron: examen oftalmológico sin datos sugestivos de DMRE-NV y edad superior a 60 años. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Centro de Retina Médica y Quirúrgica S.C., y cumplió los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado para el cribado genético de todos los sujetos (casos y controles).
Preparación de muestras y genotipado
Los SNP objetivo del gen VEGF-A se seleccionaron con base en su fuerte asociación con la DMRE-NV. Los SNP seleccionados se ubican en regiones no codificantes y promotoras del gen VEGF-A (locus 6p21.1): rs2010963 C/G y rs25648 C/T dentro de la región 5' no traducida y rs833061 C/T, rs699947 A/C, rs1570360 A/G y rs1005230 C/T, dentro de la región promotora. Las ubicaciones de estos polimorfismos son 5398, 6025, 4534, 3437 4878 y 3544, respectivamente (Assembly; GRCh38.p7, RefSeqGene, NG_008732.1; Gene ID, VEGFA 7422).
El ADN genómico se extrajo de sangre completa congelada purificada con el kit para ADN en sangre QIAamp de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). El genotipado de los SNP objetivo se realizó utilizando ensayos de genotipado de SNP TaqMan® validados (TaqMan: Applied Biosystems, Inc. [ABI], Foster City, CA). Los SNP se amplificaron utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con 0.5 μM de cebadores y Master Mix para genotipado de TaqMan (TaqMan: Applied Biosystems, Inc. [ABI], Foster City, CA) con 30 ng de ADN templado en la mezcla de amplificación (25 μl). La señal de fluorescencia de la sonda se detectó con el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, Inc. [ABI], Carlsbad, CA).
Cálculo del tamaño de la muestra y análisis estadísticos
La prevalencia de la DMRE aumenta con la edad y está influenciada por el origen étnico. La prevalencia puede ser tan baja como 2.5% en adultos blancos mayores de 50 años, hasta el 14% en adultos blancos mayores de 80 años. Por lo tanto, considerando un modelo genético dominante y asumiendo un 5% de frecuencia de alelos menores, 5% de prevalencia de la enfermedad, proporción 1:1 de casos y controles, y 5% de error tipo I y una OR esperada de 2 para el análisis de marcadores únicos, el número mínimo de casos requeridos para lograr un poder del 80% era de 90. Se utilizó el software estadístico IBM SPSS (versión 21.0, SPSS, Inc., Chicago, IL) para los análisis estadísticos. El equilibrio de Hardy-Weinberg se analizó utilizando frecuencias de genes obtenidas mediante un conteo simple de genes y la prueba de Chi cuadrado con corrección de Yates para comparar los valores observados y esperados. Las diferencias en las frecuencias de genotipo entre los casos y los controles se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher o mediante Chi cuadrado. Los haplotipos inferidos y el LD (desequilibrio del ligamiento) cuantificados entre los loci bialélicos se calcularon utilizando el software en línea SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPStats). La importancia de una asociación se determinó mediante análisis de tablas de contingencia utilizando Chi cuadrado o la prueba exacta de Fisher. La significancia se definió como un valor de p menor de 0.05.
Resultados
Frecuencias de alelos y genotipos
Todos los SNP se genotipificaron en todos los sujetos; las frecuencias se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg en ambos grupos. La diferencia entre las frecuencias alélicas no fue estadísticamente significativa en ninguno de los SNP analizados (Tabla 1).
Tabla 1 Frecuencia de alelos de SNP en los grupos control y con DMRE
| SNP/alelos | DMRE | Control | OR (IC 95%) | p | |
|---|---|---|---|---|---|
| n = 210 | n = 204 | ||||
| rs1570360 (E) | A/G | 49 (0.23) | 45 (0.22) | 1.0754 (0.678-1.703) | 0.75 |
| rs833061 (H) | C/T | 90 (0.43) | 84 (0.41) | 1.0714 (0.725-1.583) | 0.72 |
| rs2010963 (F) | C/G | 82 (0.39) | 78 (0.38) | 1.0349 (0.696-1.537) | 0.86 |
| rs25648 (K) | C/T | 176 (0.84) | 164 (0.8) | 1.2626 (0.762-2.090) | 0.36 |
| rs699947 (I) | A/C | 85 (0.4) | 86 (0.42) | 0.933 (0.630-1.379) | 0.72 |
| rs1005230 (J) | C/T | 125 (0.6) | 121 (0.59) | 1.0088 (0.681-1.493) | 1 |
DMRE: degeneración macular relacionada con la edad; IC: intervalo de confianza; OR: odds ratio; SNP: polimorfismo de un solo nucleótido.
Fuente: RefSeqGene, NG_008732.1; Gene ID, VEGFA (7422), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg/
Las frecuencias genotipificadas se compararon aplicando los modelos codominante, dominante y recesivo. Ninguno de los modelos de herencia mostró una asociación estadísticamente significativa en el grupo de DMRE-NV en comparación con el grupo control (Tabla 2).
Tabla 2 Frecuencia de genotipos en polimorfismos de un solo nucleótido del VEGF
| Posición del gen | SNP | SNP posición | Ubicación del SNP | Genotipos | DMRE | Control | p |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| n = 105 | n = 102 | ||||||
| 6p21.1 | rs833061 | 4534 | región promotora | C/T | 54 (0.51) | 48 (0.47) | 0.8 |
| C/C | 18 (0.17) | 18 (0.18) | |||||
| T/T | 33 (0.31) | 36 (0.35) | |||||
| rs699947 | 3437 | región promotora | A/C | 55 (0.52) | 46 (0.45) | 0.47 | |
| A/A | 15 (0.14) | 20 (0.2) | |||||
| C/C | 35 (0.33) | 36 (0.35) | |||||
| rs1005230 | 3544 | región promotora | C/T | 55 (0.52) | 47 (0.46) | 0.63 | |
| C/C | 35 (0.33) | 37 (0.36) | |||||
| T/T | 15 (0.14) | 18 (0.18) | |||||
| rs1570360 | 4878 | región promotora | A/G | 37 (0.35) | 37 (0.36) | 0.83 | |
| A/A | 6 (0.06) | 4 (0.04) | |||||
| G/G | 62 (0.59) | 61 (0.6) | |||||
| rs2010963 | 5398 | UTR 5 | C/G | 50 (0.48) | 48 (0.47) | 0.98 | |
| C/C | 16 (0.15) | 15 (0.15) | |||||
| G/G | 39 (0.37) | 39 (0.38) | |||||
| rs25648 | 6025 | UTR 5 | C/T | 24 (0.23) | 36 (0.35) | 0.096 | |
| C/C | 76 (0.72) | 64 (0.63) | |||||
| T/T | 5 (0.05) | 2 (0.02) |
DMRE: degeneración macular relacionada con la edad; IC: intervalo de confianza; OR: odds ratio; SNP: polimorfismo de un solo nucleótido; UTR: región no traducida; VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial.
Fuente:RefSeqGene, NG_008732.1; Gene ID, VEGFA (7422), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg/
Análisis de haplotipos
Todos los SNP etiqueta se ubicaron en un bloque de haplotipos, y la magnitud del LD entre los loci bialélicos fue muy alta, con una D pareada = 0.8205. Las frecuencias de haplotipo de los SNP analizados se muestran en la tabla 3. Los SNP etiqueta no fueron estadísticamente significativos.
Tabla 3 Frecuencias de haplotipos de los SNP etiqueta en el gen VEGF entre los sujetos con DMRE y control
| SNP etiqueta | Total | DMRE | Control | OR (IC 95%) | p | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| rs1570360 | rs2010963 | rs833061 | rs699947 | rs1005230 | rs25648 | |||||
| G | C | T | C | C | C | 0.369 | 0.3905 | 0.3701 | 1 | - |
| A | G | C | A | T | C | 0.2263 | 0.2227 | 0.2156 | 0.97 (0.57-1.64) | 0.91 |
| G | G | T | C | C | C | 0.187 | 0.171 | 0.1933 | 1.18 (0.67-2.07) | 0.58 |
| G | G | C | A | T | T | 0.1543 | 0.1375 | 0.1713 | 1.20 (0.67-2.13) | 0.54 |
| G | G | C | A | T | C | 0.0195 | 0.034 | 0.0048 | 0.16 (0.02-1.43) | 0.1 |
| G | G | C | C | C | C | 0.0121 | 0.02 | 0.0049 | 0.28 (0.02-3.25) | 0.31 |
DMRE: degeneración macular relacionada con la edad; SNP: polimorfismo de un solo nucleótido; VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial.
Discusión
El gen VEGF-A humano se encuentra en la región cromosómica 6p21.1. Se generan varias isoformas mediante splicing alternativo que produce proteínas de 121, 145, 162, 165, 183, 189 y 206 aminoácidos con diferencias en sus propiedades. Cada tejido expresa diferentes proporciones de las isoformas de VEGF dependiendo de sus necesidades específicas. La isoforma VEGF-165 es la que se ha observado con más frecuencia en el ojo humano23-25.
Su papel en la NVC se ha demostrado claramente9. Por ejemplo, se ha demostrado un aumento de la expresión de VEGF en el ojo en modelos animales26-29.
Se están investigando varios factores genéticos relacionados con el control de la expresión de VEGF por su papel en la patogénesis de DMRE-NV. Se observó que los factores potenciadores de los miocitos 2 (MEF2) activan la expresión transcripcional del VEGF a través de ligando tipo Delta 4 (Dll4) durante la angiogénesis30. Otro estudio mostró que un coactivador transcripcional (PGC-1α) es capaz de regular la expresión de VEGF-A en la retina31. Sin embargo, los vínculos moleculares entre las señales proangiogénicas y la fisiopatología de la DMRE-NV son aún limitados.
Estudios previos sobre la asociación de SNP del gen VEGF-A con la DMRE-NV mostraron resultados divergentes en diferentes poblaciones. El polimorfismo con rs833061 ubicado en la región promotora del gen VEGF, que se ha relacionado con un incremento de la actividad promotora12,13, ha sido analizado en estudios previos que sugirieron que la DMRE-NV tiene una correlación débil con este SNP en un grupo de chinos Tujia y en una población polaca14. Por el contrario, otros estudios no han encontrado correlación con la susceptibilidad a la DMRE-NV en las poblaciones chinas de Taiwán, Han y de España15-17.
El polimorfismo rs699947 ubicado en la región promotora del gen VEGF ha mostrado asociación con una mayor producción de VEGF18. En un estudio de cohorte en población coreana, la presencia del alelo principal se asoció con una buena respuesta visual a la terapia anti-VEGF debido a su menor producción de VEGF32. Por un lado, varios estudios no han mostrado asociación entre SNP y la DMRE-NV en la población de Países Bajos, China de Taiwán, Finlandia, Japón, España y Turquía15,17,19-22. Por otro lado, en una población de Pakistán se ha demostrado una asociación de riesgo entre el polimorfismo y la morbilidad de la DMRE-NV33. Sin embargo, nuestros datos son consistentes con los hallazgos reportados en la mayoría de las poblaciones.
Aunque rs2010963 es un polimorfismo funcional asociado con niveles elevados de VEGF-A en suero y vítreo en la retina humana34,35, no se ha demostrado una asociación farmacogenética con la respuesta a los agentes anti-VEGF en diferentes poblaciones36,37. Además, la asociación entre este polimorfismo y la DMRE-NV no se ha demostrado claramente, existen discrepancias entre poblaciones como la china, la japonesa y la taiwanesa, donde no existe una asociación significativa, y la polaca, donde sí se ha observado dicha asociación14-16,21.
El polimorfismo rs25648 se ha estudiado en patologías en las que la angiogénesis juega un papel importante, como el cáncer de vejiga, que muestra un aumento significativo en el riesgo de desarrollarlo38. Sin embargo, en este estudio no se demostró que haya una asociación con la DMRE-NV en nuestra población. Además, este polimorfismo en la DMRE-NV no se ha estudiado claramente. En un estudio que incluyó población caucásica, no se encontró una asociación39.
Existe información consistente sobre la correlación del SNP rs1570360 con enfermedades vasculares como el accidente cerebrovascular y la hipertensión40,41 y su actividad, con mayor producción de VEGF-A13. En nuestra población, así como en la población japonesa y holandesa, no hay asociación entre el polimorfismo y la susceptibilidad de DMRE-NV19,21. Del mismo modo, no se ha encontrado ninguna asociación del polimorfismo rs1005230 con la DMRE-NV, ni se ha demostrado que mejore la respuesta al tratamiento anti-VEGF en pacientes con DMRE-NV42.
Hasta la fecha, todavía existe información contrastante sobre la asociación de polimorfismos del gen VEGF con la DMRE-NV en diferentes poblaciones. Aunque algunos estudios han encontrado una asociación de riesgo, en la población mexicana se demostró que no existe asociación con ninguno de los SNP estudiados. Sin embargo, estos hallazgos estadísticamente no significativos podrían estar relacionados con el tamaño de la muestra. De hecho, la principal limitación de nuestro estudio es el reducido número de sujetos incluidos. Por lo tanto, es necesario expandir la muestra para estimar con precisión las asociaciones de riesgo.
Conclusión
No se observó una asociación entre los SNP estudiados y la presencia de DMRE-NV en la población mexicana analizada. Estos hallazgos concuerdan con informes previos evaluados en poblaciones de los Países Bajos, Taiwán, China, Finlandia, Japón, España y Turquía. Consideramos que es necesario realizar análisis en muestras más grandes para confirmar estos hallazgos.
