INTRODUCCIÓN

Los sistemas de producción pecuarios, desarrollan formulaciones dietéticas empleando aditivos alimenticios que tienen potencial de modificar el entorno ruminal mejorando o inhibiendo poblaciones microbianas específicas, se han utilizado probióticos para mejorar la microbiota del rumen, la cual es responsable de la degradación de celulosa y hemicelulosa, que permite a los rumiantes se alimenten del consumo de pastos y forrajes, además los probióticos se pueden usar para modular la fermentación del rumen y la microbiota nativa, ya que son una fuente de microorganismos potencialmente útiles (^{Fraga et al., 2014}).

Los probióticos microbianos (Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum y Bacillus subtilis) utilizados en rumiantes mejoran la ingesta de materia seca y la productividad, la levadura S. cerevisiae es importante y se sabe que su inclusión en las dietas mejora la utilización de forrajes de mala calidad (^{Shriver-Munsch et al., 2011}; ^{Khattab et al., 2020}), aumenta la digestibilidad de la fibra y estabiliza el pH del rumen (^{Moallem et al., 2009}; ^{Degirmencioglu et al., 2013}; ^{Meller et al., 2014}; ^{Khattab et al., 2020}).

Lactobacillus plantarum mejora la ingesta de nutrientes, el rendimiento del crecimiento y la fermentación ruminal en corderos (^{Izuddin et al., 2019}; ^{Khattab et al., 2020}). ^{Qiao et al. (2010)} mencionaron que B. subtilis en corderos redujo la incidencia de diarrea, aumentó la ingesta de materia seca y ganancia diaria de peso antes del destete. Los probióticos influyen en el tracto intestinal con la simbiosis de bacterias beneficiosas, sobre la salud del huésped que también puede implicar la estimulación del crecimiento y contribuyen a una mayor productividad (^{Markowiak & Ślizewska, 2018}).

La concentración de las poblaciones microbianas que viven en el rumen en anaerobiosis, específicamente para bacterias, protozoarios y hongos son de 10¹⁰ células/mL, 10⁶ células/mL y 10⁴ células/mL respectivamente (^{Jouany, 1994}; ^{Cardona-Iglesias et al., 2017}). Para permitir que los organismos de crecimiento lento; tales como los hongos y protozoarios ruminales puedan reproducirse, se necesita permanencia prolongada del alimento dentro del rumen por periodos de 48 a 72 horas y sostener así la concentración de las poblaciones microbianas (^{McAllister et al., 1994}, ^{Gharechahi et al., 2021}). ^{Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez (2019}), ^{Castillo-Lopez et al. (2014)} y ^{Petri et al. (2012}) reportan que mediante la utilización de la secuenciación de ADN de alto rendimiento han revelado la presencia de 13 principales filos bacterianos en el rumen, que incluyen 40 órdenes bacterianos, alrededor de 80 clases de bacterias, y por lo menos 180 familias bacterianas, unos 320 géneros de bacterias y más de 2,000 unidades taxonómicas bacterianas operativas. La densidad bacteriana en el rumen se encuentra en el rango de 10⁷ a 10¹⁰ células/mL de líquido ruminal (^{McAllister et al., 1994}, ^{Gharechahi et al., 2021}). ^{Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez (2019)}, ^{Castillo-Lopez et al. (2014)} y ^{Petri et al. (2012)} El género de bacterias ruminales más abundantes es de Prevotella, que representa el 20% de la comunidad bacteriana (^{Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez, 2019}).

Si bien el número de géneros de protozoarios es menor que el de las bacterias, los protozoarios son físicamente más grandes que estas y pueden constituir aproximadamente la mitad de la biomasa microbiana ruminal total. De los protozoarios se han identificado más de 20 especies cuya concentración en el rumen es de aproximadamente 10⁶ células/mL de líquido ruminal (^{Martin, 1994}; ^{Bodas et al., 2012}; ^{Castillo-Lopez & Domínguez-Ordóñez, 2019}).

Fibrobacter succinogenes es una especie dominante en el sistema gastrointestinal de los animales herbívoros, se caracteriza por ser una bacteria Gram negativa, anaeróbica y con capacidad de degradar la fibra y en mayor cantidad (^{Kobayashi, 2006}; ^{Jun et al., 2007}). Esta bacteria, que también es una de las dos únicas especies cultivadas, es degradadora eficiente de la celulosa. Específicamente, tiene una actividad particularmente alta contra la celulosa cristalina que requiere un contacto físico cercano con este sustrato (^{Suen et al., 2011}). Por lo tanto, el objetivo fue identificar y evaluar por conteo y PCR punto final bacterias y protozoarios ruminales presentes en ovinos suplementados con biopreparado de microorganismos (PNC) vs probiótico comercial REVET® (PCRE) a diferentes concentraciones.

MATERIAL Y MÉTODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las bacterias, protozoos y hongos que conforman el ecosistema ruminal difieren en sus requerimientos de nutrientes y en su metabolismo (^{Bach et al., 2005}; ^{Rodríguez et al., 2007}; ^{Matthews et al., 2018}). Las bacterias del rumen anaeróbico, los protozoos y los hongos degradan el material fibroso, lo que permite a los rumiantes utilizar la fibra vegetal para su nutrición (Rodríguez et al., 2007). Las bacterias son los microorganismos más numerosos y al igual que las anteriores, juegan un papel importante en la degradación biológica de la fibra dietética, Rodríguez et al. (2012) plantean que son muchas las bacterias y levaduras que se pueden usar de forma benéfica para mantener una flora digestiva sana y en equilibrio.

En el cuadro 3 se observan los resultados del conteo de protozoarios realizados cada seis horas y donde se observa que el tratamiento PCRE al 100% presenta los valores menores en el tiempo cero (7.5x10³ células/mL), cuando en general el promedio es 10⁵ células/mL.

En el cuadro 4 y 5 se presentan los resultados del análisis estadístico en el que se muestra que la comparación entre tratamientos es significativa (P<0.05), no así entre tiempos de conteo (P>0.05).

Los contrastes de pruebas entre tratamientos muestran que el tratamiento PNC al 100%, es diferente (P<0.05) a su contraparte PCRE al 100%, al PNC al 66% es diferente (P<0.05) al PCRE al 100 y 66% (P=0.055) y el PNC al 33% es diferente (P>0.057) al PCRE al 100 y 66% (P<0.05), así como PCRE 100% fue diferente (P>0.05) al testigo.

La prueba chi-cuadrada para la cantidad de protozoarios en los tratamientos PNC vs PCRE en concentración 66% de la dosis recomendada. No evidenció una cantidad mayor de protozoarios en los PNC, aunque se observa un crecimiento más favorable con respecto al PCRE al 66% una P<0.0556. En los tratamientos PNC vs PCRE en concentración 33% no observó diferencia estadísticamente significativa entre los conteos de protozoarios de los tratamientos al 33% de PNC y PCRE (P<0.05).

El conteo de bacterias se realizó cada 6 horas en ocho intervalos de tiempo obteniendo concentraciones promedio de 10⁶ células/mL en la mayoría de los tiempos y tratamientos, siendo el tratamiento PNC al 66% quien presentó la mayor concentración de bacterias (1.49x10⁷ células/mL), mientras que en el tiempo de 30 horas se identificó la menor concentración en los diferentes tratamientos (Cuadro 6).

En el trabajo realizado por ^{Uchida et al. (1987)} reportaron que un solo protozoario puede tomar hasta 10⁴ bacterias por hora. Estas estimaciones indican que la depredación de los protozoarios puede renovar toda la biomasa bacteriana en el rumen con alta densidad de protozoarios (10⁵ a 10⁶). Los ovinos suplementados con PNC y PCRE se ven beneficiados en las poblaciones de protozoarios y bacterias.

En el cuadro 7 y 8 se presenta la prueba chi cuadrada en el cual se observa que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los conteos de bacterias con las diferentes dosis estudiadas de PNC vs PCRE (P<0.05). La única comparación que mostró diferencias entre PNC 100% vs PCRE 66%, siendo mayores en PCRE 66%.

Los ovinos suplementados con PNC y PCRE se ven beneficiados en las poblaciones de protozoarios y bacterias. Según ^{Williams & Coleman (2012)} los tiempos de multiplicación para los protozoarios varían de 5-14 horas, coincidiendo con los tiempos de concentraciones en el PCRE las máximas poblaciones se presentaron a las 12 horas al 66% y a las 18 horas con el 33%, por su parte ^{Jouany (1994)} y ^{Williams & Coleman (2012)} encontraron que varias especies de protozoarios ruminales poseen alfa amilasa y uno de los que presentan mayor actividad amilolítica de este tipo es el Entodinium caudatum, así mismo, ^{Mould & Thomas (1958)} y ^{Arcos-García et al., (2007)}, encontraron alfa y beta amilasa en protozoarios holotricos que promueven el desdoblamiento de las unidades de azúcar de reserva y estructurales de las plantas.

En la parte nutricional los probióticos y las enterobacterias compiten por los aminoácidos esenciales y azúcares, reducen la producción de aminas tóxicas, esto es remediado con los Lactobacillus acidófilos importante al estado de salud del animal (^{Castillo-Lopez et al., 2013}). La densidad bacteriana en el rumen 107 y 1010 células de líquido ruminal, los filos de bacteroides más abundantes incluyen el 75% de la población bacteriana total (^{Castillo Lopez & Domínguez-Ordóñez, 2019}).

Los probióticos no comerciales (PNC) puede ser una alternativa para complementar la dieta de ovinos en crecimiento, es necesario indicar que los PNC en ovinos pudieran ser usados para optimizar la producción en la dieta integral de los animales, sin causar impacto negativo sobre la ecología lo que pueden lograr a través del suministro directo de PNC y PCRE.

Respecto a las concentraciones de ADN registradas para el tratamiento testigo, se obtuvo una concentración promedio de 58.36 ng/µL teniendo como mínimo un valor de 28 ng/µL y un valor de 100 ng/µL. En el cuadro 9 se observa cada una de las concentraciones obtenidas, así como la relación 260/280, que indica que la pureza del ADN es adecuada para protocolos de PCR.

En los ovinos suplementados con PNC se obtuvo ADN genómico en las siguientes concentraciones promedio 77.6 ng/µL, 69.7 ng/µL y 70.18 ng/µL, en los tratamientos de 100%, 66% y 33% respectivamente (Cuadro 9). Las concentraciones de ADN obtenido de microorganismos del líquido ruminal de ovinos suplementados con PCRE con los siguientes promedios: en 100% 46.81 ng/mL, en 66% de 46.09 ng/mL y en 33% de 36.36 ng/mL.

La diversidad de bacterias totales en el rumen es importante durante la degradación del alimento y fermentación, ya que esto permite tener una amplia variedad de enzimas, así como reacciones bioquímicas precisas que ayuden a hidrolizar el material vegetal a estructuras más simples y puedan tener mayor disponibilidad para los microorganismos y aumentar los productos de fermentación (^{López et al., 2020}).

Con respecto a las bacterias totales, la banda de amplificación por PCR corresponde a 130 pb, lográndose identificar esta banda característica en el gel testigo, el cual corresponde a la figura 1 (A). De acuerdo con estos resultados se puede mencionar que el probiótico con mejor efecto de adaptación de las bacterias totales fue el PNC, ya que este permitió que la microbiota de bacterias continuará creciendo en el rumen y por lo tanto, no afectará la degradación del alimento y fermentación ruminal.

Las bacterias del rumen participan en la degradación de celulosa, esta especie presenta más de 100 secuencias que codifican para enzimas que degradan polisacáridos (^{Morrison et al., 2003}; ^{Jun et al., 2007}; ^{Firkins, 2021}), la mayoría son responsables de la degradación de sustratos celulosos, además estas bacterias degradan xilano, hemicelulosa y los monosacáridos de las paredes de las plantas (^{Mirón, 1991}; ^{Hobson & Stewart, 2012}).

Se demostró que el PCRE tiene un efecto inhibitorio sobre Fibrobacter succinogenes en una concentración de 100%, ya que no se observa la banda específica para el oligonucleótido (121 pb) en comparación con el testigo como se observa en la figura 1 (H), sin embargo, para las concentraciones de 66 y 33% esta banda si está presente (Figura 1, J, K).

Figura 1 Amplificación de banda por PCR. Carril 1, Marcador de peso molecular (250 a 10,000 pb); rango del MP Carril 2, M1 (0 días); Carril 3, M2 (30 días); Carril 4 al 11, M3 (60 días -6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 h-); Carril 12, M4 (110 días). Bacterias totales (A, B, C, D, E, F, G), Fibrobacter succinogenes (H, I, J, K, L, M, N) y hongos anaerobios (O, P, Q, R, S, T, U) en cada uno de los tratamientos (Testigo, 100%, 66% y 33%) con probiótico comercial (PCRE) y probiótico no comercial (PNC).  

Los hongos anaerobios ruminales desempeñan un papel estratégico en la digestión de alimentos fibrosos, ya que presentan una gran habilidad para colonizar paredes de celulosa lignificada y para debilitar los tejidos fibrosos de las plantas, así como la degradación de los componentes estructurales de su pared celular (^{Galindo et al., 2017}). Para los hongos anaerobios (120 pb), estos no se vieron afectados con la suplementación del probiótico en ninguna de sus concentraciones (Figura 1, P, Q, R, S, T, U).

El efecto de los probióticos parece estar relacionado con los mecanismos y procesos metabólicos llevados a cabo por los microorganismos que participan en la fermentación ruminal y formación de metano, ^{Rodríguez et al. (2013)} plantean que son muchas las bacterias y levaduras que se pueden usar de forma benéfica para mantener una flora digestiva sana y en equilibrio. Los microorganismos más usados son Lactobacillus sp., Sreptococcus faeccium, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. stearothermophyllus y S. cerevisiae.

Los Lactobacillus crecen rápidamente en el intestino, son quizá los más conocidos, se trata de bacterias que pueden transformar la lactosa en ácido láctico. Este aumento de ácido láctico disminuye el pH intestinal, lo cual afecta la supervivencia de microorganismos no benéficos para la flora ruminal, patógenos, entre otros.

CONCLUSIONES

El probiótico no comercial puede ser una alternativa para complementar la dieta de los ovinos en crecimiento en la región del cañón de Juchipila, Zacatecas, México, por generar un incremento de bacterias y protozoarios. Los probióticos son un aditivo que se puede utilizar con éxito ya que no modificó la población de bacterias totales y hongos anaerobios en el rumen.