INTRODUCCIÓN

Las zoonosis involucran varias enfermedades que representan un problema mundial significativo que afecta a la salud humana y animal (García et al., 2013). Dichas enfermedades incluyen Ehrlichiosis, Anaplasmosis y Rickettsiosis que son causadas por una bacteria gramnegativa la cual se caracteriza por un crecimiento intracelular obligado (género Rickettsia, familia Rickettsiaceae; género Ehrlichia y Anaplasma, familia Anaplasmataceae). Estos se transmiten principalmente por ectoparásitos, incluida la garrapata Riphicephalus sanguineus, o garrapata marrón del perro, que afecta a los vertebrados terrestre (^{Parola et al., 2009}; ^{Alvarez, 2017}). Varios estudios han demostrado que estos ectoparásitos actúan como vectores de agentes zoonóticos como Erlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii (^{Gaunt et al., 2010}).

E. canis causa una enfermedad zoonótica en perros, gatos y roedores; el humano es una víctima accidental después de ser picado por la garrapata Rhipicephalus alojada en estos animales. Después de la infección, el microorganismo se incuba durante 1-2 semanas y entra en los vasos sanguíneos y linfáticos; luego, viaja al bazo, hígado y ganglios linfáticos para multiplicarse por fusión binaria y extenderse a otros órganos del cuerpo (^{Castro et al., 2004}).

E. canis se considera una bacteria de distribución cosmopolita. En México, fue descrita por primera vez en 1996 y clasificada como endémica porque se ha reportado en todo el país, pero principalmente en estados del noroeste como Sonora y Sinaloa. En Sonora, E. canis se considera una emergencia sanitaria y un problema de salud pública cada vez mayor. Desde 2002 se han reportado más de 600 casos, la gran mayoría en municipios del norte del estado (^{Álvarez, 2017}; ^{Sosa et al., 2013}).

Los signos clínicos de la fase aguda de la enfermedad son alteraciones hematológicas, leucopenia, trombocitopenia y anemia leve a moderada; la fase crónica se caracteriza por trombocitopenia, epistaxis, nefropatía, disnea, hepatomegalia, esplenomegalia o linfadenopatía, meningitis inflamatoria o hemorrágica, entre otras (^{Ismail et al., 2010}).

A. platys se distribuye en todo el mundo y también es transmitida por las garrapatas R. sanguineus. Se describió por primera vez en 1978 en perros de Estados Unidos (^{Sánchez & Tesouro, 2001}). Esta bacteria pertenece al género Anaplasma (^{Ábrego et al., 2009}). Causa trombocitopenia cíclica infecciosa canina. La enfermedad puede presentarse con fiebre, anorexia, petequias, uveítis, linfadenopatía generalizada, leucopenia, anemia moderada y especialmente trombocitopenia, que ocurren en episodios de 3-4 días a intervalos de 7-21 días, lo que eventualmente conduce a trombocitopenia crónica con recuperación lenta (^{Cicuttin et al. 2014}).

Actualmente se ha detectado A. platys con baja incidencia en los estados de Coahuila, Durango y Sonora (^{Almazán et al., 2016}; ^{Murrieta et al., 2017}). Como enfermedad zoonótica, ^{Arraga et al. (2014}) reportaron dos mujeres en Venezuela que estuvieron expuestas a R. sanguineus. Posteriormente se observaron cuerpos de inclusión intraplaquetarios sugestivos de A. platys en frotis y se amplificó y secuenció el ADN de

A. platys a partir de sangre completa, aunque el tratamiento con doxiciclina no alivió sus síntomas. Estos casos brindan apoyo adicional para A. platys como patógeno zoonótico transmitido por garrapatas, muy probablemente de baja patogenicidad; sin embargo, no se ha confirmado la causa de la enfermedad de A. platys en humanos. R. rickettsii es el principal agente de fiebre maculosa en las Américas; Se han reportado casos en los EE. UU., Canadá, México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Brasil y Argentina (^{López et al., 2007}; ^{Herrero et al., 2010}; ^{Lebruna et al., 2011}), con una alta tasa de mortalidad debido a la detección tardía del patógeno (^{Oteo et al., 2014}). Se considera que México cuenta con las condiciones ideales para el ciclo de transmisión de la enfermedad, comúnmente asociada a las condiciones de vida (pobreza) ya que la mayoría de los casos presentados han sido detectados en zonas marginadas y rurales de México (^{Peniche et al., 2015}). Estudios recientes demostraron la presencia de Rickettsia spp. en garrapatas del estado de Sonora por técnica de PCR (^{Foley et al., 2019}).

Estos patógenos podrían estar presentes previamente en la garrapata, provocando coinfecciones simultáneas en el huésped (es decir, se puede transmitir más de un agente), lo que provocará la enfermedad al mismo tiempo. Esto puede resultar en la manifestación de signos clínicos, de forma más severa e inespecífica, siendo una desventaja para el diagnóstico clínico por parte de los médicos humanos y veterinarios que atienden estos casos (^{Alleman & Wamsley, 2008}; ^{Mutz et al., 2009}).

Considerando la importancia zoonótica de estas enfermedades, y que no se han reportado estudios previos en el municipio de Cajeme, Sonora, la presencia de vectores de E. canis, A. platys y R. rickettsii en perros domésticos del municipio son sugestivos a la presencia de estas enfermedades zoonóticas. Por tanto, el objetivo fue la identificación molecular de las especies E. canis, A. platys y R. rickettsii para determinar su coinfección en perros domésticos del municipio de Cajeme, Sonora.

MATERIAL Y MÉTODOS

RESULTADOS

Se observó por medio de electroforesis, una buena integridad de las moléculas de ADN bacteriano extraído, con una cuantificación por espectrofotometría de 248.32 ng/µl en las muestras y una pureza con la relación 260-280 en promedio de 1.85, partiendo de sangre entera con EDTA.

Para la técnica de PCR se utilizó una concentración de 0.5 ng/µl de cada gblocks como controles positivos, obteniendo los pb correspondientes de cada agente, logrando una buena eficiencia y rapidez para la estandarización molecular con las condiciones específicas de cada agente patógeno.

El número de casos positivos y la frecuencia de Ehrlichis spp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia spp. obtenidos del análisis molecular de muestras de sangre canina (n=170) se describen en la Tabla 2. De las 92 muestras que dieron positivo para Ehrlichia spp. Se encontraron 12 coinfecciones (Tabla 3) de Ehrlichia canis con Anaplasma platys (Género EA) (13%).

Además, se realizó la secuenciación de una muestra de cada positivo para las diferentes especies de microorganismos analizados, obteniendo cromatogramas puros los cuales fueron analizados con el programa SanpGene Viewer. El análisis de las secuencias en el programa BLASTn (Centro Nacional de Información Biotecnológica) detectó una similitud entre el 99 y el 100% con las secuencias reportadas previamente.

DISCUSIÓN

Los microorganismos del orden Rickettsiales presentan condiciones zoonóticas denominadas Rickettsiosis, Ehrlichiosis y Anaplasmosis que se deben a varios patógenos de importancia veterinaria que han ganado terreno no solo en nuestra región sino también a nivel mundial (^{Rodríguez et al. 2016}), esto se debe principalmente a su vector Rhipicephalus sanguineus, siendo la especie de garrapata más reportada y con mayor distribución geográfica (^{Sosa et al., 2016}; ^{Cabezas-Cruz et al., 2019}). Estos patógenos van en aumento debido a la actividad del ser humano que ha generado cambios radicales en el medio ambiente, favoreciendo las enfermedades transmitidas por vectores (^{Suthers, 2004}) y aumentando su prevalencia a finales de primavera y verano debido a que estos ectoparásitos aumentan su actividad en las altas temperaturas ambientales durante estas estaciones del año, inoculando más rápidamente los hemoparásitos mencionados (^{Parola et al., 2009}), siendo necesaria la estandarización de técnicas precisas para la detección de estos microorganismos zoonóticos del orden Rickettsiales en las regiones Tropicales y Subtropicales.

Actualmente, el uso de fragmentos del gen gBlocks como controles positivos utilizados en este estudio se ha vuelto popular como estándares y positivos sintéticos para la detección de microorganismos bacterianos. Actualmente se reportaron datos similares en Barcelona donde se utilizaron este tipo de fragmentos para la detección de E. coli, E. faecalis y Legionella pneumiphilia (^{Cardenas, 2018}); además, en Australia dichos fragmentos se utilizaron como estándares en la detección por PCR multiplex de Taenia spp. (^{Ng-Nguyen et al., 2017}) Por lo tanto, se recomienda el uso de gBlocks para la estandarización de PCR ya que aumentó la velocidad del bioensayo en la detección debido a la falta de disponibilidad de aislados biológicos.

El estudio fue el primer trabajo mediante PCR para detectar las especies Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsi en muestras de sangre de perros en el municipio de Cajeme y en Sonora, permitiendo conocer la distribución geográfica ampliada de los tres patógenos en el estado. El porcentaje de 54% a al menos un agente patógeno en nuestro estudio concuerda con investigaciones realizadas con herramientas moleculares en algunos países de América del Sur y Central, donde Brasil reportó 69% (^{Tanikawa et al., 2013}), Nicaragua 80% (^{Wei et al., 2014}), Panamá 70,6% (^{Santamaria et al., 2014}), Costa Rica 45% (^{Rojas et al., 2015}) y El Salvador 60% (^{Miranda et al., 2018}). Nuestro porcentaje de prevalencia difirió al compararlo con porcentajes altos de otros países, probablemente por trabajar con perros sin dueño y por estar más en contacto con el vector de las enfermedades al estar asociado a condiciones de vida en zonas marginadas (^{Peniche et al., 2015}). Se ha reportado prevalencia a hemoparásitos en algunos otros estados de México, donde Sinaloa reporta 74.3% (^{Sosa-Gutiérrez et al., 2013}), Coahuila y Durango 41% (^{Almazán et al., 2016}), Yucatán 69% (^{Díaz et al., 2016}), Chihuahua 40% (^{Escárcega et al., 2018}) y Sonora 33% (^{Murrieta et al., 2017}). Como se mencionó anteriormente, Cajeme presentó el 57% de la infección, posicionando a Sonora en este momento como uno de los principales estados con mayor incidencia en las regiones tropicales y subtropicales donde están presentes los parásitos y el vector.

Con respecto al porcentaje de presencia de cada hemoparásito, evidencio nuestro estudio una prevalencia mayor de E. Canis a lo reportado en México (28%), ya que en otro estudio de Sonora en el municipio de San Luis Rio Colorado, se encontró del 8% de infección para E. Canis en muestras sanguíneas de 235 perros (^{Murrieta et al., 2017}), en el Estado de Coahuila y Durango 10% en una población de 100 perros sanos infestados con garrapatas (^{Almazán et al., 2016}). En Yucatán se determinó el 36% en una población de 50 perros (10 perros domésticos y 40 en un centro de control de animales), en donde todos los perros positivos fueron de muestras recolectadas del refugio de animales, lo que representa una prevalencia, para este sitio de muestreo del 45% (^{Path et al., 2015}). También existes hallazgo en otros países como Buenos Aires, Argentina, en donde los resultados fueron de igual manera inferiores en una población de 223 perros, obteniendo el 6.7% de positivos a E. Canis (^{Cicuttin, 2016}), Uruguay es uno de los pocos países en los cuales reporta presencia de otros hemoparásitos, pero no la presencia de E. Canis en una población de 191 perros (^{Carvalho, 2017}). En contraste con Brasil, el porcentaje de nuestro estudio es menor, en donde trabajaron con 472 perros en el noreste brasilero encontraron el 34.5% de los perros positivos (^{Silva et al., 2010}), siendo superior a nuestros resultados. Colombia representa la mayor zona de alta prevalencia revisada sobre E. canis en sus municipios de Palmira (92.8%) y Cartago (90%) (^{Rojas et al., 2013}). No obstante, cabe mencionar que dicho trabajo se realizó en perros callejeros a diferencia de nuestro estudio.

La presencia de Anaplasma platys (11%) en nuestro estudio, resultó ser superiores a los reportados en Buenos Aires, Argentina de 223 perros, siendo positivos para A. platys el 7.2% (^{Cicuttin, 2016}). En Uruguay de 191 perros resultaron positivos el 4.2% (^{Carvalho, 2017}). También en San Luis Rio Colorado, Sonora en 235 muestras caninas fueron positivas para el 18% (^{Murrieta et al., 2017}). Otras publicaciones muestran valores similares a Costa Rica con el 10% (^{Wei et al., 2014}), Nicaragua el 13% (^{Rojas et al., 2014}), Cuba el 16% (^{Silva et al., 2016}) y el Salvador con 17% (^{Murrieta, 2017}), pero resultaron ser inferior con respecto a Panamá con el 21.3%. En Brasil, en una población de 100 perros, se obtuvo mayor prevalencia para Anaplasma platys con el 21% y 9% para Ehrlichia, siendo uno de los pocos estudios que difiere en nuestros resultados, ya que, en nuestro trabajo y la mayoría de las investigaciones realizadas en centro y Sudamérica, reportan una menor incidencia de A. Platys que de E. canis.

El diagnóstico molecular en nuestra investigación de hemoparásitos relacionados a Ehrlichia y Anaplasma han sido sencillo de identificar a diferencia de la bacteria Rickettsia rickettsii con la técnica de PCR a partir de muestras sanguíneas en caninos. Nuestro porcentaje de prevalencia a este agente fuel el menor (0.8%) a comparación de E. canis y A. platys, esto puede deberse a que típicamente se menciona que circula un bajo número de rickettsias en la sangre en ausencia de enfermedad avanzada o infección fulminante (^{CDC, 2017}; ^{Tinoco et al., 2018}).

Debido a esto encontramos en la literatura diferentes investigaciones, en su mayoría dirigidas al diagnóstico de Rickettsia spp. y R. rickettsii en garrapatas R. sanguineus en perros de diferentes regiones, como es el caso de Yucatán, seleccionando 28 perros donde se colectaron 106 garrapatas Rhipicephalus sanguineus con una incidencia del 26% (^{Peniche et al., 2015}) En Matamoros, Coahuila, se realizó la técnica de PCR de punto final para el análisis de 100 garrapatas (Rhipicephalus sanguineus) dando como positivo a Rickettsia spp el 4% de las muestras analizadas (^{Castillo et al., 2015}). En Mexicali Baja California, México, se analizaron mediante PCR garrapatas de perro pertenecientes a la morfología de Rhipicephalus sanguineus, resultando muestras positivas con 100% de homología a R. rickettsii (^{Foley et al., 2019}). Actualmente Sonora lidera las entidades con más reportes de Rickettsiosis en el país, siendo Cajeme una de las principales ciudades con más casos de muerte, a pesar de ser un dato asociado a la salud pública, es importante conocer la incidencia de R. rickettsii en animales ((^{PSS, 2014}), dándole mayor importancia a nuestro trabajo, pues no solo se detectó Rickettsia spp. Debido a que esas muestras salieron positivas a R. rickettsii, con 100% de homología al género con el gen gltA y la especie con el gen OmpA en muestras de sangre de 2 perros (n = 170), estos genes son los más utilizados para la detección de la bacteria que causan la fiebre maculosa.

Los resultados obtenidos de los tres agentes, aumenta la alerta y la incidencia de casos asociados a las Rickettsiales en el estado de Sonora transmitida por la garrapata café Riphicephalus sanguineus, que actualmente es el vector más importante de Rickettsiales en México (^{Labruna, 2009}), constituyendo un problema de salud pública, pues se le consideran a R. rickettsii, E. canis y A. platys enfermedad zoonótica por la CDC en el 2017 y que al pasar de los años han adquirido mayor territorio de infección. Como se mencionó anteriormente, estos patógenos pueden estar presentes en la garrapata, provocando co-infecciones simultáneas en el hospedero, es decir más de un solo agente puede ser transmitido, como se demuestra en la presente investigación, encontrando el 13% de co-infección a los agentes E. canis y A. platys.

La presencia de co-infección con estas bacterias en nuestro estudio no es un hallazgo extraño, ya que son los más comunes en Latinoamérica, basándonos en algunos porcentajes similares obtenidos en Panamá, que reportan una co-infecciones entre E. canis y A. platys del 7.5% (^{Santamaría et al., 2014}), El Salvador con 4.5% (^{Miranda et al., 2018}) y San Luis Rio Colorado, Sonora con el 12.2% (^{Murrieta et al., 2017}), mencionando que este último es muy semejante a nuestros resultados de co-infeccion y es del mismo estado.

Es fundamental considerar que el 46% restante de las muestras negativas en el estudio a género y especie, debido a la ausencia de los patógenos o a la presencia de otras enfermedades, ya que en la investigación todas las muestras de sangre provenían de presuntos perros o que manifestaban síntomas clínicos, aunque también puede deberse a la presencia en cantidades bajas e indetectables de los agentes patológicos.

Finalmente, es importante resaltar que las diferencias encontradas entre las muestras positivas a género y negativas a E. canis, A. platys y R. rickettsi probablemente se deban a que los cebadores utilizados en la primera PCR de género (ECC/ ECB) también amplifican otras especies, lo que podría indicar infección por otras especies de Ehrlichia (E. ewingii u otras) u otras especies de la familia Anaplasmataceae (A. phagocytophilum u otras).

CONCLUSIONES

El porcentaje de hemoparásitos en perros domésticos reportado en este estudio, posiciona actualmente a Sonora como uno de los principales estados con mayor frecuencia en regiones tropicales y subtropicales. Los tres agentes fueron detectados por técnicas moleculares en sangre de perros sospechosos de la ciudad de Cajeme, Sonora, identificándose Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii con frecuencias de 28%, 11% y 0.8%, respectivamente. Además, estos tres agentes fueron confirmados por secuenciación. En cuanto a las co-infecciones, solo se detectaron simultáneamente Ehrlichia canis y Anaplasma platys con un 13% de frecuencia. Esta es la primera investigación de identificación molecular en nuestro estado, confirmando la presencia de Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii a partir de sangre total de caninos.