nueva página del texto (beta)
Español (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
1. Introducción
El consumo de carne de res a nivel mundial ha presentado una tasa de crecimiento. En México en el 2022, la producción de carne de res se ubicó en 2.1 millones de toneladas de las cuales 322 mil toneladas se destinaron para exportación, lo que equivale al 15.33% de la producción nacional (SADER, 2022). Estos datos demuestran el alto consumo de carne de res en México, por lo cual las enfermedades trasmitidas por dichos alimentos representan un riesgo para los consumidores.
Una gran diversidad de bacterias patógenas han sido implicadas en brotes de enfermedades transmitidas por alimentos en todo el mundo (CDC, 2023). En países en desarrollo como México, los principales patógenos reportados son: Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y diferentes patotipos de Escherichia coli(Cruz-Galvez et al., 2013). Particularmente, la contaminación por Salmonella spp. y E. coli son patógenos muy frecuentes en la carne vacuna y sus derivados; debido a las deficiencias sanitarias durante el sacrificio y eviscerado para la obtención de la canal (Stanley et al., 2017; Obaidat, 2020; Garza-García et al., 2020; Delgado-Suárez et al., 2021).
Las infecciones intestinales en humanos ocasionadas por Salmonella spp. y los distintos patotipos de E. coli representan una problemática de salud pública global (WHO, 2007). Los síntomas típicos de dichas infecciones pueden variar desde diarreas leves hasta colitis hemorrágicas que en algunos casos pueden llegar a ocasionar la muerte de los pacientes infectados (Geletu et al., 2022).
Los métodos físicos, químicos y biológicos que se utilizan para impedir la contaminación de alimentos con dichos patógenos presentan varios desafíos ya que pueden provocar oxidación de lípidos, inducción de olores desagradables, favorecer la resistencia antimicrobiana, cambios de color y textura, pérdida de nutrientes, problemas de aceptación por los clientes, además, de representar un peligro para la salud ya que pueden formar compuestos cancerígenos (Richardson, 2003; Ahn et al., 2012; Chen et al., 2012; Maherani et al., 2016; Mittendorfer, 2016).
Este escenario necesita con urgencia la búsqueda de alternativas antimicrobianas para controlar agentes patógenos trasmitidos por alimentos, en este contexto, la aplicación de los bacteriófagos en la industria alimentaria ha sido cada vez más reconocida. Estos virus bacterianos presentan diversas características aplicables al control de microrganismos patógenos ya que ocasionan lisis específica en bacterias y no afectan a células de humanos y animales, además, pueden atacar cepas resistentes a los antibióticos y su presencia es abundante en el medio ambiente (Pereira et al., 2021; Minh et al., 2016).
Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo aislar bacteriófagos de muestras de agua de una planta tratadora y evaluar su virulencia contra E. coli y S. Typhimurium para ser propuestos como una alternativa antibacteriana para el tratamiento y descontaminación de patógenos trasmitidos por productos cárnicos.
2. Materiales y métodos
2.1. Lugares de trabajo
El análisis microbiológico y procesamiento de las muestras de agua para el aislamiento de los fagos se llevo a cabo en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL). Las muestras de agua residual y tratada fueron proporcionadas por la planta tratadora de aguas “Monterrey” ubicada en el municipio de Escobedo, Nuevo León.
2.2. Controles positivos y cepas bacterianas
Se utilizaron los fagos: MS2 para E. coli y el fago PRD1 para S. Typhimurium como controles positivos, los cuales fueron proporcionados por el Departamento de Microbiología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL). Además, se utilizaron las cepas de E. coli ATCC 25922, 15597, 35401, O157:H7 ATCC 43888 y S. Typhimurium ATCC 13311 otorgadas por el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la UANL.
2.3. Aislamiento de bacteriófagos
Se recolectaron 350 ml de agua residual y tratada de diferentes puntos de la planta tratadora de aguas, la transportación al laboratorio se realizó con refrigerantes y su procesamiento no excedió el tiempo de 6 horas desde su recolección. Los fagos fueron aislados a partir de agua negra (M1), reactor biológico (M2), efluentes (M3) y agua para venta (M4). El aislamiento se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Jamalludeen et al., (2007).
Se realizaron cultivos bacterianos de las cepas mencionadas en el apartado 2.2 en tubos con caldo soya tripticasa (CST) (Bioxon) a 37 ºC en agitación continua a 150 RPM por 24 horas. Posteriormente, 1 ml de cada cultivo se transfirió a un tubo con 30 ml de CST y se incubó a las mismas condiciones durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo se determinó la fase logarítmica 106, seguido de esto se mezcló con los tratamientos (Gaviria & Castaño, 2012). Posteriormente, se tomaron 200 ml de cada muestra de agua (M1, M2, M3 y M4) y se aforaron a 1,000 ml de una solución que contenia triptona (1%) y cloruro de sodio (0.25%). Después de esto se tomaron 20 ml de estas soluciones y se mezclaron con 20 ml del cultivo bacteriano, se incubaron a 37 ºC en agitación continua a 120 RPM por 24 horas (cada muestra de agua se procesó por separado). Al término de la incubación las muestras fueron centrifugadas a 4000 RPM durante 15 min. Se recuperó el sobrenadante y se filtró a través de una membrana milipore de 0.45 µm estéril, cada filtrado fue almacenado a 4 ºC.
2.4. Prueba de desafío contra bacterias
Los filtrados de las muestras de agua colectadas (M1, M2, M3 y M4) fueron desafiados por triplicado contra cepas de E. coli ATCC 25922, 15597, 35401, O157:H7 ATCC 43888 y S. Typhimurium (ATCC 13311), por el método de doble capa. Para dicha técnica se utilizaron placas de agar soya tripticasa (AST). Para la segunda capa se utilizó agar suave, el cual se preparó agregando 6.5 g/L de agar bacteriológico en caldo infusión cerebro corazón (ICC).
Las cepas de E. coli ATCC 25922, 15597, 35401, O157:H7 ATCC 43888 se activaron en caldo ICC, para después mezclar 200 µl del cultivo bacteriano y 100 µl de los filtrados de muestra de agua (M1, M2, M3 y M4) en tubos que contenían 7 ml de agar suave. Posteriormente se transfirieron a placas de AST y se incubaron a 37 ºC por 6 horas para su posterior análisis y observación de placas líticas. Se considero al bacteriófago muy virulento cuando mostro más de un 75% de placas líticas y medianamente virulento cando las placas líticas se observaron entre el 45 y 75 %.
Para la purificación y conservación de los bacteriófagos, se repitió el mismo procedimiento y una vez que se observaron las placas líticas se tomó la capa de agar suave y se homogenizó en solución salina al 0.85% estéril y se centrifugó a 4000 RPM durante 10 min. Los sobrenadantes se filtraron y se almacenaron a 4 ºC. Este procedimiento se hizo con cada una de las muestras positivas a placas líticas para formación de stock de fagos.
2.5. Prueba de fagotipificación
De los bacteriófagos obtenidos se tomó un fago específico contra S. Typhimurium (ATCC 13311) y se realizó un análisis de tipificación mediante la técnica de doble capa sobre 30 cepas de aislados clínicos de Salmonella spp. proporcionadas por el Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la UANL. Además, dicho fago (φ101) se desafió contra bacterias de diferentes géneros para determinar su nivel de especificidad. Para este ensayo se utilizaron cepas de Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas auruginosa y E. coli ATCC 25922, 15597, 35401, O157:H7 ATCC 43888 proporcionadas por el Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UANL.
2.6. Prueba de desinfección de superficies
Se realizó un ensayo de desinfección de superficie contaminada por S. Typhimurium (ATCC 13311) con el uso del fago específico φ101. Para este ensayo se utilizó una superficie de acero inoxidable desinfectada con alcohol al 70% y radiación ultravioleta durante 15 minutos a temperatura de 20 ºC. Dicha superficie fue dividida en 28 cuadrantes de 100 cm2 delimitados por hielo seco (Figura 1). Los cuadrantes se dividieron en 7 grupos de cuatro espacios (2 controles positivos y 2 tratamiento).
En cada cuadrante experimental, se aplicó 1 ml que contenía 1.2x108 células/ml de S. Typhimurium (ATCC 13311) y 400 µl del fago φ101 (9 x 109 UFP/ml) distribuyéndose de manera uniforme por toda la superficie del cuadrante con un hisopo estéril. Posterior a ello, se realizó el monitoreo de las bacterias mediante el método de cuenta viable en placa a las 0, 4, 8, 12, 16, 20 y 24 horas, con el fin de evaluar la reducción de la carga bacteriana.
3. Resultados y discusión
3.1. Aislamiento de bacteriófagos y desafío contra bacterias
Se aislaron y purificaron 19 bacteriófagos para las diferentes cepas de E. coli y un solo fago para la cepa de S. Typhimurium. En la Tabla 1, se muestra los resultados de fagos aislados para cada cepa bacteriana y su denominación para la formación de stock.
Tabla 1 Características de los fagos aislados.
| Fago | Origen | Cepa | Virulencia |
|---|---|---|---|
| φC5 | M1 | E. coli 25922 | ++ |
| φfmvz | M2 | E. coli 25922 | +++ |
| φR | M1 | E. coli 25922 | +++ |
| φ102 | M2 | E. coli 25922 | +++ |
| φ110 | M2 | E. coli 25922 | +++ |
| φMB | M2 | E. coli 25922 | ++ |
| φ8 | M3 | E. coli 25922 | +++ |
| φ7 | M4 | E. coli 25922 | +++ |
| φ21 | M1 | E. coli 15597 | ++ |
| φ12 | M1 | E. coli 15597 | ++ |
| φ27 | M2 | E. coli 15597 | ++ |
| φ31 | M2 | E. coli 15597 | +++ |
| φ23 | M3 | E. coli 15597 | ++ |
| φ25 | M4 | E. coli 15597 | +++ |
| φ58 | M1 | E. coli 35401 | ++ |
| φ28 | M2 | E. coli 35401 | ++ |
| φ22 | M3 | E. coli 35401 | ++ |
| φ26 | M4 | E. coli 35401 | ++ |
| φYEMS | M1 | E. coli O157:H7 ATCC 43888 | ++ |
| φ101 | M1 | S. Typhimurium | +++ |
+++: Muy virulento, ++: Medianamente virulento, M1: Agua negra, M2: Reactor biológico, M3: Efluentes, M4: Agua para venta
La cepa de E. coli ATCC 25922 mostró mayor susceptibilidad (>75% de placas líticas) a la acción de los fagos aislados de todas las muestras de agua, mientras que la cepa O157:H7 ATCC 43888 mostró gran resistencia (<50% de placas líticas) observándose pocas placas líticas para los fagos aislados de las diferentes muestras de agua. Para S. Typhimurium (ATCC 13311) solo se logró recuperar un fago específico el cual se denominó “fago φ101”.
Estudios previos han demostrado la presencia de bacteriófagos en aguas residuales de hospitales y de plantas tratadoras de aguas, los cuales tienen la capacidad de lisar bacterias multirresistentes a los antibióticos (Kang et al., 2024; Wang et al., 2024). Esta alternativa puede ser una solución para el control de contaminación por microorganismos patógenos presentes en la cadena de producción de productos cárnicos. Además, se considera que puede ayudar a minimizar el impacto sobre los ecosistemas y la salud pública (Azzam et al., 2024).
3.2. Prueba de fagotipificación
Para este ensayo se evaluó únicamente el bacteriófago φ101 específico para S. Typhimurium contra 30 aislados de Salmonella spp. provenientes del Hospital Universitario, con la finalidad utilizar los fagos como herramienta de identificación, de los cuales el 53.33% de los aislados clínicos fueron fagotipificables con el fago φ101.
La evaluación contra bacteria de diferentes géneros para determinar el nivel de especificidad del fago φ101, mostró que fue negativo a todos los desafíos con los géneros bacterianos expuestos. Esto demuestra la especificidad del fago φ101 por las cepas de Salmonella spp. con la posibilidad de causar lisis solo en la serovariedad S. Typhimurium. En un estudio realizado por Choi et al. (2024) mencionan la existencia de bacteriófagos específicos contra S. Typhimurium multirresistente, demostrando un impacto ambiental potencial como sustancia para la prevención de este patógeno en varios aspectos de la cadena de la industria porcina.
3.3. Prueba de desinfección de superficies
Se observó el efecto de desinfeccion del fago φ101 en la superficie de acero inoxidable mediante la disminución considerable de la carga bacteriana al transcurso de las horas, obteniendo 3x102 UFC/ml a las 24 horas (Tabla 2). Esto demuestra su capacidad como alternativas antimicrobianas para controlar dichos patógenos, que pueden ser contaminación en diferentes puntos de la cadena de producción de productos cárnicos.
Tabla 2 Reducción de UFC de S. Typhimurium por el fago φ101 en superficies contaminadas.
| Hora | UFC/ml |
|---|---|
| 0 | 1.2x108 |
| 4 | 1.4x106 |
| 8 | 6x103 |
| 12 | 2x103 |
| 16 | 1x103 |
| 20 | 6x102 |
| 24 | 3x102 |
UFC: Unidades formadoras de colonias.
Algunas investigaciones han demostrado la aplicación de los bacteriófagos aislados de agua de río y aguas residuales demostrando ser líticos contra cepas de E. coli y S. Typhimurium multirresistentes a los antibióticos (Jamalludeen et al., 2007; Elbahnasawy et al., 2021; Costa et al., 2019; Petsong et al., 2019). El uso de los fagos tiene gran relevancia en la industria de los alimentos cárnicos, ya que se ha demostrado que pueden ser aplicados como desinfectantes de superficies contra bacterias patógenas con actividad antimicrobiana y antibiofilm. Además, se considera que la combinación de fagos específicos y desinfectantes químicos tiene mayor efecto para eliminar biopelículas bacterianas y eliminar bacterias en superficies duras (Chen et al., 2024; Brás et al., 2024; Byun et al., 2024).
4. Conclusión
De manera general, este estudio preliminar sugiere que el aislamiento y aplicación de los fagos, pueden ser utilizados para controlar microrganismos patógenos que ocasionan contaminación en la cadena de producción de productos cárnicos incluyendo la desinfección de superficies. Adicionalmente presentan la capacidad de afectar bacterias resistentes a antibióticos por lo cual podrían considerarse una alternativa para disminuir el uso de los antibióticos y por lo tanto disminuir el fenómeno de resistencia.
