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Introducción
El agave tobalá (Agave potatorum Zucc.) crece en suelos arenosos planos o de poca pendiente, se distribuye desde el Valle de Tehuacán (Puebla) a Cuicatlán, la Sierra Mixteca y montañas de los Valles Centrales de Oaxaca (García-Mendoza 2010). Su creciente demanda para la elaboración de mezcal, se debe a sus propiedades organolépticas suaves atribuidas por la baja producción de ácido acético y etanol en piña cocida (Vera et al. 2009). Para el 2023, el volumen de producción anual del mezcal incrementó 13.60% (12.24 millones de L) con respecto al año anterior, siendo el Estado de Oaxaca el primer productor con 90.51% del volumen total (COMERCAM 2024). Más del 80% de la producción se obtiene de agave espadín y el segundo con mayor demanda es el tobalá (2.42%).
La presión social por la demanda de mezcal, aumenta la vulnerabilidad natural de algunas especies de agave con la extracción de plantas silvestres, cambios en el uso de suelo, que se agravan con la práctica de sistemas en monocultivo, y falta de manejo agronómico (Delgado-Lemus et al. 2014). Por lo que es importante promover su manejo integral con acciones concretas, como el manejo de semilleros, uso eficiente del agua, suelo y residuos; conjuntamente con el manejo de plagas y enfermedades con biocontroladores nativos (Lucio 2022).
Los hongos del género Trichoderma establecen relación simbiótica con las plantas, que está directamente influenciada por la microbiota nativa, la especificidad y factores abióticos (Alfiky y Weisskopf 2021). Son de hábitat variable debido a la capacidad metabólica y competitiva que poseen sus especies (Gams y Bisset 2002). Se encuentran en suelos, madera y material vegetal en descomposición, son de interés en la industria biotecnológica y en la agricultura por los diversos metabolitos que producen y por la adaptación a diferentes condiciones ambientales (Martínez et al. 2013).
La distinción de especies basada en la morfología se le atribuye a Rifai (1969), sin embargo, fue hasta la descripción de Samuels (1996) que se tuvo visión completa de la biología de Trichoderma y el uso potencial de las enzimas que producen. Estas enzimas participan en el proceso de micoparasitismo y regulan el ingreso del antagonista al hospedante, además, los metabolitos que sintetizan estos hongos pueden actuar como elicitores para promover el crecimiento vegetal e inducir resistencia sistémica (Khan et al. 2020). Su biosíntesis depende de la especie y se ve afectada por el pH, la presencia de micotoxinas o ácidos grasos que regulan la expresión de genes (Chóez-Guaranda et al. 2023).
Para identificar la diversidad de especies de Trichoderma se realiza caracterización morfológica y microscópica de aislamientos (Arrazate-Argueta et al. 2019). La morfología de este género es variable y el proceso de diferenciar las especies consiste en evaluar la textura del micelio, color, formación del halo central, número de anillos concéntricos, tipo de esporulación y la tasa de crecimiento. Además, se consideran estructuras microscópicas como clamidosporas, fiálides, disposición del conidióforo y la forma y tamaño de las esporas (Allende-Molar et al. 2022).
La capacidad de Trichoderma para promover el crecimiento vegetal se expresa en el incremento de la altura de planta, longitud de radícula y biomasa foliar (Gamboa-Villa et al. 2020, Sabando-Ávila et al. 2017). La aplicación preventiva de este hongo antagonista puede disminuir la presencia o severidad de enfermedades en diversos cultivos. Las enzimas que participan durante el antagonismo son glucanasas y quitinasas. Modificar las condiciones del medio de cultivo o de incubación, como la temperatura y pH, provoca diferencias significativas en la cantidad de quitinasa producida por Trichoderma (Mohiddin et al. 2021); la cantidad de enzimas hidrolíticas que produce T. harzianum varía dependiendo de la procedencia del aislamiento (Chaparro y Castillo 2019). La producción de enzimas líticas depende de la fuente de carbono, condiciones fisicoquímicas de crecimiento y caracteriza el potencial de biocontrol que posee cada especie de Trichoderma (Kalsoom et al. 2019).
Las condiciones para el establecimiento de Trichoderma son de 25 a 30 °C, con humedad relativa superior al 70%, aunque esto no ha sido limitante para encontrar alta diversidad genética en zonas áridas. La presencia de estos hongos en condiciones de poca humedad y temperaturas altas comprueba la plasticidad de algunas especies para colonizar suelos y raíces de diferentes especies vegetales (Savín-Molina et al. 2021, Cabral-Miramontes et al. 2022). Esto demuestra la capacidad de hacer cambios metabólicos y fisiológicos de origen evolutivo en nichos ecológicos específicos. El estudio de Trichoderma nativa, enfocado a la distinción de características deseables, permite conocer la potencialidad de las cepas, su especificidad y pueden ser indicadores de salud ambiental (Sánchez-Hernández et al. 2018). El objetivo de la investigación fue caracterizar la morfología, taxonomía y bioquímica enzimática de especies de Trichoderma de suelo rizosférico y tejidos de Agave potatorum Zucc. cultivado en Valles Centrales de Oaxaca, México.
Materiales y métodos
Sitio y método de muestreo
Se seleccionó una plantación de A. potatorum, de 18 meses de edad, en la localidad de San Baltazar Chichicapam en la Región Valles Centrales de Oaxaca con ubicación geográfica 96° 49’ 88’’ LO y 16° 74’ 94’’ LN con 1 525 m de altitud. Se colectaron muestras de suelo rizosférico y plantas, utilizando la metodología cinco de oros propuesta por Moreira et al. (2012). Se colectaron submuestras de 10 g de suelo rizosférico para obtener una muestra compuesta de 50 g y plantas completas. Las muestras fueron trasladadas y procesadas en el Laboratorio de Fitopatología del Campo Experimental Rosario Izapa del INIFAP. Se determinó el pH, la salinidad y la textura del suelo (Bouyoucos 1936).
Siembra de suelo por método de diluciones y aislamiento de Trichoderma spp.
La muestra compuesta de suelo se homogenizó, se pesaron 10 g de suelo, se suspendió en 100 mL de agua destilada estéril y se agitó la solución durante 1 min. Se tomó una alícuota de 1 mL y se diluyó en 9 mL de agua destilada estéril, se agitó durante 1 min. Este procedimiento se repitió cuatro veces para obtener diluciones 10-2 a 10-5.
Se seleccionaron las diluciones 10-3 y 10-4 para inocular medio de cultivo agar dextrosa papa (PDA) adicionado con 200 mg L-1 de estreptomicina y 50 mg L-1 de cloranfenicol. Se tomó 200 µL de cada solución, se inoculó en cajas de Petri con 12 mL de medio de cultivo y se incubaron durante cuatro días. Los aislados que expresaron características del género Trichoderma (micelio de rápido crecimiento, blanco, esporulación verde de diferente tonalidad, formación de anillos y bordes regulares) fueron purificadas en cajas Petri con el medio PDA por la técnica de punta de hifa (Chairman et al. 1978).
Aislamiento de Trichoderma spp. a partir de tejido de A. potatorum
Se colectaron cinco plantas completas, fueron lavadas y se cortaron segmentos de tallo y raíz. Estos tejidos se desinfectaron con solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1% durante 2 min, seguido de alcohol al 70% durante 1 min y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Los fragmentos de tallo se redujeron a 0.5 cm2 y las raíces se cortaron a 0.5 cm de longitud.
Los explantes fueron sembrados en caja de Petri (90 x 15 mm) con 12 mL de PDA + 200 mg L-1 de estreptomicina + 50 mg L-1 de cloranfenicol. Las cajas se incubaron durante cinco días en condiciones de oscuridad a 27 °C, las colonias de hongos con morfología similar a Trichoderma se aislaron y purificaron en PDA, con las mismas condiciones de incubación.
Identificación molecular de Trichoderma spp.
Se realizó la identificación molecular de las cepas de Trichoderma en el Laboratorio de Genética de Poblaciones en el Instituto de Biociencias de la Universidad Autónoma de Chiapas. La extracción de ADN se realizó con modificaciones al protocolo de Huanca et al. (2014). Se amplificó la región espaciador transcrito interno (ITS), con los iniciadores ITS1 e ITS4. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consistió en un ciclo inicial de desnaturalización a 94 °C por 3 min, seguido de 30 ciclos (94 °C por 45 s, 56 °C por 30 s, 72 °C por 90 s) y extensión final a 72 °C durante 10 min. El volumen final de la reacción fue de 25 µL con 14.9 µL de agua ultrapura estéril, 2.5 µL de solución amortiguadora Buffer 10X, 2 µL de MgCl2 a 50 mM, 1 µL de dNTP mezcla a 10 mM, 1.25 µL de iniciadores ITS1 e ITS4 a 10 mM, 0.1 µL de ADN polimerasa Taq (Invitrogen®) y 2 µL del ADN.
La purificación de los productos PCR se realizó con modificaciones al protocolo de Rochelle et al. (1995). La secuenciación de los productos se hizo en el Laboratorio de Secuenciación Genómica de la Biodiversidad del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México. Una vez obtenidas las secuencias se procedió al análisis por Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) en la base de datos del National Center of Biotechnology Information (NCBI).
Descripción morfométrica de Trichoderma sp.
Para la caracterización morfológica de las cepas de Trichoderma se evaluó la textura del micelio (Tm, algodonoso o plano o filamentoso), el color de micelio (Cm, color), el color de micelio al reverso de la caja de Petri (Cr, color), número de anillos concéntricos (Nac, #) y color de conidios (Ce, verde oscuro o verde esmeralda o verde limón).
Para las características microscópicas se establecieron microcultivos en discos de PDA y agua agar al 2% con diámetro de 8 mm; los cuales se incubaron por siete días en condiciones de oscuridad y temperatura ambiente (27 °C ± 2 °C). Después fueron observados al microscopio para apreciar estructuras de la hifa, conidióforos, clamidosporas y fiálides.
Para medir la velocidad de crecimiento (Vc, cm d-1) se sembraron discos con crecimiento micelial, con diámetro de 5 mm, en medio de cultivo PDA. Los discos fueron colocados al centro de la caja de Petri y se registró el crecimiento micelial radial (Cmi, cm) cada 24 h hasta el llenado de la caja. La incubación fue en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente (27 °C ± 2 °C).
El análisis de los datos de las variables Tm, Nac, Cm, Cr y Ce fue descriptivo y para Vc se transformó la variable con
Evaluación del tamaño, producción y germinación de conidios
El tamaño de los conidios fue registrado por micrografías con apoyo del programa Amscope®, se midieron 20 conidios de cada aislamiento. Para ello se registró el diámetro meridional (Dm, µm), el diámetro ecuatorial (De, µm) y se calculó el diámetro promedio (Dp, µm). La producción de conidios (Pe, cel mL-1) fue calculada a partir de una suspensión celular de los aislamientos de Trichoderma con siete días de incubación en medio de cultivo PDA. Se utilizó cámara de Neubauer para calcular el número de conidios por mL. Se colocaron 50 µL en medio de cultivo PDA de una suspensión celular con concentración 1x106 cel mL-1 y se monitoreó la germinación de conidios (Ge, %) a las 24 h, la unidad experimental fueron 100 conidios. El análisis de los datos se realizó con el programa SAS for Windows versión 9.4. Se realizó análisis de varianza con prueba de medias por Tukey (α = 0.01) para Te y Tukey (α = 0.05) para Pe y Ge. Las variables Pe y Ge fueron transformadas con
Actividades enzimáticas de especies de Trichoderma con potencial para control biológico
Las determinaciones de la actividad enzimática se realizaron en el Laboratorio de Suelos del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-IPN) Unidad Oaxaca.
Cuantificación de exoglucanasas
Se utilizó medio de cultivo mínimo basal formulado por 2 g de KH2PO4, 0.3 g de MgSO4 7H2O, 14 g de (NH4)2SO4 y 2% de carboximetilcelulosa (CMC) por L. Para obtener el extracto enzimático se realizaron modificaciones a la metodología propuesta por Ng et al. (1977); la determinación de azúcares fue por el método Nelson (1944) y Somogyi (1952), la curva patrón se realizó con diferentes concentraciones de glucosa (0-4 µM).
En 10 mL de medio de cultivo se inocularon 100 µL de suspensión de conidios de Trichoderma con concentración de 1x108 cel mL-1. Los tubos (16x150 mm) fueron incubados durante tres días sin agitación a 26 °C y tres días más con agitación constante de 140 rpm.
Posterior a la incubación, se centrifugó el sustrato enzimático a 6 000 g por 30 min y se tomó 1 mL para reaccionar con 1 mL de CMC al 0.2%. Los tubos se dejaron reaccionar a 60 °C por 30 min y al término del tiempo se tomó 1 mL de la reacción y se le adicionó 1 mL de solución Somoyi, se calentó a 100 °C por 15 min. La digestión se detuvo en baño de hielo y se agregó 1 mL de solución Nelson. Los tubos reposaron 3 min y se agregaron 10 mL de agua destilada para proceder a medir la absorbancia en espectrofotómetro UV (Thermo Fisher Scientific type Genesys 20, modelo 4001/4, CA, E.U.A.) a 540 nm. Una unidad de actividad celulasa se definió como la cantidad de enzima que liberó 1 µmol de glucosa por volumen de reacción por día.
Cuantificación de quitinasa
El sustrato enzimático fue obtenido según lo descrito por Mohiddin et al. (2021) con modificaciones. Se utilizó medio de cultivo mínimo basal con 0.1 g KH2PO4, 0.01 g MgSO4·7H2O, 3.0 g NaCl, 0.7 g (NH4 )2SO4, 0.05 g de extracto de levadura y como sustrato quitina azure al 0.01% (SIGMA-ALDRICH C3020) por litro, se ajustó a pH 6. El medio de cultivo se inoculó con 100 µL de suspensión de conidios de Trichoderma con concentración de 1x106 cel mL-1. La incubación se realizó en tubos de ensaye con rosca durante seis días a 26 °C y 140 rpm.
La solución enzimática se centrifugó a 6 000 g por 30 min; se tomaron 0.5 mL para reaccionar con 0.5 mL de quitina (0.01%). La incubación duró 1h a 45 °C según lo descrito por Mohiddin et al. (2021), la reacción se detuvo al adicionar 3 mL de ácido 5-dinitrosalicílico y se llevó a 100 °C durante 5 min. El producto se centrifugó a 6 000 g por 15 min y al sobrenadante se le midió la absorbancia en espectrofotómetro UV (Thermo Fisher Scientific type Genesys 20, modelo 4001/4, CA, E.U.A.) a 540 nm. La curva de calibración se realizó con N-acetilglucosamina (0 a 50 mM). Una unidad de actividad quitinasa se definió como la cantidad de enzima que liberó 1 mmol de N-acetilglucosamina min-1.
Resultados
Se obtuvieron cuatro cepas con morfología del género Trichoderma a partir de muestras de suelo y tejido de A. potatorum establecido en Oaxaca, México. El suelo tenía textura arenosa, con pH medianamente alcalino (7.66) y sin problemas de salinidad (0.13 dS m-1).
Identificación molecular de Trichoderma spp.
El análisis BLAST del NCBI identificó a T. lentiforme aislada de suelo de A. potatorum, con homología al número de accesión NR144868.1 y 99.54% de identidad. El aislamiento de tallo de agave fue identificado como T. yunnanense, con homología del 98.75% (NR_134419.1). En raíz se identificó a T. asperellum, con homología del 100% al número de accesión NR130668.1. No fue posible asemejar al otro aislamiento de suelo, por lo que se identificó como Trichoderma sp.
Descripción morfométrica de Trichoderma sp.
Los cuatro aislamientos presentaron Cm blanco, con Cr amarillo y Tm algodonoso elevado (Figura 1). Se diferenciaron entre sí en el Nac que formaron y en el Ce.
Figura 1 Morfología de aislamientos de Trichoderma de suelo y tejidos de A. potatorum. A. T. asperellum. B. T. yunnanense. C. Trichoderma sp. D. T. lentiforme.
En Trichoderma sp. y T. lentiforme no se observaron anillos, T. yunnanense presentó un anillo y T. asperellum formó dos. Los conidios observados eran esféricos. El color de los conidios de T. asperellum y T. yunnanense fue verde oscuro, mientras que, Trichoderma sp. presentó conidios de color verde esmeralda y T. lentiforme en coloración verde limón. En todos los aislados fue posible observar clamidosporas. La forma del conidióforo y de las fiálides fue diferente para cada especie (Figura 2).
Figura 2 Micrografías de conidióforos de Trichoderma aisladas de A. potatorum. A. T. asperellum. B. T. yunnanense. C. Trichoderma sp. D. T. lentiforme. Barra = 20 µm.
La variable Cmi presentó diferencias significativas para el día uno y dos; sin embargo, al día tres el crecimiento se homogenizó (Tabla 1). La variable Vc presentó diferencia significativa. Trichoderma sp. tuvo mayor Vc y fue significativamente distinto de T. asperellum y T. yunnanense.
Tabla 1 Crecimiento radial y velocidad de crecimiento del micelio de Trichoderma.
| Especie | Cm 24 h (cm) | Cm 48 h (cm) | Cm 78 h (cm) | Vc (cm d-1) ‡ |
|---|---|---|---|---|
| T. asperellum | 1.95 ± 0.02ab | 3.10 ± 0.02bc | 3.68 ± 0.03a | 1.22 ± 0.01b |
| T. yunnanense | 1.56 ± 0.03b | 2.76 ± 0.02c | 3.65 ± 0.02a | 1.22 ± 0.01b |
| Trichoderma sp. | 2.13 ± 0.08a | 3.64 ± 0.03a | 3.64 ± 0.03a | 1.81 ± 0.02a |
| T. lentiforme | 1.83 ± 0.11ab | 3.45 ± 0.12ab | 3.60 ± 0.03a | 1.59 ± 0.19ab |
| c.v. | 6.93 | 3.96 | 1.38 | 2.99 |
Letras diferentes por columna son estadísticamente distintas (Tukey ≤ 0.01). ‡Datos transformados con la ecuación
Evaluación del tamaño, producción y germinación de conidios
Se registraron diferencias significativas para las variables Dm, De y Dp (Tabla 2). T. lentiforme presentó los conidios de menor tamaño y Trichoderma sp. las de mayor diámetro. Las variables Pe y Ge registraron diferencias significativas. En ambas, T. yunnanense fue significativamente distinta de T. asperellum.
Tabla 2 Tamaño, producción y germinación de conidios de Trichoderma aisladas de A. potatorum.
| Especie | Dm (µm)† | De (µm)† | Dp (µm)† | Pe (106 cel mL-1)†† | Ge (%)†† |
|---|---|---|---|---|---|
| T. asperellum | 6.56 ± 0.08a | 5.55 ± 0.04a | 6.06 ± 0.05a | 19.40 ± 1.80b‡ | 96.25 ± 0.62b |
| T. yunnanense | 6.58 ± 0.07a | 5.55 ± 0.04a | 6.07 ± 0.04a | 35.40 ± 4.68a | 99.50 ± 0.28a |
| Trichoderma sp. | 6.91 ± 0.10a | 5.49 ± 0.07ab | 6.20 ± 0.07a | 22.80 ± 2.58ab | 98.25 ± 0.25ab |
| T. lentiforme | 5.67 ± 0.05b | 5.26 ± 0.05b | 5.46 ± 0.04b | 22.80 ± 4.76ab | 97.00 ± 0.91b |
| c.v. | 8.99 | 6.81 | 6.71 | 13.76 | 1.10 |
†Letras diferentes por columna son estadísticamente distintas (Tukey ≤ 0.01). ††Letras diferentes por columna son estadísticamente distintas (Tukey ≤ 0.05). Dm = diámetro meridional, De = diámetro ecuatorial, Dp = diámetro promedio, Pe = producción de conidios, Ge = germinación de conidios, c.v. = coeficiente de variación.
Actividades enzimáticas de especies de Trichoderma con potencial para control biológico
La actividad de exoglucanasas fue significativamente diferente entre las especies. T. asperellum liberó la mayor cantidad de glucosa y para Trichoderma sp. fue menor (Tabla 3). Con respecto a la actividad de quitinasa, solo en T. asperellum y T. yunnanense se registró actividad de esta enzima en 6 d de incubación, para Trichoderma sp. y T. lentiforme no se presentó actividad.
Tabla 3 Actividad de exoglucanasas y quitinasas producidas por Trichoderma spp.
| Especie | µM glucosa mL-1 día-1 | mM n-acetilglucosamina mL-1 día-1 |
|---|---|---|
| T. asperellum | 0.55 ± 0.01a | 1.67 ± 0. 17a |
| T. yunnanense | 0.51 ± 0.01ab | 1.49 ± 0.08a |
| Trichoderma sp. | 0.50 ± 0.01b | NR |
| T. lentiforme | 0.51 ± 0.01ab | NR |
| c.v. | 2.99 | 16.85 |
Letras diferentes por columna son estadísticamente distintas (Tukey ≤ 0.05). NR = no registrada.
Discusión
De las especies identificadas en este estudio, solo T. asperellum ha sido reportada para suelos semiáridos en México. T. yunnanense y T. lentiforme se reportan por primera vez como especies que colonizan suelo y tejidos de agave en condiciones semiáridas. T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. koningii, T. viride y T. longibrachiatum son las especies documentadas para suelos semiáridos del noroeste del país. Las poblaciones de estos hongos en suelos de este tipo están sujetas a la escasa vegetación en el sitio de muestreo, la textura arenosa del suelo y la plasticidad de las especies para adaptarse a condiciones extremas mediante la producción de metabolitos (Savín-Molina et al. 2021).
Cabral-Miramontes et al. (2022) reportaron hongos del clado T. asperolloides y T. harzianum aislados de plantas y suelo árido-alcalino de México. T. harzianum mostró su capacidad para neutralizar pH ácidos y alcalinos durante su crecimiento in vitro; esta adaptación al nicho de origen, representa su potencial capacidad para sintetizar metabolitos involucrados en la colonización e inhibición de patógenos. El tipo de metabolitos secundarios que produce Trichoderma difiere según la especie, estos pueden ser: alcaloides, lactonas, quinonas, triterpenos, esteroles, azúcares reductores o flavonoides (Chóez-Guaranda et al. 2023). La síntesis de los metabolitos secundarios depende de la expresión génica, la cual es regulada por cambios en el pH, presencia de proteínas y la interacción con otros organismos (Khan et al. 2020).
La actividad de quitinasa producida por T. asperellum y T. yunnanense en medio mínimo basal adicionado con quitina, fue similar a lo reportado por Mohiddin et al. (2021), quienes mencionan que T. harzianum tiene la capacidad de producir desde 1.13 hasta 3.38 U mL-1 de quitinasa. La actividad de exoglucanasas fue menor, para las cuatro especies, que lo reportado por Kalsoom et al. (2019) para T. reesei, que produce hasta 0.275 U mL-1 min-1 de enzima en 120 h en condiciones de 70 % de humedad.
Uno de los efectos del hongo Trichoderma en asociación con plantas es la alteración de la homeostasis hormonal, que mejora su desempeño fisiológico ante estrés abiótico (Alfiky y Weisskpof 2021). La selección de cepas nativas de Trichoderma que provienen de zonas semiáridas podría incrementar la adaptación a ambientes extremos, y su posible uso como agentes de biocontrol contra patógenos que producen enfermedades en plantas de interés agrícola (Savín-Molina et al. 2021). El aislamiento de cepas nativas de Trichoderma se ha reportado en suelo y raíz de aguacate (López-López et al. 2023).
En esta investigación, las especies aisladas de suelo tuvieron mejor Vc en comparación con las obtenidas de raíz y tallo de A. potatorum. A mayor Vc, Trichoderma posee potencial para establecerse en la rizosfera, convirtiéndose en competidor natural por espacio y nutrientes ante la presencia de otros hongos (Khan et al. 2020). Además, una mayor producción de conidios refleja la agresividad del antagonista para establecerse y permite que el porcentaje de germinación de conidios se incremente, asegurando la supervivencia de Trichoderma.
Las especies con mayor frecuencia reportadas en México son T. asperellum y T. harzianum. T. lentiforme, no ha sido reportada en el país (Ahedo-Quero et al. 2024, Allende-Molar et al. 2022).
Conclusiones
Se identificó a T. asperellum y T. yunnanense como hongos nativos que habitan en tejido de A. potatorum. Se reporta por primera vez para México T. lentiforme en suelo de cultivo de agave en Oaxaca. Las características morfológicas de las especies son similares en la coloración y textura del micelio y diferentes en el color de conidios. La especie T. lentiforme aislada de suelo no presentó anillos concéntricos de esporulación. Las cuatro especies presentaron diferencias taxonómicas y actividad de exoglucanasas. T. asperellum presentó más actividad de exoglucanasas y solamente T. asperellum y T. yunnanense mostraron actividad de quitinasa.
