Ubicación del experimento, material vegetal y obtención de extractos polifenólicos

La investigación se realizó en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, en Buenavista, Saltillo, Coahuila, a una altitud de 1 790 m, durante el periodo primavera-verano 2023, en el Laboratorio de Fitoquímica del Departamento de Fitomejoramiento y en un invernadero tipo capilla del Departamento de Horticultura. Los materiales vegetales utilizados fueron semillas de variedades de tomate: saladette (Río grande) y bola (Beef Bang F1). Para la preparación de los extractos polifenólicos, se colectaron en sitios de Coahuila y Nuevo León, ramas con hojas de apulín (Rhus virens Lindh.) (RV), zumaque (Rhus muelleri Standl. & F.A. Barkley) (RM), nogal encarcelado (Juglans mollis Engelm) (JM) y tallos de sangre de drago (Jatropha dioica Cerv.) (JD). Los extractos metanólicos fueron obtenidos mediante la técnica reportada por ^{Ramírez et al. (2001)}.

Contenido fitoquímico y actividad antioxidante de los extractos

Los extractos fueron analizados para obtener el contenido de polifenoles totales (CPT) (^{Bautista-Hernández et al. 2022}), taninos hidrolizados (TH) (^{Georgé et al. 2005}), taninos condesados (TC) (^{Amaya-Chantaca et al. 2022}) y contenido de flavonoides totales (CFT) (^{De La Rosa et al. 2014}). La actividad antioxidante: ABTS (^{Espitia-Hernández et al. 2022}), DPPH y FRAP (^{Bautista-Hernández et al. 2022}). Los resultados (Tabla 1) se analizaron por ANVA^´s (p≤0.05), y prueba de medias DMS de Fisher (α=0.05), con SAS (Statistical Analysis Systems) versión 9.4 (^{SAS 2013}).

Evaluación del efecto de los extractos polifenólicos en tomate

El experimento se llevó a cabo en dos etapas: la primera in vitro, con semillas de dos variedades de tomate: saladette (Río Grande) y bola (Beef Bang F₁), para determinar los mejores extractos y concentraciones (tratamientos), a utilizar en invernadero. La segunda fue en invernadero y tuvo la finalidad de evaluar el crecimiento de las plántulas en charola antes del trasplante, así como evaluar el establecimiento de las plantas en maceta, después del trasplante, y así determinar, si las plantas que presentaron mayor crecimiento en charola, también mostraron mayor crecimiento en maceta.

Etapa in vitro

Los extractos utilizados fueron: Rhus virens, R muelleri, J. mollis y J. dioica, en concentraciones de: (75, 100 y 200 mg L^-1), y dos testigos enraizadores comerciales: Rootex® (RT) compuesto por nutrientes (N-P-K), aminoácidos, ácidos húmicos y auxinas (^{COSMOCEL 2024}), y Raizal® (RZ) compuesto por nutrientes (N-P-K-Mg-S) y auxinas (^{Arysta Life 2024}), además de un testigo control (TC), sin extracto ni enraizador, solo agua de riego, que totalizaron 15 tratamientos (Tabla 2). La concentración de los extractos en estudios anteriores (^{Jasso de Rodríguez et al. 2020}, ^{Jasso de Rodríguez et al. 2023}), fue igual a la utilizada para los biorreguladores (75 mg L^-1), en este estudio, se consideró incrementar las dosis de los extractos, para evaluar si hay un mayor efecto estimulante. El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar, con 15 tratamientos, con 4 repeticiones y 3 semillas por repetición, lo que representó 60 unidades experimentales. Las variables evaluadas fueron la longitud total de la radícula y plúmula, medidas con un vernier digital (Stainless Hardened) y el peso fresco de la plántula en balanza analítica (Mod. Hr-250a - A&D Weighing). Los datos obtenidos, se sometieron a un ANVA (p ≤ 0.05) con un diseño completamente al azar, y una prueba de comparación de medias por el método DMS de Fisher (α=0.05). Los datos se analizaron en el programa estadístico SAS, versión 9.4 (^{SAS 2013}).

Etapa en invernadero

Los extractos de R. muelleri, R. virens y J. dioica y las concentraciones de 75 y 200 mg L^-1, fueron seleccionados para la evaluación en invernadero (evaluación en charola y en maceta), ya que presentaron los mejores resultados in vitro, además del extracto RJ (combinación de RM y JD, 1:1), para potencializar el efecto de estos dos extractos, y dos enraizadores comerciales (RT y RZ), además del testigo control (TC). En total 11 tratamientos (Tabla 3). Los experimentos en charola y maceta se establecieron bajo un diseño completamente al azar con 11 tratamientos, 4 repeticiones y 3 plantas por repetición, para cada evaluación.

Evaluación en charola

Se inició con la imbibición durante 24 h de las semillas de tomate saladette y bola, las cuales se colocaron en vaso de precipitado en 20 mL de extracto para cada tratamiento/variedad. Las semillas de tomate se sembraron el 5 de mayo de 2023, en charolas de poliestireno de 200 cavidades, con vermiculita y Peat moss (1:1). Para favorecer la germinación, las charolas se cubrieron y colocaron en cuarto oscuro hasta la emergencia. Cuatro días después de la siembra (DDS), se presentó la emergencia al 100%, y las charolas se trasladaron al invernadero. Se efectuaron manualmente dos riegos diarios, a las 9:00 y 18:00 h, asperjando las charolas hasta provocar el drenaje (se permitió un drenado del 20 a 25%). La fertilización se aplicó con el riego a partir de los 15 DDS, se utilizó la solución nutritiva (SN) de Steiner^{(Steiner 1961)}, a concentración de 40%. Los macronutrientes en la SN fueron: KNO_3,0.047 g L^-1, K₂SO_4, 0.231 g L^-1, KH₂PO₄, 0.14 g L^-1, Ca (NO₃)₂ ^.4H₂O, 0.706 g L^-1de MgSO_4,0.325 g L^-1. 7H₂O, y micronutrientes: 0.022 g L^-1de Ultrasol micro mix. La solución fue ajustada a un pH de 6.0 - 6.5 con H₂SO₄ al 98% y H₃PO₄ al 85%, y conductividad eléctrica (CE) menor a 2.5 mS cm^-1. Las aplicaciones de los tratamientos con las soluciones de extractos y enraizadores, se llevaron a cabo en dos ocasiones: la primera a 15 DDS; y la segunda 30 DDS. Se aplicaron entre las 8:00 y 10:00 h, de forma directa al sustrato, mediante pipeta de 5 mL.

Evaluación en maceta

Previo al trasplante se prepararon las macetas con una capacidad de 5 L, mezclando Peat moss y perlita (1:1). El trasplante se llevó a cabo a maceta a los 41 DDS en charola, el 15 de junio de 2023, cuando el 100% de plantas alcanzaron los 15 cm. Se establecieron 11 tratamientos, 4 repeticiones y 3 plantas por repetición, con un total de 132 plántulas de tomate saladette y 132 de tomate bola. Las macetas se marcaron de acuerdo con el tratamiento y repetición. Las plantas se regaron por goteo, comenzando con una Solución Nutritiva al 50 % y a los 15 días después del trasplante (DDT), se aumentó la SN al 60%, la composición de la SN utilizada en maceta fue la misma empleada en charola. Se realizó una aplicación de los tratamientos, a los 15 DDT entre las 8:00 y 10:00 h al sustrato, mediante pipeta de 5 mL. Los tratamientos se aplicaron a los 15 DDT, entre las 8:00 y 10:00 h al sustrato, mediante pipeta 5 mL. La evaluación final en maceta se llevó a cabo a los 45 DDT.

Variables de crecimiento aéreo y radicular en charola y maceta

Las mediciones en charola se realizaron a los 40 DDS y en maceta a los 45 DDT, se tomaron 3 plantas completas por repetición, en total 12 plantas por tratamiento (11), en ambas evaluaciones. Las variables para crecimiento radicular fueron: Longitud de Raíz (LR, cm); Peso Fresco Raíz (PFR, g); Peso Seco Raíz (PSR, g) y en crecimiento aéreo: Longitud de Tallo (LT, cm); Diámetro de tallo (DT, mm); Peso Fresco Tallo (PFT, g); Peso Seco Tallo (PST, g).

Al inicio del trasplante de las variedades de tomate en invernadero, se presentó la plaga de mosquita blanca, en baja intensidad, que no causó daños en el desarrollo de las plántulas.

Análisis de datos

Los resultados se sometieron a un ANVA (p≤0.05), bajo un diseño completamente al azar, con tres plantas cada una, y una prueba de comparación de medias por método DMS de Fisher (α =0.05). Los datos se analizaron en el programa estadístico SAS (Statistical Analysis Systems) versión 9.4.

Evaluación in vitro

Los resultados obtenidos mostraron diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0.05) entre tratamientos. En el caso del tomate saladette los tratamientos R. muelleri 75 y J. dioica 75 tuvieron mayor crecimiento de LPR con 7.2 cm (Tabla 4), en la variable de PFP el extracto de J. dioica 75 tuvo la mayor LPR, superando a los testigos comerciales (Rootex con 8.3% y Raizal con 8.7% menos), y también en PFP fueron inferiores los enraizadores comerciales (Rootex con 15. 6% y Raizal con 13.2%). En cuanto al tomate bola, los tratamientos R. virens 75 y R. muelleri 200 presentaron la mayor LPR con 6.7 cm en ambos, mientras que el tratamiento R. muelleri 200 influyó positivamente para el mayor PFP (3.61 g) comparado con los enraizadores. Respecto a la variable LPR, los extractos de R. virens 75 y R. muelleri 200 superaron los enraizadores Rootex y Raizal con 8.2 y 10.4%, respectivamente, y en cuanto a PFP, el tratamiento de R. muelleri 200 superó a RT y RZ con un 9.1 y 9.69%, respectivamente. Los extractos R. virens 75, R. virens 200, R. muelleri 75, R. muelleri 200, J. dioica 75 y J. dioica 200, sobresalieron en la estimulación de las variables evaluadas in vitro, y fueron considerados en la evaluación de charola y maceta en invernadero.

Evaluación en charola

Los análisis de varianza mostraron diferencia (p ≤0.05) entre los extractos en tomate saladette para LR, los extractos R. muelleri 75 y R. muelleri 200 tuvieron el mayor crecimiento (12.7 y 12.8 cm, respectivamente) (Tabla 5) y JD 75 estimuló el mayor PFR y PSR (0.91 y 0.92 g, respectivamente). El tratamiento de R. muelleri 200 estimuló el mayor crecimiento aéreo en LT (19.7 cm) y también en DT (2.78 mm), el cual fue igual al tratamiento con Raizal. En relación con el tomate bola, el extracto RM 200, estimuló el mayor crecimiento de LR, PFR y PSR, (Tabla 5), valores que fueron iguales o superiores al de los testigos comerciales (RT y RZ). El extracto de J. dioica 75 estimuló el mayor crecimiento aéreo de DT con 3.12 mm, PFT con 2.59 g y el PST con 1.6 g, superando a los testigos comerciales (RZ y RT).

Evaluación en maceta

En tomate saladette, el extracto J. dioica 200, mostró el mayor valor de LR con 53 .0 cm (Tabla 6), seguido del extracto R. muelleri 200 que presentó un comportamiento sobresaliente en crecimiento radicular, con valores de 52.3 cm, 22.32 g y 6.88 g, para LR, PFR y PSR, respectivamente, y en crecimiento aéreo, con valores de 103.29 cm, 7.86 mm y 140.12 g para LT, DT y PFT respectivamente, valores que fueron superiores a los enraizadores comerciales (RT y RZ). En tomate bola también sobresalió el extracto RM 200, con mayor crecimiento radicular, con valores de 52.03 cm, 25.67 g, y 6.84g para LR, PFR y PSR, respectivamente y en crecimiento aéreo con valores de 108.6 cm, 151.9 g y 28.15 g para LT, PFT y PSR, respectivamente, valores superiores a los dos enraizadores comerciales (RT y RZ) (Tabla 6).

Evaluación in vitro

Los extractos R. muelleri 200 y J. dioica 75, fueron los más sobresalientes en esta etapa, promoviendo mayor crecimiento radicular y aéreo que los enraizadores comerciales, por lo que podríamos asumir que estos extractos de plantas están actuando como los enraizadores comerciales, lo que podría ser promovido por la composición polifenólica, así como de otros compuestos cuantificados en el presente estudio. En el extracto R. muelleri, su actividad podría atribuirse a que posee los mayores valores de CFT, TH y de actividad antioxidante (Tabla 1). Estos resultados ponen en evidencia que este extracto posee la más alta capacidad antioxidante para estabilizar radicales libres. Además, este extracto, mostró la mayor habilidad para reducir el Fe3⁺ a Fe2⁺ (^{Torres-Moreno et al. 2019}). La presencia de estos potenciales compuestos antioxidantes en las plantas mejora los mecanismos de actividad fisiológica, que permite el mayor desarrollo de las plantas (^{Tanase et al. 2019b}), lo cual hasta la fecha no ha sido reportado. En relación al extracto de J. dioica, su actividad podría atribuirse a los elevados valores de CPT y TC, compuestos que son más elevados que los de R. muelleri en 65.50 y 88.45%, respectivamente. Se ha reportado que la bioactividad de J. dioica se atribuye a la presencia de polifenoles, taninos y esteroles (triterpenos), entre otros (^{Ramirez-Moreno et al. 2020}), por lo anterior la estimulación sobresaliente que produce en el tomate podría atribuirse a los polifenoles y taninos condensados y triterpenos, a diferencia del extracto de R. muelleri, que es fundamentalmente por los flavonoides y la actividad antioxidante.

Los compuestos bioactivos de los extractos, son absorbidos durante el curso del pretratamiento de las semillas que actúan como precursores de vías bioquímicas para ayudar en la protrusión temprana de la radícula (^{Barone et al. 2018}). Los compuestos polifenólicos influyen en diferentes procesos fisiológicos relacionados con el crecimiento y desarrollo de las plantas, incluída la germinación de semillas, la división celular y la síntesis de pigmentos fotosintéticos (^{Tanase et al. 2019b}). El extracto polifenólico de vid contiene principios biológicos que influyen positivamente en el proceso de germinación en general, pero cuya acción es principalmente manifestada por la actividad de α-amilasa en las primeras 24 h del proceso de germinación (^{Tanase et al. 2019}b). El análisis fitoquímico de esta investigación (Tabla 1), mostró la presencia de flavonoides, los cuales desempeñan muchas funciones en las plantas, como regular el crecimiento celular, atraer insectos polinizadores y proteger contra el estrés biótico y abiótico (^{Rodríguez de Luna et al. 2020}).

Evaluación de crecimiento radicular y aéreo en charola y maceta

En los experimentos en charola y maceta, el extracto R. muelleri 200 fue el más sobresaliente superando a los enraizadores comerciales en promover el crecimiento radicular y aéreo de las plántulas de tomate de las dos variedades, seguido en estimulación por el extracto de J. dioica 75. El efecto estimulante de R. muelleri y J. dioica en el crecimiento aéreo y radicular en plántulas de tomate, se podría atribuir al contenido de polifenoles, flavonoides y actividad antioxidante (^{Jasso-de-Rodríguez et al. 2020}, ^{Ramírez-Moreno et al. 2020}). En R. muelleri se han identificado compuestos de naturaleza esteroidal y esteroide como Ethyl iso-allocholate, y Cholest-1-eno[2,1-a]naphthalene, 3’ ,4’-dihydro, respectivamente (^{Jasso-de Rodríguez et al. 2015}), estructuras que son base de los brasinoesteroides, ampliamente reconocidos como estimulantes del crecimiento vegetal y desarrollo de las plantas, implicados, en la elongación y división celular, la fotomorfogénesis, la diferenciación del xilema y la reproducción y estimulan la actividad antioxidante (^{Cáceres-Rodríguez et al. 2022}). Por otra parte, en las especies de Rhus se ha identificado ácido shikímico (^{Opiyo et al. 2021}), compuesto que se ha utilizado para promover el crecimiento y mejorar la calidad de los frutos de cultivos y hortalizas sin efectos negativos (^{Sayed et al. 2022}), el cual podría encontrarse en las hojas de R. muelleri, considerando los efectos mostrados en la presente investigación. La aplicación de un bioestimulante comercial (BALOX®), que contiene polifenoles, glicina y betaína como ingredientes bioactivos, fomentó el crecimiento de las plantas de tomate, especialmente a nivel de raíces en suelos salinos (^{Zuzunaga-Rosas et al. 2022}). Plantas de tomate bajo estrés salino, tratadas con un bioestimulante a base de taninos tuvieron un aumento significativo del 24% en el peso de las raíces y del 23% en su longitud (^{Campobenedetto et al. 2021}). Se ha sugerido que el ácido gálico, presente en abundancia en mezclas ricas en taninos debido a sus fuertes propiedades antioxidantes, podría desempeñar un papel crucial en el crecimiento, especialmente en el desarrollo temprano de las raíces y las plantas (^{Bhardwaj et al. 2015}). Por otra parte, ^{Singh et al. (2017)} demostraron que la aplicación exógena de ácido gálico en semillas de arroz condujo a un aumento en la longitud de las raíces en comparación con el grupo de control.

La actividad bioestimulante de R. muelleri y J. dioica podría estar promovida por la actividad antioxidante de los polifenoles, taninos, flavonoides y actividad antioxidante, así como esteroles, esteroides y terpenos, actuando en sinergía en los extractos. Los extractos de R. muelleri 200 y J. dioica 75 actúan como un bioestimulante natural, para inducir el crecimiento radicular y aéreo de las plántulas de tomate en charola y favorecen un buen establecimiento de las plantas después del trasplante, lo que facilita mejor desarrollo durante el ciclo del cultivo. Este el primer reporte científico de la actividad bioestimulante del extracto de J. dioica en tomate.