Obtención de material vegetal

En huertos del municipio de Uruapan, Michoacán, México, se colectaron 50 muestras directamente del árbol frutos de aguacate con síntomas de antracnosis y se colocaron en bolsas de papel; posteriormente fueron trasladados en hieleras con refrigerante al Laboratorio de Toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, en Saltillo, Coahuila.

Aislamiento y caracterización morfológica del hongo

Los frutos se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% y se secaron con toallas de papel estériles. Posteriormente, se hicieron cortes de 2 a 3 mm del tejido enfermo, se desinfectaron de nueva cuenta con hipoclorito de sodio al 1% por 3 min, se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron con toallas de papel estériles; se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) y finalmente se incubaron a 28 ◦C. Transcurridos cuatro días, se realizó el aislamiento y purificación de cultivos monospóricos.

La caracterización morfológica se realizó mediante la observación de estructuras macroscópicas y microscópicas bajo microscopio (Motic serie Ba310); se utilizó medio PDA después de siete días a 28 ◦C. Se observó el color al frente, al reverso y del centro de la colonia; se evaluó el tamaño, forma, largo y ancho de conidios, y se determinó la especie mediante las claves taxonómicas de ^{Sutton (1992)}.

Identificación molecular de los hongos fitopatógenos

Se empleó la técnica ITS-PCR. La extracción de ADN se realizó por el método de ^{Doyle y Doyle (1991)}, en el cual se raspó el micelio de cada uno de los aislados; se maceraron 0.2 g del micelio adicionando 500 µL de buffer (Tris-HCL, pH 8.5 50 mM, NaCl 50 mM y SDS 2%). El macerado se colocó en un vórtex durante 30 s; posteriormente, se reposó 15 min en hielo. Después se adicionaron 500 µL de cloroformo:alcohol isoamílico 24:1; nuevamente se agitó en el vórtex y se centrifugó a 12 000 rpm durante 15 min; se recuperó el sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf y se añadió un volumen igual de isopropanol al obtenido del sobrenadante. La mezcla reposó en hielo durante 15 min; y se centrifugó a 12 000 rpm durante 10 min y recuperó la pastilla. Finalmente se adicionaron 50 µL de agua desionizada estéril. La concentración y cuantificación de ADN se llevó a cabo en un espectrofotómetro.

Se amplificaron por PCR las regiones ITS1 e ITS4 entre los genes ribosomales (rDNA) 18S-5.8S- 28S, con el par de primers ITS1 (TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG)/ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). Se utilizó un termociclador (AXYGEN); la mezcla de reacción consistió de 0.5 µL del primer ITS1 a 10 µL, 0.5µL del primer ITS4 a 100 µM, 0.5µL; de Taq &Go 5X, 2 µL de ADN y 17 µL de agua ultra pura estéril para ajustar a un volumen final de 25 µL. La amplificación se realizó con 1 ciclo de desnaturalización inicial a 95 ◦C por 30s, 30 ciclos de desnaturalización a 95 ◦C por 30 s, 30 ciclos de alineamiento a 60 ◦C por 1 min, 30 ciclos de extensión a 68 ◦C por 1 min y 1 ciclo de extensión final a 68 ◦C por 5 min. El producto de la PCR se cargó en un gel de agarosa al 1% y se visualizó bajo UV a 60 V, y se purificó y secuenció en el laboratorio nacional del IPICYT. Las secuencias se compararon con las reportadas en la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI), mediante el programa BLAST.

Actividad antifúngica de metabolitos secundarios contra Colletotrichum acutatum

Se empleó el método de medio envenenado (^{Ochoa-Fuentes et al. 2012}). Las concentraciones evaluadas fueron 1 000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000 y 6 000 ppm para los principios activos botánicos D-limoneno y eucaliptol, y de 10, 20, 30, 50 y 100 ppm para β-citronelol. Se utilizaron cinco repeticiones por tratamientos. Se determinó la concentración y el volumen para cada metabolito, a partir de una solución madre y posteriormente se añadió a un matraz con la cantidad requerida de PDA estéril. Se colocaron explantes de 0.5 cm de diámetro con micelio activo del hongo de siete días de crecimiento; finalmente se incubaron a 28 ± 2°C hasta que el testigo sin tratamiento llenó la caja por completo. El crecimiento se midió diariamente con un vernier, los dos valores obtenidos en forma de cruz se promediaron para obtener el diámetro micelial desarrollado. El porcentaje de inhibición se determinó mediante la siguiente formula: Porcentaje de inhibición = [(crecimiento micelial del testigo - crecimiento del tratamiento) / crecimiento del testigo] x 100.

Inhibición de la esporulación y la germinación de conidios

Se utilizó la metodología propuesta por ^{González-Estrada et al. 2020}. Se utilizaron las mismas cajas Petri con las que se determinó el porcentaje de inhibición; transcurridos siete días, se emplearon las mismas concentraciones y tratamientos. Se realizó un barrido de esporas al agregar 9 mL de agua destilada estéril a la caja petri. Las esporas colectadas se transfirieron a un tubo de ensayo y se agitó en un vórtex; se tomaron 20 µL de la suspensión y se colocaron sobre una cámara Neubauer para cuantificar las esporas en un microscopio óptico (40X) (Motic serie Ba310).

Para la prueba de germinación se prepararon tubos Eppendorff con caldo papa-dextrosa. Cada tubo se inoculó con la misma concentración de esporas, posteriormente se incubaron a 26 °C en agitación constante durante 14 h. Se contaron las esporas germinadas y no germinadas con una cámara Neubauer cada 2 h hasta que el control germinó al 100%. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Análisis estadístico

Los datos del porcentaje de inhibición micelial se procesaron mediante una regresión Probit, mediante el método de máxima verosimilitud para determinar la CL₅₀ y sus límites fiduciales, también, los mismos datos de porcentaje de inhibición de crecimiento y de esporulación y germinación de conidios, se procesaron mediante realizó un análisis de varianza bajo un diseño completamente al azar. Las medias de los tratamientos se compararon con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05). En todos los casos se usó el programa SAS VER 9.0 ^{(SAS 2002)}.

Aislamiento del patógeno y la caracterización morfológica

Los aislados de hongos fitopatógenos obtenidas a partir del tejido dañado de aguacate por antracnosis fueron denominados como CAU1, CA2, CTU1 y CTU2. Las cepas CAU1, CAU2, CTU1 y CTU2 presentaron características macroscópicas y microscópica similares. Macroscópicas: crecimiento del micelio al azar, blanco denso, gris con la edad, con masas mucilaginosas color rosa salmón, setas y esclerosios ausentes, apresorios pálidos de marrón oscuro, como cápsulas ovoides y ligeramente irregulares. Microscópicas: conidios unicelulares rectos, hialinos, aceptados, cilíndricos con uno o ambos extremos puntiagudos; dimensiones: largo de 8.5 a 16.5 µm x ancho de 2.5 a 4.0 µm. Con base en las claves de ^{Barnett y Hunter (1998)} y lo descrito por ^{Sutton (1992)}, se obtuvo a Colletotrichum spp.

Identificación molecular

La amplificación de los fragmentos de genes con los indicadores ITS1 e ITS4 permitió determinar con precisión la especie utilizada en esta investigación. Se identificaron las cepas con índices de identidad de 99% con C. acutatum (Tabla 1). Comúnmente, la enfermedad de la antracnosis se ha asociado con la especie C. gloeosporioides. Sin embargo, ^{Méndez et al. (2015)}, realizaron la caracterización molecular de la antracnosis en aguacate en Michoacán, México encontrando a Colletotrichum golesporoides, Colletotrichum acutatum y Colletotrichum boninense, como causantes de la enfermedad.

Inhibición de la esporulación y la germinación de esporas

Los resultados de la esporulación de C. acutatum muestran que disminuyó la producción de esporas, con diferencias estadísticas significativas (p < 0.05) entre tratamientos. Los compuestos D-limoneno y eucaliptol mostraron un porcentaje de inhibición más bajo que β-citronelol, el cual inhibió la producción al 100% (Tabla 2). La germinación fue totalmente inhibida con las diferentes concentraciones evaluadas, en comparación con el control no tratado. Varios compuestos antimicrobianos inhiben la esporulación y germinación de los hongos, lo cual es importante en el control de estos fitopatógenos porque impide su reproducción y diseminación (^{Zapata et al. 2003}, ^{Bautista et al. 2004}). Los monoterpenos son compuestos que reducen la división celular e inhiben el consumo de oxígeno (^{Peñuelas et al. 1996}); también se sabe que inhiben la respiración mitocondrial, la fosforilación oxidativa y la síntesis de ADN (^{Koitabashi et al. 1997}). Los monoterpenos obtenidos de hojas de Sequoia sempervirens actuaron diferencialmente contra varias especies de hongos; algunas especies se inhibieron con dosis bajas, otras con dosis altas y otras se estimularon por algunos compuestos del extracto (^{Montes 2009}).

Determinación de la efectividad in vitro de D-limoneno, eucaliptol y β-citronelol

Los resultados de la actividad antifúngica de los tres PABs evaluados, sobre el desarrollo micelial de C. acutatum se muestran en la Tabla 3. β-citronelol presentó la mayor inhibición micelial (34.99 ppm) respecto a los otros metabolitos. Este monoterpenoide acíclico se encuentra naturalmente en varios aceites esenciales de plantas ^{(Sharma et al. 2016)}. Algunos estudios sugieren que la actividad antifúngica de β-citronelol puede ser debido a la inhibición de la biosíntesis de ergoresterol (^{Lim y Shin 2009}). La ausencia o presencia reducida de ergoresterol en la membrana fúngica resulta en una inestabilidad osmótica y metabólica de la célula fúngica, que compromete la reproducción y la actividad antifúngica. ^{Cerna-Chávez et al. (2019)} reportaron que β-citronelol inhibe el crecimiento de microrganismos fitopatógenos como Fusarium oxysporum y Rhizocotnia solani. Con respecto al eucaliptol, la inhibición de C. acutatum presentó una CL50 de 3238 ppm. ^{Morcia et al. (2012)} mencionan que este monotepeno mostró una fuerte actividad fungicida sobre cepas de hongos micotoxigénicos, pertenecientes a diferentes especies e implicadas en varias enfermedades de plantas, siendo tóxico a los hongos a la concentración más alta. Este compuesto es un monoterpeno líquido, incoloro, soluble en alcoholes, ampliamente utilizado en las industrias farmacológica, cosmética y alimentaria debido a sus propiedades organolépticas (^{Bhowal y Gopal 2016}).

D-limoneno fue el tratamiento con menor porcentaje de inhibición, con una CL50 de 8 829 ppm. Diversas investigaciones han demostrado que el D-limoneno aumenta la fluidez de las membranas fúngicas, lo que conduce a una alta permeabilidad inespecífica de la membrana y a su pérdida de integridad (^{Onken y Berger 1999}). Sin embargo, en este trabajo C. acutatum logró su crecimiento micelial a concentraciones elevadas de D-limoneno. Al respecto, los principales problemas involucrados en los procesos de biotransformación de monoterpenos como el D-limoneno son: i) La inestabilidad química, tanto del precursor, como del producto; ii) La baja solubilidad del precursor; iii) La alta volatilidad, tanto del precursor, como del producto; iv) La alta citotoxicidad, tanto el precursor, como el producto, y v) Las bajas tasas de transformación (^{Krings y Berger 1998}). Las tres primeras complicaciones son muy difíciles de superar, ya se relacionan con las características fisico-químicas inherentes al sistema; pero un buen cribado de cepas resistentes al limoneno podría superar la citotoxicidad y las bajas tasas de transformación ^{(Bicas y Pastore 2007)}.

Con respecto a la evaluación con el Eucaliptol la inhibición de C. acutatum CL50 de 3 238 ppm, a partir de la concertación máxima evaluada. ^{Morcia et al. (2012)} mencionaron que este monoterpeno mostró una fuerte actividad fungicida sobre cepas de hongos micotoxigenicos, pertenecientes a diferentes especies e implicadas en varias enfermedades de plantas siendo toxico a los hongos, en la concentración más alta. Este compuesto es un monoterpeno líquido incoloro soluble en alcoholes y es ampliamente utilizado en las industrias farmacológica, cosmética y alimentaria debido a sus propiedades organolépticas (^{Bhowal 2016}).

Las evaluaciones in vitro con β-citronelol mostraron altos porcentajes de inhibición en el crecimiento micelial, en la esporulación y en la germinación de C. acutatum en dosis bajas, por lo que este bioactivo resulta prometedor y podría evaluarse en el control de la antracnosis del aguacate a nivel campo