Extracción del almidón de maíz cacahuacintle

El almidón de MC se obtuvo de los granos de la variedad GC a partir del método propuesto por ^{Mir et al. (2017)}, con algunas modificaciones. Se sumergieron 200 g de maíz en 600 mL de metabisulfito de sodio al 0.16 % (p/p) durante 24 h. Posteriormente, los granos se lavaron con agua destilada, se molieron en una licuadora (Oster 465-15, México) y se tamizaron para obtener harina fina. Subsecuentemente, se añadió una solución de NaOH al 0.2 % (p/p) y se mantuvo en agitación durante 4 h. El sedimento se lavó cinco veces con agua destilada hasta alcanzar un pH de 7. La mezcla resultante se centrifugó (5810R, Eppendorf, Alemania) a 5000 × g por 10 min. El almidón resultante se separó y se secó en una estufa de aire forzado (HCF-62, Riossa Digital, México) a 40 °C durante 24 h.

Modificación química

El almidón de MC se modificó con OSA (MC_OSA) mediante el procedimiento descrito por ^{López-Monterrubio et al. (2023)}, con algunas modificaciones. Se dispersaron 30 g de MC en 100 mL de agua desionizada y se agitaron de manera continua. El pH de la dispersión se ajustó a 8.75 con una solución de NaOH 0.1 N. Posteriormente, se añadió cuidadosamente OSA (equivalente al 3.0 % del peso seco del almidón) y se mantuvo durante 6 h a 25 °C, controlando el pH a 8.75. Al finalizar la reacción, se neutralizó el pH con una solución de HCl 1 N. La mezcla resultante se centrifugó a 3 410 × g durante 5 min, seguida de dos lavados con agua desionizada y otro con acetona. El almidón modificado con OSA se secó en un horno a 35 °C durante 24 h.

Grado de sustitución del almidón modificado

El grado de sustitución (GS) del almidón de MC_OSA se determinó por el método de titulación descrito por ^{López-Silva et al. (2020)}, con algunas modificaciones. Se dispersaron 1.25 g de almidón de MC_OSA en 12.5 mL de una solución de HCl 0.1 M con agitación durante 30 min. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 3 000 × g por 10 min. El precipitado se lavó sucesivamente con etanol al 90 % (v/v) y dos veces con agua destilada; después, se suspendió en 75 mL de agua destilada y se colocó en un baño de agua a 90 °C durante 10 min. La mezcla se enfrió rápidamente a temperatura ambiente (mediante baño de hielo) y se tituló mientras se agitaba con una solución estándar de NaOH 0.1 M hasta alcanzar un pH de 8.3. Se tituló MC con el mismo procedimiento para obtener el valor de referencia. El volumen de NaOH gastado se utilizó para calcular el GS mediante la Ecuación 1:

donde A representa el volumen de NaOH requerido en la titulación de la muestra (mL), M es la molaridad de la solución de NaOH y P es el peso seco del almidón modificado (g).

Amilosa aparente

El contenido aparente de amilosa se determinó por el método propuesto por ^{Zhu et al. (2008)}, con algunas modificaciones. Se pesaron 0.1 g de cada muestra de almidón, se dispersaron en 1 mL de etanol (96 % p/v) y 10 mL de NaOH (1 M), con agitación constante durante 1 h. El almidón dispersado se transfirió a un matraz volumétrico y se aforó a 100 mL con agua destilada. Se tomó una alícuota de 2 mL, se vació en un matraz, y se añadieron 50 mL de agua destilada, 100 µL de fenolftaleína (1 % p/v), 2 mL de HCl (0.1 M) y 2 mL de reactivo de yoduro (2 g de KI y 0.2 g de yodo en 100 mL de agua destilada). El volumen se diluyó hasta 100 mL, y se midió la absorbancia a 510 y 620 nm en un espectrofotómetro (Spectronic Genesys 2, Thermo Electron Corporation, EUA). Las mediciones se realizaron por triplicado a partir de una curva estándar obtenida con muestras de amilosa y amilopectina.

Caracterización de los gránulos de almidón

Propiedades de la pasta

Las propiedades de la pasta de las suspensiones de almidón se evaluaron con un reómetro (Physica MCR 301, Anton Paar, Alemania), equipado con una geometría de placas paralelas de 50 mm de diámetro. Se colocaron dispersiones acuosas (5 % p/p) de los almidones (MC y MC_OSA) sobre una placa, y la geometría se colocó a un gap de 0.5 mm. Los bordes de la geometría de medición se cubrieron con aceite de silicona para evitar la deshidratación. El protocolo de prueba incluyó la aplicación de un ciclo de calentamiento y enfriamiento a 1 Hz y deformación de 1 %. El ciclo de temperaturas consistió en equilibrar muestras de almidón a 25 °C durante 5 min, seguido de un calentamiento gradual desde 25 hasta 90 °C a una velocidad de calentamiento de 6 °C∙min^-1. La temperatura se mantuvo durante 5 min; posteriormente, se enfrió de 90 a 25 °C a una velocidad de 6 °C∙min^-1 y se mantuvo a 25 °C durante 5 min (^{Mendez et al., 2011}). Los valores de la temperatura pico, viscosidad máxima, viscosidad final y viscosidad de ruptura se obtuvieron a partir de las gráficas de la pasta (pasting graphs).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado bajo un diseño completamente aleatorizado. Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Se llevó a cabo un análisis de varianza y, en los casos aplicables, una comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). El análisis estadístico se realizó en el programa Statgraphics Plus (Statistical Graphics Corp., Manugistics, Inc., EUA).

Contenido de amilosa, amilopectina y grado de sustitución

El Cuadro 1 muestra el contenido de amilosa, amilopectina y el GS. El contenido de amilosa y amilopectina varía según el origen botánico, lo cual resulta en diferentes proporciones de amilosa/amilopectina (^{Obadi et al., 2023}). Se observó una disminución significativa en el contenido de amilosa en MC_OSA, en compasión con MC. Este comportamiento es consistente con otros estudios que han reportado reducción en el contenido de amilosa tras la modificación con OSA (^{López-Monterrubio et al., 2023}; ^{Yao et al., 2024}). Algunos estudios han revelado que la esterificación ocurre principalmente en la región amorfa del almidón, que generalmente está compuesta de amilosa (^{Gao et al., 2021}). Además, durante el proceso de modificación del almidón, la superficie del gránulo se expande ligeramente para permitir la unión de los grupos octenilsuccinato, lo cual podría provocar la lixiviación de las moléculas de amilosa y, consecuentemente, la reducción del contenido de amilosa después de la modificación (^{Yao et al., 2024}). Por otro lado, el contenido de amilopectina en MC_OSA (77.80 ± 0.01 %) fue significativamente mayor que el presentado por el MC (72.60 ± 0.02 %). Este hallazgo refleja la relación compensatoria entre ambos componentes principales del almidón.

Los almidones OSA se obtienen mediante la reacción de esterificación entre los grupos hidroxilo del almidón y el OSA. En este contexto, un parámetro utilizado comúnmente es el GS, que representa el número promedio de derivados del octenilsuccinato por unidad de glucosa (^{Sweedman et al., 2013}). El GS para el almidón MC_OSA fue de 0.017 ± 0.005, ligeramente mayor al reportado por ^{López-Silva et al. (2020)} en almidón de maíz normal modificado con OSA (0.0112 ± 0.001). Esta variación se puede deber al mayor contenido de amilosa en el MC. Estudios previos revelaron que la esterificación con OSA es un proceso complejo influenciado por el contenido de amilosa, el tamaño de partícula y la estructura molecular, y cuya reacción ocurre principalmente en la región amorfa del almidón (^{Simsek et al., 2015}).

La sustitución con OSA puede ocurrir en los carbonos 2, 3 y 6 de la molécula de glucosa. Cuando el almidón se modifica con OSA, su naturaleza normalmente hidrofílica adquiere un comportamiento hidrofóbico (grupos octenilo), lo cual resulta en moléculas con carácter anfifílico. Este cambio es bien conocido debido a que mejora las propiedades de emulsificación y puede ser utilizado como emulsionante en sistemas alimentarios (^{Sweedman et al., 2013}; ^{Zhang et al., 2017}).

Distribución del tamaño de los gránulos de almidón

En el Cuadro 2 se muestra el D_3,2 y los diámetros en el 10, 50 y 90 % de la distribución acumulativa de los gránulos de los almidones (MC y MC_OSA). Los gránulos del MC_OSA mostraron un D_3,2 significativamente mayor (16.80 ± 0.10 μm) en comparación con su homólogo nativo (14.26 ± 0.06 μm). Estos resultados se respaldan con los volúmenes acumulativos d₁₀, d₅₀ y d₉₀, los cuales fueron mayores en el almidón del MC_OSA. El incremento en el tamaño se puede atribuir a la reacción con OSA en la superficie de los gránulos, lo cual provocó cambios significativos en su estructura superficial y, por ende, en su tamaño (^{Bajaj et al., 2019}). Además, este aumento podría ser el resultado de efectos de agregación inducidos por los cambios en la naturaleza anfifílica de los almidones modificados con OSA, lo que coincide con lo reportado por ^{López-Silva et al. (2019)}.

El valor de span fue significativamente mayor en MC_OSA, al ser 4.8 veces más grande que el de MC. Este hallazgo está relacionado con una distribución más amplia de tamaño de las partículas, lo cual se podría explicar por la mayor tendencia de los gránulos de almidón a aglomerarse (^{Domene-López et al., 2019}). Los gránulos de MC mostraron una distribución unimodal (Figura 1A(1)), con su mayor pico en 14.39 ± 0.03 µm. Por su parte, los gránulos de MC_OSA presentaron una distribución bimodal (Figura 1B(1)), con un pico grande en 15.02 ± 0.01 µm y uno pequeño en 158.73 ± 0.03 µm.

Figura 1 Micrografías y distribución de tamaño de gránulos de almidón: A) almidón de maíz cacahuacintle (MC) y B) almidón de maíz cacahuacintle modificado con anhídrido octenil succínico (MC_OSA). Magnificaciones: (1) 250×, (2) 1500× y (3) 2500×. 

Morfología de los gránulos de almidón

La Figura 1 muestra las micrografías de los gránulos de los almidones (MC y MC_OSA). De acuerdo con las imágenes, la modificación con OSA produjo cambios significativos en la forma y superficie del almidón. Los gránulos de MC exhibieron, principalmente, formas esféricas, aunque algunos presentaron formas más ovaladas o cilíndricas. Las variaciones morfológicas están influenciadas por el genotipo del maíz y por una matriz proteica menos rígida en el endospermo harinoso, como la que presenta el MC (^{Timm et al., 2020}).

La superficie de los gránulos del MC fue principalmente lisa, aunque algunos eran ligeramente rugosos (Figura 1A(3)). Sin embargo, la modificación con OSA alteró significativamente la morfología de los gránulos de almidón, al presentar superficies más rugosas con depresiones más pronunciadas y bordes menos definidos (Figura 1B(3)). Posiblemente, esto es el resultado de las reacciones de esterificación o de una hidrólisis leve durante el tratamiento preliminar con NaOH. Las protuberancias que presentaron los gránulos del MC_OSA están, probablemente, relacionadas con la agregación de cadenas de amilosa esterificadas con OSA concentradas en la superficie del gránulo (^{López-Silva et al., 2019}). Esto sugiere que la reacción ocurrió, principalmente, en la superficie y no en el interior de los gránulos (^{Xu et al., 2023}).

Análisis FTIR

Los espectros de infrarrojo de los almidones (MC y MC_OSA) se presentan en la Figura 2. La formación de grupos carboxilato se confirmó por esta técnica. Se puede observar que el almidón nativo y el modificado tienen perfiles similares. En el rango de 3 500 a 3 000 cm^-1 se detecta un pico ancho, el cual está relacionado con la presencia de grupos hidroxilo del almidón (O-H). Los picos a 2 930 y 2 880 cm^-1 se atribuyen a la vibración de estiramiento antisimétrico y simétrico de los grupos alifáticos CH₂ y CH₃, y se pueden atribuir a los ácidos grasos libres (^{Wei et al., 2020}). La banda en el rango de 1 700 a 1 600 cm^-1 está relacionada con el grupo amida I, lo cual sugiere la presencia de proteína en la superficie de los gránulos de almidón. La huella digital de los almidones se presenta en el pico más prominente entre 1 100 y 920 cm ^-1, donde se apreció un estiramiento del enlace C-O (^{Lu et al., 2019}).

Figura 2 Espectro FTIR del almidón de maíz cacahuacintle nativo (MC) y modificado con anhídrido octenil succínico (MC_OSA). 

En comparación con el almidón nativo, el almidón modificado mostró una banda de absorción a 1 570 cm^-1, atribuida a la vibración de estiramiento asimétrico del grupo carboxilo (COOH) o del grupo carboxilato (COO-), debido a la formación del almidón de otenilsuccinato de sodio en los sistemas de reacción alcalina. Los espectros FTIR confirmaron la modificación y evidenciaron la capacidad del grupo succinilo para esterificar las cadenas de almidón (^{Romero-Hernández et al., 2021}). Además, respaldan la eficacia del proceso de modificación con OSA para alterar las propiedades del almidón, lo cual sugiere su potencial aplicación en diversas áreas de la industria de alimentos.

Propiedades de la pasta

Los perfiles de la pasta de los almidones (MC y MC_OSA) se muestran en la Figura 3, y los valores de los parámetros se presentan en el Cuadro 3. Se puede identificar que la modificación química altera las características de la pasta y las propiedades funcionales del almidón debido a cambios estructurales.

Figura 3 Perfil de la pasta de almidón de maíz cacahuacintle nativo (MC) y modificado con anhídrido octenil succínico (MC_OSA). 

La temperatura en la cual la viscosidad comienza a aumentar se llama temperatura de la pasta (TP). Las TP de MC y MC_OSA coincidieron con las temperaturas de gelatinización (datos no mostrados). Se puede observar que MC_OSA presentó una TP más baja (60.90 °C) que MC (66.50 °C) (Cuadro 3). Esto indica que la incorporación del grupo octenilsuccinato altera la estructura ordenada del almidón modificado, lo cual facilita la penetración del agua y la hinchazón de los gránulos a temperaturas más bajas (^{López-Monterrubio et al., 2023}). Lo anterior está acorde con los reportes de ^{Bello-Flores et al. (2014)}, donde establecen que la modificación química con OSA de almidón de Musa paradisiaca incrementa la viscosidad de la pasta y produce una disminución de la TP.

La magnitud de la viscosidad pico del almidón de MC fue mucho mayor que la del MC_OSA. La modificación química revelada en FTIR y los cambios estructurales limitaron la región amorfa de los gránulos para atrapar agua y, en consecuencia, se presentó una menor viscosidad máxima (^{Salazar-Irrazabal et al., 2023}). La viscosidad de ruptura de los almidones varió entre 0.19 y 1.18 Pa∙s, donde el valor más alto lo presentó MC, lo cual indica que este almidón tuvo una mayor estabilidad que los modificados con OSA. ^{Núñez-Bretón et al. (2024)} mencionan que este comportamiento se debe a que existe una reestructuración de sus fracciones y un mayor rearreglo de la matriz polimérica. Asimismo, la viscosidad final del MC_OSA fue significativamente menor que la del MC. ^{Won et al. (2017)} encontraron una tendencia similar en almidón de papa modificado con OSA al compararlo con su contraparte nativa.

Viscosidad aparente

En la Figura 4 se presentan las curvas típicas de viscosidad aparente en función de la tasa de corte de los geles de almidón al 5 %. Se observa un comportamiento de adelgazamiento al corte similar para ambos geles (MC y MC_OSA); es decir, la viscosidad disminuye a medida que aumenta la tasa de corte. Este comportamiento está asociado con una alineación de las moléculas del biopolímero a la tasa de corte aplicada, lo cual modifica su conformación original y las interacciones biopolímero-biopolímero se interrumpen, con lo cual disminuye la fuerza de interacción entre las capas del flujo (^{Cortés-Viguri et al., 2021}). Se puede observar que el MC presentó los valores de viscosidad más altos en todo el rango de tasa de corte.

Figura 4 Curvas de flujo de los geles de almidón de maíz cacahuacintle nativo (MC) y modificado con anhídrido octenil succínico (MC_OSA). 

Los perfiles de flujo experimentales presentaron una adecuada correlación (R² > 0.98) con el modelo de Herschel-Bulkley (Cuadro 4). Los valores de n obtenidos para los almidones se encuentran entre 0.16 y 0.59, lo cual indica que ambos presentaron un comportamiento pseudoplástico (n < 1), aunque fue significativamente menor con el MC. La magnitud de K del MC fue significativamente superior (99.19) que el de MC_OSA (3.66); es decir, el MC estaba más estructurado en la fase dispersa y presentó viscosidades más altas/ en el rango de tasa de corte estudiado (^{Marboh & Mahanta, 2023}).

Cuadro 4 Parámetros reológicos del modelo de Herschel-Bulkley. 

Tipo de almidón	τ0(Pa)	K (Pa∙s n)	n
MC	3.85 ± 0.25 b	99.19 ± 0.71 a	0.16 ± 0.01 b
MCOSA	8.12 ± 0.28 a	3.66 ± 0.19 b	0.59 ± 0.02 a

MC: almidones de maíz cacahuacintle en su forma nativa; MC_OSA: almidones modificados con anhídrido octenil succínico. Los datos son expresados como la media ± desviación estándar. Medias con letras iguales dentro de cada columna no difieren estadísticamente (Tukey, P ≤ 0.05).

Espectro mecánico

Los cambios en los módulos de almacenamiento (G’) y de pérdida (G’’) en función de la frecuencia de los geles de MC y MC_OSA se muestran en la Figura 5. Las magnitudes de G’ del MC fueron relativamente superiores a las de G’’, lo cual sugiere que los geles presentaron un comportamiento más elástico que viscoso. El módulo de almacenamiento del MC incrementó en todo el rango de frecuencia, lo que indicó la formación de redes interconectadas parecidas a geles elásticos. Sin embargo, los geles del MC_OSA presentaron aumentos regulares de G’ y G’’ en valores de frecuencias menores a 25 Hz, mientras que en valores superiores hubo una disminución gradual hasta 65 Hz, frecuencia en la cual G’ disminuyó drásticamente, acompañado de un cambio de carácter elástico a viscoso. La modificación con OSA del almidón tuvo un efecto significativo en la consistencia de los geles. ^{Zhang et al. (2021)} señalan que los grupos octenilsuccinato en el almidón pueden modificar su hidrofobicidad, al debilitar los puentes de hidrógeno intramoleculares, ya que una mayor cantidad de grupos hidroxilo interactúan con moléculas de agua, lo cual limita las interacciones en la cadena de amilosa y reduce la fuerza del gel. Lo anterior es más evidente a medida que incrementa el GS.

Figura 5 Espectros mecánicos de los geles de almidón de maíz cacahuacintle nativo (MC) y modificado con anhídrido octenil succínico (MC_OSA).