Extracto acuoso de estevia (AES)

Las hojas secas de S. rebaudiana Bertoni se molieron. Posteriormente, en un vaso de precipitado se pesó 1 g de las hojas secas, se le añadió 10 mL de agua y se dejó en baño de agua a 40 °C durante 60 minutos con agitación constante. La suspensión se filtró al vacío para obtener el AES y se congeló a -20 °C hasta su uso (^{Shukla et al., 2012a})

Contenido de compuestos fenólicos totales (TPC)

El TPC se determinó por el método Folin-Ciocalteu (^{Lemus-Mondaca et al., 2018}). Para la cuantificación de estos compuestos se utilizó una curva de calibración de ácido gálico (GA) de 10 a 100 mg de GA. Todas las mediciones se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como mg GAE/100 g de materia seca.

Ensayos de capacidad antioxidante in vitro

Para evaluar la capacidad antioxidante del AES se utilizaron tres métodos diferentes a concentraciones de 2.5, 5 y 10 mg/mL.

Ensayo de poder reductor férrico (FRAP)

Se pesó en tubo de ensayo 1 g de muestra, adicionando 2.5 mL de regulador de fosfatos y 2.5 mL de solución de ferricianuro de potasio al 1 % y se incubó durante 20 minutos a 50 °C en una incubadora Isotherm® General Purpose Incubator, ESCO. Luego, se añadieron 2.5 mL de ácido tricloroacético al 10 % a cada tubo de ensayo, y se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos. Se mezclaron 2.5 mL del sobrenadante con 2.5 mL de agua destilada y 0.5 mL de solución de cloruro férrico al 0.1 %. La absorbancia se leyó a 700 nm (^{Vijayalakshmi & Ruckmani, 2016}).

Actividad de eliminación de radicales hidroxilo (OH·)

El ensayo se realizó evaluando las propiedades de barrido contra OH · generado a partir de la reacción de Fenton (^{Brands et al., 2019}), mediante la adición de 1 mL de 1-10 fenantrolina, 2 mL de regulador de fosfatos pH 7.4, 1 mL de FeSO₄, 1 mL de H₂O₂ 0.12 %, 1 mL de AES (2.5, 5 y 10 mg/ mL) cada uno disuelto en agua destilada; la mezcla se incubó a 37 °C durante 90 min y se midió su absorbancia a 536 nm.

Ensayo de inhibición de radical libre DPPH

La capacidad de eliminación de radicales 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) se determinó de acuerdo a lo reportado anteriormente (^{Di Maro et al., 2013}). Se tomaron 1.5 mL de los extractos acuosos de AES (2.5, 5 y 10 mg/mL) y se les añadió 1.5 mL de DPPH 0.1 mM en etanol al 95 %. La mezcla se agitó y se mantuvo en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. El efecto de inhibición de radicales libres DPPH se midió a 517 nm.

Inhibición de productos finales de glicación avanzada (AGEs): formación de AGEs en los sistemas de albúmina de suero bovino (BSA)/ glucosa y BSA/fructosa.

2 mL de los AES (2.5, 5 y 10 mL) se colocaron en tubos cónicos de 15 mL, añadiendo 0.67 mL de una solución de BSA/glucosa (10 mg/mL), más regulador de NaCl y fosfatos con azida de sodio al 0.02 % pH 7.4 (para llegar a un volumen total de 5 mL), incubándose esta solución a 37 ºC por 21 días . Este mismo procedimiento se llevó a cabo con BSA/fructosa (^{Hori et al., 2012}) Para este experimento se utilizó metformina (50 mg/mL) como control positivo, además de un blanco. La determinación se llevó a cabo por triplicado. La formación de AGEs se evaluó mediante la longitud de onda de excitación (370 nm) y emisión (440 nm) en un espectrofotómetro de fluorescencia (lector de microplacas Varioskan Lux, Thermo Fisher, 2000) (^{Aranda-González et al., 2015}).

UHPLC MS/MS identificación y cuantificación de esteviósidos

Para la identificación de los glucósidos de esteviol, se inyectaron 5 µL de AES (2.5, 5 y 10 mg/mL) en una columna UHPLC RP-C18 (tamaño de partícula de 2.1x100 mm, 1.7 µm). La elución se realizó variando la proporción de disolvente A (agua desionizada) a disolvente B (acetonitrilo al 100 %), como sigue: H₂O: acetonitrilo al 100 % (60:40), a los 15 minutos; H₂O: acetonitrilo al 100 % (60:40), a los 22 min; H₂O: acetonitrilo al 100 % (50:50), a los 25 min, y finalmente, H₂O: acetonitrilo al 100 % (0:100), a los 28 min. El tiempo total de ejecución fue de 37 min. La temperatura de la columna fue de 30 ºC. El flujo utilizado fue 0.7 mL/min.

Cada glucósido se identificó registrando los espectros de masa y MS/MS de cada pico cromatográfico obtenido, aplicando el algoritmo FIND BY FORMULA (^{Aranda-González et al., 2015}). Las condiciones de registro de los espectros de masas fueron las siguientes: un intervalo de registro entre 100-1700 m/z; velocidad de escaneo: 1 m/z; ionización por electropulverización (ESI) como fuente de ionización. Modo: negativo, energía de colisión: 0, temperatura del gas 320 °C y voltajes de fragmentación variables.

Para obtener las curvas de calibración y cuantificar las concentraciones de esteviósido y rebaudiósido A, se inyectaron 5 µL de ambos estándares (0.25-3.00 mg/mL), utilizando una columna RP-C18. Se usó el mismo gradiente de separación aplicado previamente. Se obtuvieron los cromatogramas correspondientes; las curvas de calibración se realizaron con las señales de masa a 803.370 m/z para el esteviósido y 965.422 m/z para el rebaudiósido A. Las condiciones del registro del espectro de masas fueron las mismas que se describieron anteriormente. Para la cuantificación de las muestras de extractos de S. rebaudiana Bertoni se prepararon éstas tomando 200 µL de extracto y diluyéndolo con agua destilada para un volumen final de 700 µL. Finalmente, se inyectaron 5 µL de cada muestra por triplicado en el equipo con las mismas condiciones de separación y registro que las utilizadas para la curva de calibración.

Contenido de compuestos fenólicos totales (TPC)

La mayoría de las investigaciones se han dirigido a la identificación de plantas con capacidad antioxidante puesto que los antioxidantes sintéticos disponibles han mostrado toxicidad en contraste con aquellos provenientes de fuentes naturales (^{Shukla et al., 2012a}). La Figura 1A muestra que el contenido de compuestos fenólicos fue directamente proporcional a la concentración del extracto acuoso, lo que sugiere que el AES puede tener altos niveles de actividad antioxidante. De acuerdo con la literatura el contenido total de polifenoles del extracto acuoso de S. rebaudiana Bertoni varía en promedio 20.1 ± 0.4 mg GAE/g (^{Grozeva et al., 2015}). La cantidad de polifenoles que se encontró en los AES fue mayor que en el extracto etanólico al 95 % (15.6 ± 0.4 vs 12.75 ± 0.55) e incluso mayor que el extracto de hojas de stevia metanólica reportado por otros autores (Jahan et al., 2015).

A) Contenido total de compuestos fenólicos, B) Actividad antioxidante férrica, C) Actividad de eliminación de radicales hidroxilo, D) Actividad inhibidora de radicales DPPH. E) Inhibición de productos finales de glicación avanzada (AGEs). Metformina como control. En todos los casos los valores se expresan como media ± SD de tres determinaciones independientes. Letras diferentes indican una diferencia significativa (p<0.05), según lo determinado por la prueba de rango múltiple de Tukey.

Figura 1 Extracto acuoso de hoja de S. rebaudiana Bertoni. 

Existen varios compuestos fenólicos reportados en extractos de S. rebaudiana Bertoni, siendo los más relevantes el ácido clorogénico, el ácido elágico, la cumarina, la hesperidina y el ácido rosmarínico además del eugenol, la cumarina y la vainillina, dependiendo de las condiciones de cultivo (Jahan et al., 2015; ^{Grozeva et al., 2015}). El consumo en la dieta de estos compuestos polifenólicos puede prevenir el desarrollo de algunos tipos de displasia, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, diabetes y osteoporosis, como lo demuestran los estudios en modelos in vitro y modelos animales (^{Santos-Sánchez et al., 2019}).

Ensayo de poder reductor férrico (FRAP)

Los compuestos antioxidantes donan electrones a radicales reactivos reduciéndolos a especies más estables; una mayor absorbancia indica un mayor poder reductor férrico (^{Bursal & Köksal, 2011}). En la Figura 1B se observa que la absorbancia del AES fue dependiente de la concentración, alcanzando la densidad óptica más alta a 10 mg/mL. Estos resultados concuerdan con los reportados previamente (^{Rao, 2014}), donde las concentraciones más altas mostraron la mayor absorbancia en las hojas de S. rebaudiana Bertoni. La capacidad de reducción férrica se asocia generalmente con la capacidad de romper la cadena de radicales libres mediante la donación de un átomo de hidrógeno y se usa ampliamente para evaluar las propiedades antioxidantes de los fitoquímicos de la dieta (^{Najafian & Moradi, 2017}).

Ensayo de inhibición de radical libre DPPH

En la Figura 1D se presenta el efecto de AES sobre la eliminación de radicales DPPH como porcentaje de inhibición. Se registró una diferencia significativa entre las concentraciones (p≤0.05) con un comportamiento inverso dependiente de la concentración. La mayor concentración de AES (10 mg/mL) mostró una mayor actividad, con un 60 % de inhibición de DPPH, valor inferior al 72 % publicado con anterioridad (^{Ruiz-Ruiz et al., 2017}). El radical libre DPPH puede reaccionar con compuestos antioxidantes a través de un proceso caracterizado por la transferencia de un átomo de hidrógeno proporcionado por el agente antioxidante y su respuesta depende de la concentración. Se recomiendan bajas concentraciones de este reactivo para obtener resultados confiables (^{Santos-Sánchez et al., 2019}).

Otros autores (^{Periche et al., 2015}) informaron que las condiciones de secado aplicadas en las hojas frescas de estevia tienen un impacto significativo en los glucósidos de esteviol y los antioxidantes mediante un aumento en la capacidad antioxidante pero una disminución en la concentración de esteviósidos; en esta investigación, el AES mostró una capacidad antioxidante que puede atribuirse a otros compuestos con actividad antioxidante como compuestos fenólicos tal como, los ácidos fenólicos (ácido clorogénico, ácido cafeico y ácido transferúlico) y flavonoides (rutina), presentes en extractos acuosos de hojas de estevia (^{Lemus-Mondaca et al., 2018}).

Finalmente, es importante enfatizar que DPPH y FRAP se clasifican como métodos basados en la transferencia individual de electrones. Aunque estas pruebas son similares en términos de resultados, se centran en diferentes mecanismos: la prueba DPPH se lleva a cabo en medios alcohólicos y FRAP en medios de reacción ácidos y no líquidos. Por lo tanto, ambos pueden usarse para corroborar los datos obtenidos y evaluar, por ejemplo, las posibles aplicaciones prácticas de las muestras analizadas (^{Álvarez-Robles et al., 2016}).

Actividad de eliminación de radicales hidroxilo (OH·)

El radical hidroxilo es un radical libre extremadamente reactivo formado en sistemas biológicos; es capaz de dañar casi todas las moléculas que se encuentran en las células vivas. Este radical puede unir nucleótidos en el DNA y causar la rotura de la cadena conduciendo a carcinogénesis, mutagénesis y citotoxicidad (^{Kim et al., 2011}); la generación de radicales OH· es particularmente peligrosa para las membranas celulares. En la presente investigación, todos los extractos tuvieron actividad de eliminación de radicales hidroxilo de una manera dependiente de la dosis, donde el mayor porcentaje de inhibición se encontró en 10 mg/mL (Figura 1C). En estudios previos (^{Stoyanova et al., 2011}; ^{Hajihashemi & Geuns, 2013}; ^{Shukla et al., 2012b}) se ha documentado que S. rebaudiana Bertoni posee una alta actividad de captación de especies reactivas de oxígeno (OH·).

El porcentaje de inhibición sobre la eliminación de radicales hidroxilo fue 13.03 %, 14.36 % y 17.51 %, para cada concentración con un comportamiento dependiente de la dosis, respectivamente; por lo tanto, el extracto es capaz de inhibir y reducir los radicales libres al terminar la reacción en cadena de los radicales, actuando como agente reductor (^{Kim et al., 2011}). Todos los estudios publicados al respecto muestran que los extractos por sí mismos ejercen efectos depuradores de especies reactivas de oxígeno (ROS) (^{Hajihashemi & Geuns, 2013}). Las plantas contienen compuestos fenólicos cuyo grupo hidroxilo contenido en un anillo aromático puede interrumpir las reacciones de oxidación en cadena mediante la donación de un átomo de hidrógeno o metales quelantes, mismos que actúan como agentes reductores y antioxidantes. Altas cantidades de compuestos fenólicos indican mayor capacidad antioxidante (^{Jahan et al., 2010}). En S. rebaudiana Bertoni, el contenido de fenoles y rebaudiósido A se ha correlacionado de manera significativa y positiva con la capacidad antioxidante (^{Tavarini & Angelini, 2013}).

Inhibición de productos finales de glicación avanzada (AGEs)

La modificación de algunas proteínas fisiológicas cruciales causadas por la formación de AGEs es un factor importante en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la edad, como la aterosclerosis, la diabetes y sus complicaciones. La Figura 1E muestra el efecto del AES a diferentes concentraciones en la formación de AGEs fluorescentes en el sistema modelo de glicación BSA/glucosa, BSA/fructosa durante 21 días. AES afecta la formación de AGEs de manera dependiente de la dosis. A 100 mg/mL, AES exhibe una mejor actividad antiglicación (96.5 %) en comparación con el control de metformina (89 %). Varias plantas comestibles o sus extractos han mostrado actividades de antiglicación en modelos BSA/glucosa, BSA/fructosa (^{Kaewnarin et al., 2014}).

Los componentes principales de las plantas comestibles contienen compuestos fenólicos y flavonoides como catequina, epicatequina, quercetina, rutina, ácido elágico, ácido cumárico, entre otros, que exhiben capacidad antioxidante. El extracto acuoso de hoja de S. rebaudiana Bertoni contiene altos niveles de compuestos fenólicos totales, lo que resulta en una mayor capacidad antioxidante que es capaz de inhibir o reducir los radicales libres para interrumpir el estado oxidativo. Ya que el AES exhibe una alta actividad antiglicación, se puede inferir que los compuestos antioxidantes que contiene pudieran suprimir la formación de AGEs y la oxidación de proteínas. El alto contenido de compuestos fenólicos y una capacidad importante para eliminar especies reactivas de oxígeno en radicales hidroxilo y DPPH presentes en el AES podrían explicar la reducción de la oxidación de proteínas medida por la formación de AGEs.

Con respecto al papel de los esteviósidos en la prevención de la formación de AGEs, se ha informado el posible mecanismo de actividad antiglicación. Éste parece estar relacionado con la inhibición de la interacción entre glucosa y aminoácidos. Se sabe que los glucósidos de esteviol compiten con la glucosa para unirse al portador inhibiendo así la entrada de glucosa en las células, disminuyendo por lo tanto la glicación (^{Rizzo et al., 2013}).

El AES puede inhibir la formación de AGEs debido a su capacidad de eliminación de especies reactivas de oxígeno en los radicales hidroxilos y DPPH durante la autooxidación del azúcar y la degradación oxidativa de los productos Amadori, lo que conduce a una oxidación proteica reducida. Se han propuesto otros mecanismos de antiglicación, particularmente para inhibir la formación de productos Amadori en etapa tardía, rompiendo las estructuras de reticulación en los AGEs formados intracelularmente (^{Díaz-Casasola & Luna-Pichardo, 2016}). Se requieren más estudios exhaustivos de Stevia rebaudiana Bertoni para confirmar los mecanismos de antiglicación descritos anteriormente.

UHPLC MS/MS: identificación y cuantificación de esteviósidos

La Figura 2 muestra los espectros de los esteviósidos del extracto de Stevia rebaudiana Bertoni obtenido de la identificación UHPLC. Los picos notorios fueron 9, cuya identificación se presenta en el Tabla 1. Durante la identificación, se encontraron dos picos con el mismo peso molecular a pesar de ser compuestos diferentes (esteviolbiósido y rubosósido). Es posible distinguirlos por la diferencia en el tiempo de retención (^{Gardana et al., 2010}) Con respecto a los resultados de la cuantificación de los esteviósidos, los datos obtenidos en este estudio difieren de los reportados previamente (^{Aranda-González et al., 2015}): el valor de esteviósido fue de 5.018 ± 0.18 mg GAE/100 g, que es más alto que el informado con anterioridad (^{Gardana et al., 2010}), sin embargo, el valor de rebaudiósido A fue menor (7.79 ± 2.05 mg GAE/100 g vs 15.15 ± 0.02 mg GAE/100 g). Por otro lado, ^{Aranda-González et al. (2015)} publicaron un contenido de rebaudiósido A que fue desde el 2 % al 54 % en hojas secas de S. rebaudiana Bertoni. Esta variabilidad puede deberse a la variedad de estevia, a las condiciones climáticas y la agricultura, ya que estos factores contribuyen a la cantidad y tipo de glucósidos en la planta.

Figura 2 Esteviósidos identificados en el extracto acuoso de Stevia rebaudiana Bertoni por UHPLC MS/MS. 

Se ha descubierto que la misma variedad puede tener un mayor contenido de glucósidos si está expuesta a una alta radiación solar o si se cultiva con una densidad específica desde 12.5 a 25 plantas por metro cuadrado (^{Jarma-Orozco et al., 2011}). Respecto al contenido total de esteviósidos se ha publicado que puede variar de un 4 % hasta 22 % dependiendo de las condiciones (^{Aranda-González et al., 2015}).