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Revista mexicana de ciencias forestales
Print version ISSN 2007-1132
Rev. mex. de cienc. forestales vol.3 n.9 México Jan./Feb. 2012
Artículo
Análisis de pigmentos, peroxidasa, prolina y proteínas de tres especies de Paulownia bajo estres hídrico
Analysis of pigments, peroxidase, proline and proteins of three Paulownia species under water stress
José Manuel Llano Sotelo1 y Lilia Alcaraz Meléndez2*
1 Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas. Universidad de Sonora.
2 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Correo-e: lalcaraz04@cibnor.mx
Fecha de recepción: 16 de mayo de 2011.
Fecha de aceptación: 21 de febrero de 2012.
RESUMEN
Los árboles del género Paulownia son de rápido crecimiento y tienen importancia económica en Asia como materia prima de uso común en la elaboración de muebles, instrumentos musicales y cercos, lo que ha despertado interés por cultivarlos en diferentes ambientes. Con el objetivo de evaluar la tolerancia al estrés hídrico se eligieron tres especies, P. imperialis , P. fortunei y P. elongata, porque son las que se utilizan en China con mayor frecuencia en la reforestación y en la industria maderera. Se realizaron análisis bioquímicos de las hojas para determinar los siguientes componentes: como pigmentos, a las clorofilas total, a y b ; β-caroteno, violaxantina y luteína); las enzimas peroxidasa y prolina, así como proteínas solubles, insolubles y totales en tres diferentes condiciones de humedad del suelo, bajo dos condiciones ambientales, campo e invernadero, entre los cuales se observaron diferencias significativas; destaca un incremento del contenido de pigmentos y peroxidasa, y una disminución de las proteínas y prolina en el ambiente controlado, principalmente. Al evaluar la respuesta al estrés hídrico entre las especies se concluyó que P. imperialis y P. elongata son más tolerantes que P. fortunei , debido a su mayor contenido de prolina, mas proteínas totales y solubles, indicadores de una mejor tolerancia a condiciones de estrés.
Palabras clave: Aminoácidos, luteína, Paulownia elongata S. Y. Hu, Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl., Paulownia imperialis Siebold & Zucc., peroxidasa, violaxantina.
ABSTRACT
Paulownia trees are fast growing and are economically important in Asia as raw material regularly used for furniture, musical instruments, fences, etc., which rose some interest in their cultivation in different environments. In order to assess water stress tolerance, three of these species, P. imperialis , P. fortunei and P. elongate, were selected as they are the most commonly used in reforestation and wood industry in China. Biochemical analyses were performed in leaves, to determine the following elements: pigments (total, a and b chlorophyll; β-carotene, violaxanthin; lutein), peroxidase, proline, total, soluble and insoluble proteins, under three moisture soil concentrations and two environments, field and greenhouse, the latter of which revealed significant differences between them; there is an increment in pigment and peroxidase content and a decrease in protein and proline content, mainly in the greenhouse environment. When water stress was assessed among species, it was concluded that P. imperialis and P. elongata are more tolerant than P. fortunei because of their higher content of proline, total and soluble proteins, which are major tolerance markers in stress conditions.
Key words: Amino acids, luthein, Paulownia elongata S. Y. Hu, Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl., Paulownia imperialis Siebold & Zucc., peroxidase, violaxantin.
INTRODUCCIÓN
Los árboles del género Paulownia son de rápido crecimiento y producen madera de buena calidad, por lo que en China este material es de uso común en la elaboración de muebles, instrumentos musicales, cercos (Yao, 1990). Estas características han despertado el interés por cultivarlos en diferentes ambientes, incluso aquellos con problemas de sequía.
El estrés hídrico en las plantas se manifiesta con cambios a nivel celular, fisiológico y del desarrollo (Larcher, 1995). En el primero se protegen las estructuras celulares con las proteínas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) o con un ajuste osmótico, por medio de la síntesis de osmolitos, como prolina, betaina, sacarosa, pinitol y aldosa (Bray, 1993). Desde el punto de vista fisiológico se presenta el cierre de estomas, cambios en el crecimiento de raíz, tallo y hojas (Parsons, 1987) e inhibición de la fotosíntesis, como resultado de la disminución del factor de acoplamiento del adenosin trifosfato (ATP) y la ATP sintetasa (Tezara et al ., 1999).
En este contexto, la ejecución de un estudio sobre el análisis bioquímico para conocer la respuesta de Paulownia elongata S. Y. Hu, Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl., Paulownia imperialis Siebold & Zucc. al estrés hídrico es de suma importancia. Existen registros de la acumulación de prolina en condiciones de estrés hídrico. Por ejemplo, Handa et al . (1983) la relacionan con la reducción en el contenido de las proteínas solubles en las células. Fukutoku y Yamada (1984) lo hacen con la síntesis de la misma proteína procedente de la degradación de proteínas solubles de la hoja, en cambio, Gibon et al . (2000) lo asocian con la pérdida de clorofilas y la disminución de la actividad mitocondrial. Stewart et al . (1977) refieren que el exceso de prolina está relacionada con la inhibición de la formación de ácido glutámico y una menor oxidación de prolina. Así, el objetivo del presente trabajo fue investigar la tolerancia al estrés hídrico de tres las especies de Paulownia anteriormente indicadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de humedad del suelo en campo e invernadero.- Las plantas pertenecen al Campo Experimental del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, en La Paz, B.C.S. Con base en trabajos anteriores (Llano- Sotelo et al., 2010), en los cuales se determinó el potencial hídrico del suelo, se probó la capacidad de campo de la siguiente manera: testigo (25.9 ± 1.4%), humedad intermedia (12.7 ± 1%) y humedad baja en el suelo (9.3 ± 1.8%). Una vez sometidas las plantas a estas condiciones, se tomaron muestras de cinco hojas por individuo (n= 4) de cada una de las tres especies de Paulownia .
Los experimentos en invernadero se realizaron en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del mismo Centro. Las plantas se sembraron en bolsas de plástico negro de 2 L con una mezcla de dos partes de turba ( peat moss , Pro- Mix) y una parte de arena; se mantuvieron con luz fluorescente continua a una intensidad de 61.1 ± 15.2 µmols-1m-2 La temperatura fue de 23.4 ± 2°C y la humedad relativa de 72.2 ± 4.6%. La humedad en el suelo permaneció a capacidad de campo, en el testigo fue de 47.8% ± 2.2, la intermedia de 15.7% ± 0.8 y la baja de 8.2% ± 0.6. Se tomaron muestras de cinco hojas por individuo (n= 9) y especie.
Análisis de pigmentos. La extracción de los pigmentos se realizó con acetona grado HPLC (100%), a partir de muestras de 2 mg de hojas liofilizadas. Los extractos permanecieron 24 h a -20 °C, después se centrifugaron a 4,000 rpm, 15 min a 5 °C. Los extractos se pasaron por un filtro de fibra de vidrio de poro de 0.45 µm. El sobrenadante se recuperó y guardó en un tubo Eppendorf y se almacenó a -20 °C, en oscuridad.
Se identificaron y cuantificaron clorofilas a, b, total, β-caroteno, violaxantina y luteína, de acuerdo al método descrito por Vidussi et al . (1996); mediante el método de cromatografía líquida de alta presión (HPLC, Hewlett Packard, modelo 1100). Se tomaron 20 µL y se inyectaron en el equipo de cromatografía. Para la separación de los pigmentos se empleó una fase móvil conjugada con dos soluciones: la solución A correspondió a una mezcla de metanol, acetato de amonio 1 N en una proporción 70:30 v/v y la solución B de metanol grado HPLC 100%. La fase estacionaria fue una columna Hypersil C8, de 10 cm de longitud, 0.45 cm de diámetro lleno con partículas de sílice de 5 µm. El detector fue un arreglo de diodos con un intervalo de longitud de onda de 190-900 nm y capacidad para determinar cinco longitudes de onda fijas. La cuantificación se llevó a cabo con una curva de calibración en concentraciones de 20, 40, 60, 80 y 100 ng/mL del estándar.
Análisis de prolina. Por medio del método de Bates et al . (1973), se tomaron 50 mg por muestra liofilizada, los cuales se molieron con 5 mL de ácido sulfosalicílico acuoso (3% w/v) en un homogenizador Polytron, Willems®. Las muestras se centrifugaron en una microcentrífuga Sanyo Hawk/05, a 1,200 rpm, 10 min y a 5 °C. Dos mililitros del filtrado se colocaron en un tubo de ensayo. El blanco consistió en ácido sulfosalicílico al 3%. A cada tubo de ensayo se le agregaron 2 mL de ácido acético glacial y 2 mL de ninhidrina ácida. La mezcla fue homogenizada con un mezclador Vortex (Modelo K-550 G, Scientific Industries). Los tubos de ensayo se pusieron en Baño María por una hora. Se finalizó la reacción con hielo, hasta bajar la temperatura; cuando esta alcanzó la temperatura ambiente, se extrajo la mezcla con 4 mL de tolueno y se colocó en un Vortex por 20 s. El sobrenadante se tomó con pipeta Pasteur y se leyó a 520 nm con el espectrofotómetro Spectro master modelo 415 de Fisher Scientific.
Análisis de peroxidasas. Se determinaron con el método de Bergmeyer (1974): se tomaron 50 mg de hojas liofilizadas, a las que se les añadieron 5 mL de buffer de fosfato 0.1 M, pH 7 y homogeneizó en un equipo Polytron, Willems®. Los tubos se colocaron en hielo para evitar la desnaturalización de las enzimas. La mezcla se centrifugó en una microcentrífuga refrigerada (Sanyo Hawk/05) a 1,200 rpm, 10 min y 5°C. En una celda se agregaron 3 mL de buffer de fosfato 0.1 M, pH 7, 0.05 mL de solución de guaiacol 20.1 mM, 0.1 de muestra, 0.03 mL de solución de peróxido de hidrógeno 12.3 mM. Las lecturas se hicieron a 436 nm con el espectofotómetro Spectro Master (Modelo 415, Fisher Scientific, Pittsburg, PA), cada 30 s hasta 120 s.
Análisis de proteínas. Las proteínas solubles, insolubles y totales se determinaron de acuerdo a Bradford (1976). En el caso de la proteína soluble se pesaron 50 mg de hojas molidas liofilizadas, se añadieron 5 mL de buffer de fosfato, 50 mM, se molió con el homogenizador Polytron, Willems. Los tubos se enfriaron en hielo, se centrifugó con la microcentrífuga refrigerada Sanyo Hawk/05 a 1,200 rpm, 10 min y a 5°C. Las proteínas solubles se precipitaron con 1 mL de ácido tricloroacético al 10% y se centrifugó (centrífuga Damon/IEC Division Modelo IEC HN-S) a 3500 rpm, 10 min. Las proteínas precipitadas se disolvieron con 5 mL de NaOH 0.1 N; se tomaron 100 µL de solución y se añadieron 5 mL de reactivo de Bradford. Se agitaron con el Vortex (Modelo K-550G Scientific Industries, Inc,), después de cinco minutos se leyó en el espectrofotómetro (Spectro Master, Modelo 415 Fisher Scientific) a 595 nm. Los estándares se prepararon con albúmina bovina. Las proteínas insolubles se calcularon por diferencia entre la proteína total y la soluble.
Análisis estadístico. Se realizaron pruebas de análisis multifactorial de varianza (ANOVA) y el análisis de una vía para determinar las diferencias significativas (Least Significant Test, LSD). Las comparaciones de medias fueron probadas al 5% de probabilidad, con una comparación múltiple de Tukey (Zar, 1974). El análisis se realizó con el paquete estadístico NCSS (Statistical and Power Analysis Software, 2000).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Plantas en campo.- En el Cuadro 1 se presentan los resultados correspondientes a los pigmentos. El contenido de clorofila a, b, total y β-caroteno en las hojas disminuyó cuando aumentó el estrés hídrico en el suelo, en las tres especies estudiadas. Randall et al . (1977) registraron en maíz ( Zea mays L. cv. Funk's 4808) una reducción de clorofila total, cuando el potencial hídrico baja; sin embargo, Brown et al. (1995) observaron que el estrés hídrico no afectó los niveles de clorofila total en maíz. Sairam y Saxena (2000) citan una menor cantidad en el contenido de clorofila total y caroteno en diferentes genotipos de trigo ( Triticum sp.), al reducirse la humedad en el suelo.
La violaxantina en Paulownia elongata aumentó de 0.09 a 0.15 ng µg-1, en P . fortunei permaneció en 0.07 µg-1y en P . imperialis cambió de 0.17 a 0.16 µg-1. La luteína en P . elongata tuvo un valor de 0.39 a 0.3 µg-1, en P . fortunei disminuyó de 0.55 a 0.50 µg-1 y en P . imperialis se tuvo un incremento de 0.31 a 0.49 µg-1. El comportamiento de la luteína en esta última especie pudiese relacionarse con la protección de la especie contra el estrés, ya que en la literatura se informa sobre trabajos en los que esta cambia, al variar la iluminación en las hojas; además se plantea un ciclo de la luteína (Matsubara et al . 2007).
Los resultados referentes a los contenidos de peroxidasas y prolina se resumen en el Cuadro 2. Las peroxidasas mostraron diferencias significativas en P . fortunei , respecto al testigo, y en P . elongata y P . imperialis no se registraron. Sairam y Saxena (2000) consignan un incremento en peroxidasa al reducirse la humedad en el suelo. Las hojas en expansión de Lolium temulentum L. cuando crecen bajo déficit de agua, aumentan la actividad de la peroxidasa en su pared celular (Stuart et al ., 1997). Brown et al . (1995) manifiestan que el estrés hídrico no afecta los niveles de ascorbato peroxidasa en células de hojas de maíz.
En Paulownia imperialis se determinó mayor cantidad de prolina (20.7 a 30.8 µmol peso seco-1), le sigue P. elongata (17.2 a 18.9 µmol peso seco-1) y por último P. fortunei (9.5 a 17.1 µmol peso seco-1); aunque no se obtuvieron diferencias significativas en ninguna de las tres especies al someterlas a estrés hídrico. Hay varias posibilidades por las que se incrementa la prolina cuando lo hace el estrés hídrico en el suelo; Stewart et al. (1997) demostraron que la acumulación de prolina se produce por la inhibición de la síntesis de ácido glutámico. Fukutoku y Yamada (1984), al trabajar con frijol soya ( Glycine max (L.) Merr.) mencionan que se debe a la degradación de las proteínas solubles de las hojas. Handa et al . (1983) descubrieron un incremento y posterior disminución de la prolina en células de tomate ( Licopersicon esculentum P. Mill.) al aumentar el estrés hídrico del suelo. Las células con mayor contenido de prolina fueron las que tenían menor proteína soluble. En las variedades de caña de azúcar ( Saccharum officinarum L.) la respuesta al estrés hídrico en el suelo, es variable y se observa en ambos sentidos (Rincones, 1997). Gibon et al . (2000) relacionan la acumulación de prolina con la pérdida de clorofilas y con la reducción de la actividad mitocondrial. El incremento también se relaciona con la translocación de compuestos nitrogenados de las hojas senescentes. Killingbeck y Whitford (2001) documentan esta actividad en 50% de hojas senescentes en plantas del Desierto Chihuahuense.
La proteína total aumenta significativamente en P . elongata y no existen diferencias significativas en P . fortunei y P . imperialis, al reducirse la humedad en el suelo (Cuadro 3). Brown et al . (1995) hallaron que el estrés hídrico no afectó los niveles de proteína en células de hojas de Zea mays . La proteína soluble en P . elongata disminuyó significativamente, en tanto que en P . imperialis aumentó significativamente al bajar la humedad en el suelo, en P. fortunei los valores de concentración fueron muy bajos. El incremento en la proteína soluble puede relacionarse con el aumento de las proteínas ( Late Embriogenesis Abundance ) LEA. Estas proteínas hidrofílicas globulares se sintetizan en mayor cantidad cuando hay déficit de agua (Bray, 1997). La insoluble creció significativamente en P . elongata; en tanto que, en P . imperialis no hubo diferencias significativas al disminuir la humedad en el suelo; así mismo no se detectaron en P. fortunei, por el contenido tan bajo de proteínas. El incremento en las proteína insoluble al bajar el contenido hídrico del suelo es posible que responda al aumento de proteínas (proteínas ricas en glicina) GRPs, ya que la glicina tiene una función importante en el efecto de sequía en las plantas (Jeffrey, 1987; Showalter, 1993).
Análisis en plantas en invernadero. Al igual que en las muestras tomadas en el campo, los resultados del contenido de clorofila a, b , total y β-caroteno en las hojas muestran, una reducción, cuando disminuye el contenido de humedad en el suelo (Cuadro 4). La comparación entre las especies estudiadas, evidencia que la clorofila total en P. imperialis es mayor, que en los otros taxa. Bourque y Naylor, (1971) consignan en Canavalia ensiformis (L.) DC. una disminución en la acumulación de clorofila total, cuando hay poca humedad en el suelo. El β-caroteno en P . elongata fue menor en la condición de humedad más baja, con diferencias significativas. En P . fortunei y P . imperialis no hubo diferencias significativas. Demmig et al. (1988) citan un decremento de β-caroteno, cuando la humedad en el suelo es menor. El β-caroteno interviene en la absorción de la radiación, que no es captada por las clorofilas (Hendry, 1999), también protege contra los radicales de oxígeno que se producen (Foyer et al. , 1994). La violaxantina no tuvo diferencias significativas en las tres especies estudiadas al bajar el contenido de humedad en el suelo. La luteína disminuyó en P. elongata y P. imperialis , no así en P. fortunei bajo la misma condición del suelo (Cuadro 4). Munné y Alegre (2000) observaron que las variaciones en las xantofilas se deben a los cambios en la radiación. Así mismo, Demming et al. (1988) demostraron que al disminuir la humedad en el suelo, se reduce el contenido de violaxantina en la rosa laurel ( Nerium oleander L.).
Las peroxidasas no tuvieron diferencias significativas en P. elongata y P. fortunei ; en P. imperialis si hubo un decremento de peroxidasa al aumentar el estrés hídrico en el suelo (Cuadro 5). Navrot et al. (2006) documentan un aumento en algunas isoformas de peroxidasa y disminución en otras como Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. sometida a déficit de agua. Por otro lado, la reacción de Mehler se presenta cuando se tiene más transporte de electrones que fotosíntesis, lo que produce más peróxido de hidógeno y peroxidasa (Apel y Hirt, 2004).
Al analizar el contenido de prolina no se determinaron diferencias significativas en las tres especies estudiadas con el incremento del estrés hídrico en el suelo (Cuadro 5). Sin embargo, se observó que P . fortunei tiene mayor contenido de prolina que P . elongata y P . imperialis ; mientras que, P . elongata contiene más prolina que P . imperialis ., por lo que hay relación entre proporción de la pérdida de clorofila y el contenido de prolina. Sofo et al. (2004) describen el aumento de prolina en Olea europea L. en respuesta al estrés hídrico en el suelo.
Los resultados de proteína total, soluble e insoluble se resumen en el Cuadro 6. En Paulownia elongata es notorio un decremento de proteína total, al ser menor la humedad en el suelo; en tanto que, en P . fortunei y P . imperialis se observa el incremento de la proteína total, al bajar la humedad en el suelo. En estas dos especies, las diferencias son significativas. Barnett y Taylor (1966) obtuvieron una disminución de proteína total en pasto Bermuda ( Cynodon dactylon, L.) a mayor estrés hídrico. La proteína soluble aumentó en P . elongata significativamente, mientras que en P . fortunei y P . imperialis no hubo diferencias significativas al reducirse la humedad en el suelo. Al igual que en las plantas desarrolladas en el campo, el aumento en la proteína soluble puede obedecer al incremento de las proteínas LEA. Estas proteínas hidrofílicas globulares se elevan cuando hay déficit de agua (Bray, 1997). La proteína insoluble en P . elongata disminuyó significativamente, en P . fortunei no hubo variación y en P . imperialis aumentó significativamente. La mayor cantidad de proteína insoluble es posible que responda al incremento de proteínas GRPs, las cuales están formadas por uniones tipo beta y se relacionan con la elasticidad de las paredes celulares, lo que permite una mejor adaptación de las células a las condiciones de estrés hídrico (Showalter, 1993).
La evaluación de los análisis bioquímicos a la respuesta al estrés hídrico evidencia que P. imperialis y P. elongata son más tolerantes que P. fortunei; resultado que corroboro lo publicado por Llano-Sotelo et al. (2010) quienes analizaron condiciones fisiológicas bajo estrés hídrico en el suelo, como intercambio gaseoso, conductancia estomática, transpiración, potencial hídrico y eficiencia del uso del agua, lo que sugiere que son especies con desarrollo aceptable en suelos bajo sequía.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron diferencias significativas en las condiciones de campo e invernadero, con respecto a los análisis bioquímicos realizados. Los resultados de contenido de prolina en P . imperialis presuponen mayor resistencia al estrés hídrico en comparación con P . elongata y P . fortunei . No hubo diferencias significativas en el contenido de peroxidasa, al disminuir el contenido de humedad en el suelo, tanto en condiciones de invernadero como en campo, por lo que no se pueden considerar las peroxidasas como indicadores de respuesta al estrés hídrico en las especies y condiciones estudiadas.
La escasa cantidad de los pigmentos indica que la fase luminosa de la fotosíntesis es poco afectada en P. elongata , P . fortunei y P . imperialis al ser sometidas a estrés hídrico. El mayor contenido de proteína total y soluble en P . elongata y P . imperialis sugiere que estas son más eficientes en el uso del agua, que P . fortunei.
La evaluación de la respuesta al estrés hídrico entre las especies considera que P. imperialis y P. elongata son más tolerantes que P. fortunei, lo que corrobora lo publicado en otros trabajos con estas especies.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Comisión Nacional Forestal (CONAFOR) por el apoyo otorgado con el proyecto CONAFOR-2002-C01-5327. Se agradece a personal del CIBNOR, especialmente al M. en C. Margarito Rodríguez y Tec. Sergio Real por el apoyo técnico en invernadero y campo, al Dr. Francisco E. Hernández Sandoval por la colaboración en la cuantificación de los pigmentos, a la M. en C. Diana Dorantes por su apoyo en la traducción al inglés del Resumen; al Dr. Alejandro Castellanos del DICTUS de la Universidad de Sonora, por su apoyo.
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