Los búfalos (Bubalus bubalis) y vacunos (Bos taurus) son bovinos, muy emparentados que solo los diferencia su ADN mitocondrial¹. Búfalos y vacunos son poliéstricos estacionales, con dos o tres ondas foliculares por ciclo estral²; sin embargo en iguales condiciones medioambientales y de manejo su función reproductiva es diferente evidenciado en la tasa de natalidad, expresión de celo y respuesta a las biotecnologías reproductivas. También se ha descrito que el búfalo tiene ovarios de menor tamaño³, diferente diámetro folicular al momento de la desviación y de la ovulación⁴, menor calidad de oocitos y menor tasa de producción de embriones comparados con los vacunos. Li et al⁵ encontraron 40 loci (asociados con 28 genes) que pudieron relacionarse con parámetros reproductivos tales como edad al primero, segundo y tercer parto, días abiertos, servicios por concepción e intervalo entre partos^5,6. La formación de un oocito competente depende del desarrollo folicular, en una la formación de un folículo preantral con un oocito capaz de formar el individuo y la segunda es el desarrollo de este folículo hasta la ovulación, asociado a todos los cambios endocrinos que deben suceder en la hembra para lograrlo^7,8.

El control de la población folicular depende de la función que ejerce la hormona antimulleriana (AMH), los que van a ovular deben adquirir receptores para la hormona folículo estimulante (FSH), finalmente algún folículo gana receptores para LHr⁸, lo que genera un descenso en la velocidad de crecimiento que se mantiene hasta el pico preovulatorio de LH^9,10.

Se ha informado que el oocito bufalino es de pobre calidad cuando es evaluado con los parámetros que normalmente se usan para los vacunos, y aunque no se conoce en detalle las razones se ha propuesto como causa: un microambiente folicular adverso, lo que ha motivado a los investigadores a estudiar las proteínas del líquido folicular bufalino¹¹. Se ha demostrado que la comunicación existente entre las células de granulosa y el oocito juegan un papel fundamental para producir oocitos de buena calidad¹². Hoy en día es factible el análisis en profundidad de los eventos reproductivos en la hembra bovina. Es innegable el avance logrado con los microarreglos y otros sistemas usados en transcriptómica, los datos son depositados en repositorios, que pueden analizarse y permiten al investigador evaluar sus premisas. Sin embargo es una base heterogénea debido a todos los aspectos técnicos y las herramientas computacionales usadas para el análisis de la misma¹³. En un estudio reciente, Khan et al¹⁰ generaron una interfase interactiva llamada GranulosaIMAGE, que provee información sobre los perfiles de expresión de los genes y sus isoformas en las células de granulosa de vacunos en diferentes estados de la foliculogénesis (http://emb bioinfo.fsaa.ulaval.ca/granulosaIMAGE/).

Una herramienta importante es Ingenuity Pathway Analysis (IPA) que es una base datos que se usa para el análisis, integración e interpretación de los datos relacionados con experimentos basados en información obtenida mediante RNAseq, principalmente IPA permite en un solo análisis, identificar las moléculas reguladoras, lo que facilita la explicación de los patrones de expresión, prediciendo las consecuencias del control sugerido sobre la biología celular y sobre la presentación de las enfermedades¹⁴. El programa hace los cálculos basados en algoritmos y datos experimentales¹⁵ finalmente en los cuales los genes expresados diferencialmente en el experimento son asociados con aquellos que se han informado más frecuentemente en una función particular o vía metabólica¹⁶ y sus sistemas de control¹⁷.

Los desarrollos en bioinformática permiten el estudio de fenómenos biológicos de una forma compleja: en este caso las diferencias en la expresión génica de folículos de búfalos y de vacunos, de una forma más global, que permiten por los menos considerar todos los posibles genes que se expresan en un momento dado, mostrando los detalles de la expresión génica y de las posibles alternativas que la naturaleza ha generado para la realización de un mismo proceso. El objetivo del presente trabajo es evaluar si existen diferencias en la expresión génica de células de granulosa de folículos preovulatorios búfalos y vacunos tendientes a buscar explicaciones al diferencial de respuesta a las biotecnologías reproductivas observado entre las especies mencionadas.

Este trabajo fue realizado en dos fases: la primera, se realizó una búsqueda bibliográfica exhaustiva, en las bases de datos de PUBMED y Google Académico, enfocándola en información correspondiente a los análisis de expresión génica entre búfalos y vacas y cuyos archivos estuvieran depositados en GEO (Gene Expression Omnibus) hasta marzo del 2018, la segunda, se realizó el análisis de los reportes encontrados. El criterio de inclusión fue: experimentos donde hubiera comparación de datos; o si no había comparación, que los datos fueran obtenidos de la misma forma y procesados de forma similar.

Se encontraron dos estudios de transcriptomas de folículo preovulatorio^18,19. En el caso de las vacas el RNA fue extraído con RNeasy mini kit (Qiagen) y en el de búfalo con TRIZOL seguido de purificación con RNeasy mini kit, en ambos casos se obtuvo cDNA y fueron hibridizados con un Chip de Affimetrix (Affymetrix Gene - Chip Bovine Genome Arrays), que contenían 24,128 sondas, representando 23,000 transcritos y sus variantes, incluyendo 19,000 clúster unigénicos. Aquellos genes con un cambio en la expresión ≥2 con una tasa falsa de descubrimiento (FDR < 0.05) fueron considerados como expresados diferentemente, posteriormente se realizó una RT-PCR semi cuantitativa para la validación de los resultados con los siguientes genes: receptor de LH (LHR), receptor de la progesterona (PR) y ciclooxigenasa COX-2 en búfalos, y dos genes del citocromo P450 relacionados con la producción de estrógenos, Citocromo 450 CPY19A1, CPY17A1, 18s, para los vacunos.

Posteriormente, los datos crudos de cada microarreglo se corrigieron mediante la remoción del ruido de fondo (Background) y normalización (loess) utilizando el software FlexArray 1.6.1, y todos los datos fueron exportados a archivos de excell (Microsoft Office) para ser analizados de forma funcional usando Ingenuity^® Pathway Analysis (IPA). Se utilizó como genoma de comparación UMD Bos taurus 3.1.1 para ambos casos, dado que el genoma bufalino aún no está totalmente secuenciado. Se obtuvo de una lista de genes diferencialmente expresados de los folículos preovulatorios de cada especie y se cuantificó esta diferencia, se agruparon de acuerdo a su función biológica y a los potenciales reguladores corriente arriba (upstream). La información se procesó individualmente y compararon entre las dos especies. El programa funciona asignándole un valor probabilístico a la asociación entre los genes sobre o sub expresados y las principales funciones biológicas. Para el análisis de los reguladores corriente arriba, IPA^® compara los resultados del experimento con su propia base de datos de los efectos conocidos de los genes y moléculas sobre la expresión. De cada regulador se calculan dos valores, un valor de sobreposición (overlap p) y un valor de activación (Z score), que corresponde a un promedio numérico calculado de los efectos conocidos de la molécula o gen (up or down regulation) y sus respectivos blancos. Se considera un valor de Z significante cuando tiene un valor mayor a 2 (Z-score > 2) para activación y (Z-score < 2) para inhibición, los valores intermedios se consideran que no pueden ser atribuibles a la experimentación¹⁴.

Se encontraron 21 reportes de expresión génica en células de la granulosa bovinas en los que hubiera al menos una base de datos depositada, y de estos solamente uno tenía información de búfalos. No hubo reportes de comparación de expresión diferencial de genes entre búfalos y vacas. Finalmente los requisitos se cumplieron por dos reportes: “Transcriptome profiling of granulosa cells of bovine ovarian follicles during growth from small to large antral sizes”, número de acceso GSE39589 con cuatro repeticiones¹⁹, y “Buffalo Gene expression profiling of preovulatory follicle in the buffalo cow: effects of increased IGF-I concentration on periovulatory events”, número de acceso GSE11312, con tres repeticiones¹⁸.

En los trabajos iniciales se informa que existen en las búfalas 110 genes diferencialmente expresados que pertenecen a 14 vías metabólicas de acuerdo con la base de datos de Ontología Génica (Gene ontology), para las vacas se encontraron 446 genes que pertenecían a 10 vías metabólicas.

El análisis de IPA muestra que las más importantes vías metabólicas canónicas asociadas con el patrón de expresión observado en el búfalo fueron: Ubiquitinación de proteínas, disfunción mitocondrial, fosforilación oxidativa y la señalización asociada al receptor de estrógenos y de las sirtuinas, en las vacas las vías canónicas más importantes son la síntesis de triacilglicéridos , traductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) , maduración de fagosomas, Proteína Kinasa Janus 2 (JAK 2) en la señalización de hormonas parecidas a las citoquinas y la de la Oncostatina (Cuadro 1).

El análisis del IPA mostró que estaban activados los genes o moléculas de las siguientes rutas HNF4A, RICTOR, EIF4E,1-2-dithiol-3-thione, STI926 en los búfalos, sin estar ninguno caracterizado en búfalos y para las vacas fueron factor transformante beta 1 (TGFB1), Receptor de estrógenos tipo B2 (ERBB2), dexametasona, beta-estradiol, D-glucosa (Cuadro 2).

Las redes funcionales más importantes para los búfalos fueron: 1) transporte molecular, tráfico del RNA y modificaciones postraduccionales, 2) señalización celular, modificaciones postraduccionales, y síntesis proteica, 3) ensamblaje y organización celular, desórdenes del desarrollo y hereditarios, 4) modificaciones postranscripcionales del RNA, síntesis proteica y expresión génica, mantenimiento y función celular, modificaciones postraduccionales y doblamiento de proteínas. Para las vacas 1) organización y ensamblaje de la célula, desordenes del desarrollo y enfermedades neurológicas, 2) metabolismo de lípidos, bioquímica de moléculas pequeñas, señalización e interacción intracelular, 3) muerte y supervivencia de las células, interacción entre ellas y cáncer, 4) transporte molecular, señalización celular y metabolismo de vitaminas y minerales (Cuadro 3).

En este trabajo se comparó: la expresión génica en folículos preovulatorios entre dos especies muy relacionadas, la forma de hacerlo es un abordaje novedoso para tener más conocimiento. A primera vista no se encuentra una estricta relación entre los conceptos enunciados en la introducción y los resultados del experimento. Este hecho se puede considerar para ser discutido pues antes de hacer el análisis el pensamiento de los investigadores estaba centrado en el conocimiento existente sobre el control endocrino y el desarrollo del folículo en las especies y los resultados muestran una información asociada a aspectos relacionados casi exclusivamente con biología celular y molecular.

Es importante resaltar la dificultad para encontrar información comparable, y dado el enfoque biológico del escrito, se decide evitar la discusión técnica sobre la forma de obtención de los datos y su análisis, que es tan frecuente en este tipo de publicaciones. En un trabajo previo del grupo²⁰, donde se describe lo informado en los dos artículos evaluados en este estudio, se muestra que en los folículos preovulatorios de vacas y búfalos solamente hay coincidencia en la expresión de tres genes (20 %): activador tisular del plasminógeno (PLAT), regulador agudo esteroidogénico, (STAR), receptor parecido I al factor II de coagulación (F2RL-1), con diferencias en los niveles de expresión (expresión relativa) 9,7 vs 17,5, 8,74 vs 3,4, and 7,7 vs 5,3 veces para PLAT, STAR y F2RL-1 respectivamente, mostrando las diferencias entre las especies. Adicionalmente no se ha informado que alguno de los genes encontrados tenga que ver directamente sobre la ovulación, el desarrollo folicular o que sean marcadores de los mismos procesos biológicos.

PLAT es una serina-proteasa secretada que convierte la proenzima plasminógeno en plasmina, una proteína fibrinolítica. Un aumento de su función causa hiperfibrinólísis que se evidencia por el excesivo sangrado y una disminución de su función causa hipofribrinólisis que se evidencia por trombosis y embolismo se ha informado sobre expresada en células de granulosa de folículos ovulatorios y se ha asociado con la ruptura folicular²¹.

STAR, tiene un papel importante en la regulación aguda de la síntesis de hormonas esteroidales, permite el rompimiento del colesterol a pregnenolona para facilitar su transporte de la membrana externa a la interna en la mitocondria. En búfalos se ha informado que la expresión esta aumentada (up regulated) en las células de granulosa y pared folicular después del tratamiento de hormona de crecimiento bovina¹⁸, adicionalmente un sinergismo entre el factor de crecimiento insulinoide 1 y las gonadotropinas para aumentar la expresión de STAR²².

F2RL-1, es una proteína que pertenece a la familia de las que están asociadas al receptor tipo I de las proteínas G, tiene además función sobre la respuesta inflamatoria, en la inmunidad innata y adaptativa²³. La señalización a través de este gen (F2RL-1) media la citogénesis in vitro de las células endoteliales y promueve la vasodilatación y permeabilidad microvascular, pasos fundamentales de la angiogénesis. Se ha observado la sobreexpresión del gen F2RL-1 que explican en parte los cambios de crecimiento de los vasos sanguíneos de las células de la teca, y la invasión de las células de granulosa murales después de la ruptura folicular²⁴.

Aunque hay una correspondencia baja entre las dos especies, los genes comunes están asociados a los mecanismos de ovulación, genes asociados con la forma como la célula realiza su función. No se observan genes expresados diferencialmente asociados a los fenómenos que dirigen el proceso como gonadotropinas o esteroides sexuales. En consecuencia, se debe encontrar una forma nueva de ver y analizar los datos obtenidos, ya que lo encontrado es más bien la descripción de cómo se ejecuta un fenómeno que en este caso serían los factores proteolíticos para el rompimiento del folículo, los cambios en la vasculatura para el remodelamiento del órgano y la acumulación de estrógenos para generar el pico de LH. Para algunos autores la ovulación ha sido asociada con inflamación²⁵, pudiera entonces suponerse que las dos especies hacen lo mismo, con un grupo de moléculas maestras generales y otro de efectoras que pueden ser muy específicas y marcar las diferencias observadas.

La ubiquitinación de proteínas es la ruta más importante para la degradación de proteínas reguladoras de vida media. Hatzirodos et al²⁰, encontraron que esta ruta está involucrada en la transición de un folículo pequeño a grande. Otros investigadores, lo encontraron como regulador de los receptores de andrógenos en los humanos²⁶.

Las mitocondrias son los principales consumidores de oxígeno de la célula; se ha informado el efecto que tiene el buen funcionamiento de la vía para la competencia del oocito por su papel en la formación de especies reactivas de oxígeno²⁷. En mujeres, se ha propuesto la transferencia de mitocondrias como una alternativa para el tratamiento de oocitos provenientes de pacientes con enfermedades que incluyen alteraciones en las mitocondrias²⁸, también en humanos obesos que la disfunción mitocondrial se asocia con alteraciones en la fertilidad. Se ha informado en búfalos que la suplementación de los medios de maduración para producir embriones in vitro, con cistina con o sin cisteamina incrementa significativamente la proporción de oocitos que presentan fertilización normal, clivaje y producción de blastocistos²⁹.

La fosforilación oxidativa es el proceso mediante el cual la célula produce ATP. Li et al⁶ reportaron en los búfalos que la fosforilación oxidativa es importante para las primeras fases del desarrollo folicular. También se ha informado su rol en el proceso ovulatorio dada la naturaleza hipóxica del procesos, se ha mostrado evidencia en la que el folículo necesita producir más moléculas para la respuesta hipóxica en los folículos antrales preovulatorios⁵.

Las sirtuinas pertenecen a la clase III de enzimas deacetilasas que utilizan el NAD+ como sustrato para realizar su función, se ha reportado que existen 7 en mamíferos con múltiples funciones (SIRT 1-7), tienen función como reguladores de la transcripción en envejecimiento, metabolismo, cáncer, inflamación, reparación del ADN y respuesta celular al stress³⁰.

Se ha reportado que SIRT1, SIRT2 and SIRT3 tienen función protectora para el envejecimiento del oocito después de la ovulación, además SIRT3 tiene un papel en la detección de especies reactivas de oxigeno (ROS) en la foliculogénesis y los procesos de luteinización de las células de granulosa³¹. Pacella-Ince, et al, han descrito que niveles bajos de mRNA de la SIRT 5 mitocondrial están asociados con una reducida reserva ovárica y envejecimiento del ovario en humanos³².

Dentro de las vías metabólicas más importantes en vacas se encuentran:

Biosíntesis de triacilglicerol. En la literatura está ampliamente documentado el efecto de las gotas lipídicas sobre la calidad y función de los oocitos³³. Hoy en día se consideran como un organelo aparte con sus propias enzimas asociadas. En humanos, el perfil lipídico de las células de granulosa se ha asociado con éxito en la gestación, en oocitos de vaca ha sido asociada con calidad, y en humanos con efecto en la maduración³⁴.

La maduración del fagosoma es un proceso en el cual algunas partículas que se internalizan se mueven sobre estructuras acidificadas, que se integran en un mecanismo de apoptosis. Este proceso necesariamente involucra la maduración, que se puede ver por la fusión secuencial de los diferentes estadios de los lisosomas que terminan la formación de un fagolisosoma. Hay muy poca información sobre el papel de esta vía en la formación del folículo o la calidad del oocito; se ha sugerido como una vía alternativa para el control de la muerte del oocito y que puede activarse durante la formación del folículo para los procesos de autofagia. La alteración de algunos genes que codifican proteínas para autofagia causan una gran pérdida de oocitos, sugiriendo un papel de la autofagia en la regulación de su sobrevida³⁵.

Las quinasas Janus, son una familia de 4 tirosina quinasas. Estas juegan un papel importante en el crecimiento celular, supervivencia y diferenciación; se expresan ampliamente en el folículo preovulatorio y se inhibe su expresión por la inyección intrafolicular, también se ha informado que en las células de granulosa, la IL-6 promueve la expresión inducida por FSH de VEGF por la vía JAK/STAT3³⁶.

Las citoquinas son los principales mediadores intercelulares, estos activan en el ovario células inmunes y no inmunes que facilitan la constante reorganización del estroma ovárico a través de vías proteolíticas, facilitando las modificaciones de la membrana basal de las células de granulosa, y la invasión vascular endotelial. Martins, et al., informaron que los receptores para la oncostatina M están regulados en las células de granulosa durante la atresia folicular, ovulación y luteólísis, y que la proteína oncostatina proveniente de otras células regulan la función de genes de viabilidad celular en la granulosa y las células luteales³⁷. Muchas moléculas involucradas en desarrollo folicular que afectan las señales para la ovulación disparan la expresión de citoquinas como TNFa, interleukina7, and CDKN1A³⁸.

Cuando se hace la comparación de la expresión de los genes entre las dos especies y se analizan las 10 vías canónicas activadas con mayor valor de P, solo se comparten unas pocas con los análisis individuales, para el caso del búfalo 5 de las 10, mientras que para las vacas solo 1 (Cuadro 4).

De los reguladores corriente arriba, en los búfalos:

El factor nuclear del hepatocito 4A (HNF4A), está involucrado en la gluconeogénesis y el metabolismo lipídico. Este factor ha sido reportado por Khan et al¹¹, como un regulador corriente arriba en células de granulosa de vacas después de ser estimulados con FSH. RIPTOR, es un gen que produce una molécula que, acompaña al blanco de la rapamicina. Se ha informado en células humanas que una quinasa asociada a mTOR es necesaria para que se fosforile la Ser⁴⁷³, inhibiendo la vía metabólica AkT/PKB que está involucrada en apoptosis y maduración de oocito.

El factor de inicio de la traducción, EIF4E, produce una proteína que ayuda al inicio de la traducción reclutando ribosomas en el extremo 5'- de la subunidad, limita el inicio de la traducción. Se ha informado que su función se incrementa en la transición de folículo primordial a folículo primario³⁹, en el oocito para el inicio de la traducción de mRNA asociados a la continuación de la meiosis, y en la inhibición de la función de TORC1 para el consumo de los aminoácidos.

IPA también informa sobre el papel de algunas moléculas reguladoras de la función génica, evalúa los genes asociados al control de la función como 1-2-dithiol-3-thiona que tiene efecto sobre enzimas antioxidantes y ST1926 que es una molécula parecida al ácido retinoico con efectos sobre el crecimiento y la diferenciación⁴⁰. No hay reportes de la acción de estas moléculas sobre la función de las células de granulosa.

De los reguladores corriente arriba en vacas:

El factor transformante beta-1 pertenece a la superfamilia de las proteínas de los factores transformantes beta, han sido descritos en una gran cantidad de actividades de regulación en el ovario, desarrollo folicular y ovulación, en diferentes especies. Landry, et al informan que tiene un papel en la producción de un oocito competente y en la inducción de atresia en el caso de folículos persistentes¹⁰.

ERBB2 codifica una tirosina quinasa, que pertenece a la familia de los receptores epidermales de crecimiento, la amplificación o sobreexpresión de este gen ha sido asociada con tumores de mama y de ovario³⁰⁾ y el desarrollo folicular¹⁹ , en la regulación de la expresión del gen de supresión tumoral TP53 durante la proliferación de las células de granulosa bajo el estímulo de la FSH y después del pico de LH⁴¹.

Estrógenos, Dexametasona y D- Glucosa son moléculas reportadas con efectos sobre el desarrollo folicular de los vacunos⁴². La estrona y el estradiol, son hormonas esteroidales sintetizadas en el ovario, críticas para la función reproductiva, la principal enzima de esta ruta es la aromatasa CPY19A1⁴³.

En este punto es fácilmente entendible, que, a pesar de ser bovinos, cada especie tiene su forma diferente de realizar el fenómeno, y ese es uno de los resultados importantes de este trabajo, la evidencia muestra que cada especie desarrolla el folículo de forma o modo diferente. Dado que se observa que cada especie ovula con eventos distintos, no se puede cumplir el objetivo de explicar las diferencias reproductivas en el comportamiento reproductivo entre estas dos especies.

La alta correspondencia del resultado obtenido cuando se analizan las redes o funciones biológicas más frecuentes en el evento estudiado entre las dos especies analizadas, se muestra que ambas están teniendo el mismo evento biológico: crecimiento de una estructura dentro del organismo con alta producción metabólica, proliferación celular, producción de señales para todos los eventos que sucederán, cuya consecuencia es la ovulación. La comparación entre redes muestra como hacen lo mismo con un número de moléculas diferente, los búfalos involucran más moléculas que las vacas lo que les pudiera dar una ventaja para la ovulación, al tener más opciones de rutas celulares disponibles. En el análisis comparativo entre especies, los búfalos no comparten solamente la vía del metabolismo de lípidos con las vacas, sugiriendo que deberían existir diferencias a este nivel en el líquido folicular o los oocitos, sin que hasta la fecha haya reportes al respecto en la literatura.

Solo algunas publicaciones en reproducción, han tratado de hacer comparaciones entre búfalos y vacas con enfoque global del problema, es interesante ver como la evidencia de las diferencias está en aumento. Se puede encontrar con facilidad reportes sobre las diferencias en genes específicos en eventos puntuales como la señalización para el reinicio de la meiosis⁴⁴, o el papel de los factores transformantes sobre el desarrollo folicular⁴⁵. Para la fisiología de las células de granulosa y su papel en el desarrollo folicular se conoce mucha información en vacas, pero es escasa en búfalos y mucho menos su comparación. Solo se encuentra un artículo en el estudio de la transcriptómica de las células de granulosa bufalinas, utilizando RNA seq y material de planta de faenado, encontrando expresión diferencial en 595 genes, cuando se comparan los estados iniciales con los finales del desarrollo folicular⁵.

La comparación entre especies es un abordaje novedoso en el área de la biología reproductiva, estudiar el mismo fenómeno en igualdad de condiciones entre búfalos y vacas muestra como cada especie ha desarrollado su propia forma de realizar sus procesos, que la regulación de los mismos tienen vías diferentes entre Bos indicus y Bubalus bubalis, por lo cual los fenómenos deben estudiarse de forma particular para cada especie y que debe evitarse la extrapolación de la información obtenida entre especies y ser base para el análisis de la complejidad de los fenómenos estudiados, con la obligatoriedad de verlos de una manera diferente, no reduccionista.