Obtención del extracto de semillas de Solanum rostratum y de la cepa de Alternaria sp.

El EVSR fue proporcionado por la empresa GreenCorp biorganiks de México, en tanto que la cepa de Alternaria sp., fue proporcionada por el laboratorio de Micología y Biotecnología del Departamento de Parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), la cual está identificada en el cepario con la clave UAAA#3.

Producción de metabolitos secundarios de Alternaria sp.

Los MSAs se produjeron utilizando un medio de cultivo líquido a base de infusión de papa 400 g L^-1, extracto de levadura 7.5 g L^-1, peptona 2 g L^-1, dextrosa 15 g L^-1, MgSO₄ 0.5 g L^-1 y FeSO₄7H₂O 1 g L^-1. En un matraz se inoculó el medio con un explante de 5 mm con siete días de crecimiento. El matraz se colocó en agitación a 120 rpm durante siete días a temperatura de 28 °C. Se separó la biomasa y el fermentado obtenido se centrifugo a 6 000 rpm y se filtró con millipore de 0.2 µm (^{Todero et al., 2018}).

Caracterización de metabolitos secundarios de Alternaria sp. y compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de semillas Solanum rostratum por HPLC-MS

La caracterización de los MSAs y los compuestos presentes en el EVSR se realizó en un sistema de HPLC con muestreador automático, una bomba ternaria, un detector PDA y un espectrómetro de masas con trampa de iones de cromatógrafo de líquidos equipado con una fuente de iones por electro pulverización (Agilent 6520B Q-TOF). Se inyectaron 5 µl de la muestra a 200 mg L^-1 en una columna Denali C18, la temperatura del horno se mantuvo en 30 °C. Los eluyentes utilizados fueron ácido fórmico (0.2% v/v) y acetonitrilo (3-50%).

El gradiente utilizado fue el siguiente: inicial, 3% B; 0-5 min, 9% B lineal; 5-15 min, 16% B lineal; 15-45 min, 50% B lineal. Posteriormente la columna se lavó y se reacondicionó; el caudal se mantuvo a 0.2 ml min^-1 y la elución se controló a 245, 280, 320 y 550 nm. Se inyecto todo el efluente en la fuente del espectrofotómetro de masas, sin dividirlo. Los datos se procesaron utilizando el software MS Workstation. (^{Ascacio-Valdés et al., 2016}).

Producción de micro-nano encapsulados cargados con metabolitos secundarios de Alternaria sp. y extracto de Solanum rostratum.

Las NPs se produjeron utilizando una solución de CaCl₂ y a la cual se añadieron 3.75 ml a una solución de alginato de sodio a través de un sistema compuestos de una bomba peristáltica bajo agitación constante y vigorosa. Posteriormente, a la solución de CaCl₂ y alginato de sodio, se le agregaron 12.5 ml de quitosano y se mantuvo en agitación constante durante 90 min. Esto se realizó en presencia de los MSAs y el EVSR a concentración del 100% (^{Tucuch-Pérez et al., 2023}).

Caracterización de micro-nano encapsulados cargados con metabolitos secundarios de Alternaria sp. y extracto de Solanum rostratum.

El tamaño se determinó por dispersión de luz dinámica (DLS). La potencial zeta (mV) se midió a través del sistema Colloid Metriz ZETA-Check, y el pH se determinó con un potenciómetro. La eficiencia de encapsulación se determinó mediante la técnica propuesta por ^{Taban et al. (2021}).

Se midió la absorbancia de los metabolitos y el extracto y posteriormente las NPs se centrifugaron, seguido de una medición de la absorbancia del sobrenadante. La eficiencia de encapsulación (EE) se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Donde: T0 es la absorbancia del extracto vegetal y S0 representa la absorbancia del sobrenadante de las NPs cargadas con los MSAs y el EVSR a concentración del 100%.

Evaluación de la actividad enzimática en plantas prueba de Sorghum bicolor

Se utilizaron plantas de S. bicolor Var. Sudan de 20 días de desarrollo, el sustrato utilizado fue una mezcla de perlita, tierra y peat moss estériles (1:1:1), las plantas se mantuvieron en un invernadero libre de plagas y enfermedades. La aplicación de los tratamientos se realizó por aspersión foliar. Los tratamientos fueron: T1= NPs cargados con MSAs, T2= NPs cargados con EVSR, T3= MSAs, T4= EVSR, T5= NPs sin cargar y T6= testigo absoluto. Los muestreos se realizaron a las 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h después de la aspersión (^{González-Gallegos et al., 2015}).

Extracción de enzimas

Se maceró 1 g del tejido vegetal, posteriormente se utilizó una solución amortiguadora de tetra borato de sodio 0.1 M (pH 8.8) para la extracción de PAL (^{Rodríguez-Pedroso et al., 2006}), un buffer de fosfatos 0.05 M pH 6 para extraer POD (^{Yedidia et al., 1999}) y un buffer de fosfatos 0.05 M pH 8.8 para SOD (^{Romero-Tejeda et al., 2015}), finalmente, las muestras se centrifugaron a 10 000 rpm a 4 °C y se tomó el sobrenadante.

Determinación de la actividad de la enzima PAL

Se utilizaron 900 μl de L-fenilalanina como sustrato, se añadió el extracto enzimático y se incubo a 40 °C por 30 min. La reacción se detuvo con HCl 5 N. Finalmente las muestras se colocaron en hielo y se agregaron 5 ml de agua destilada, la lectura fue a 290 nm. La actividad se reportó como unidad de actividad enzimática, definida como la producción de 1 µmol de ácido transcinámico por minuto (^{Rodríguez-Pedroso et al., 2006}).

Determinación de la actividad de la enzima POD

Se preparó una mezcla de reacción con el extracto enzimático, rojo fenol al 0.2% y citrato de sodio (50 nM pH 4.2). La reacción se inició con H₂O₂ y se detuvo 3 min después con NaOH 2 N. La absorbancia fue de 610 nm. La unidad de actividad enzimática consistió en la producción de 1 µmol de rojo fenol oxidado por minuto (^{Yedidia et al., 1999}).

Determinación de la actividad de la enzima SOD

Se determinó agregando 400 μl del extracto enzimático y 30 μl de riboflavina (4.4 mg ml^-1) a una mezcla de reacción con nitro blue tetrazolium (NBT) (1.41 mg ml^-1) y Triton X-100 al 0.1%. La mezcla se agito y se ilumino con luz fluorescente de 20 watts por 7 min, realizando la lectura a una absorbancia de 560 nm. La unidad de activad enzimática fue igual a la cantidad de sobrenadante que fotoinhibe el 50% de la formación de nitro azul tetrazolio formazán (^{Romero-Tejeda et al., 2015}).

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente al azar con seis repeticiones por tratamiento, la comparación de medias se realizó a través de análisis de varianza y la prueba de comparación de medias de Tukey (p≤ 0.05), con el programa computacional Statistical Analysis System, versión 9.0.

Identificación de metabolitos secundarios de Alternaria sp. y de compuestos fitoquímicos presentes en extracto de Solanum rostratum mediante HPLC-MS

Se identificaron diversos metabolitos producidos por Alternaria sp., tales como escopoletina, ácido cafeico 4-O-glucosido, ácido galico 3-O-galato, p-HPEA-EA, y 3,7-Dimetilquercetina. En tanto que en el extracto de semillas de S. rostratum, se detectaron compuestos fitoquímicos como ácido cafeico 4-O-glucosido, ácido protocatecuico4-O-glucosido, resveratrol 3-O-glucosideo, sinensetina, ácido ferulico 4-O-glucosido, tetrametilescutellareína e isorhamnetina 3-O-glucósido 7-O-ramnósido (Tabla 1).

El ácido cafeico, detectado en los MSAs y el EVSR tiene la capacidad de aumentar los niveles de ROS en plantas, desencadenando un estrés oxidativo, lo que daña estructuralmente las células vegetales (^{Tucuch-Pérez et al., 2023}). Por otro lado, el resveratrol y la sinetesina, también han sido reportados como compuestos con actividad alelopática sobre plantas, y se ha dilucidado que afectan a las plantas mediante la inhibición de enzimas y de ciertas rutas metabólicas (^{Husic et al., 2023}).

Finalmente, flavonoides como la isorhamnetina3-O-glucósido 7-O-ramnósido, y la 3,7-dimetilquercetina han sido reportados como compuestos que afectan el desarrollo vegetal inhibiendo el crecimiento aéreo y de raíz, provocando una disminución en la cantidad de biomasa que producen las plantas (^{Balah et al., 2020}; ^{Fernández -Aparicio et al., 2021}).

Caracterización de micro-nano encapsulados

El tamaño de las NPs cargadas con MSAs y EVSR osciló entre 258 y 260 nm, en tanto que las NPs sin carga presentaron un tamaño de 158 nm. En relación con la potencial zeta, las NPs cargadas con MSAs tuvieron potencial zeta de -30 mV, en tanto que en las cargadas con EVSR fue de -29 mV. La estabilidad química de los biopolímeros se determinó midiendo el pH, presentando valores de 4.89 y 4.45 las NPs cargadas con MSAs y con EVSR respectivamente. Finalmente, la eficiencia de encapsulación de las NPs fue de 87% las cargadas con MSAs y de 81% las cargadas con EVSR (Tabla 2).

Los resultados obtenidos, sugieren que el tamaño de las NPs, se ve influenciado por los MSAs y el EVSR, en este sentido en diversas investigaciones se han reportado diferentes tamaños de NPs cargados con extractos vegetales, tal como reportaron ^{Tucuch-Pérez et al. (2023}), quienes produjeron NPs de alginato y quitosan con extracto de S. rostratum con tamaño de 340 nm, por otro lado, se han reportado NPs cargadas con metabolitos secundarios de Bacillus spp., con tamaño de 500 nm (^{Ureña-Saborío et al., 2017}).

En cuanto al potencial zeta, los valores negativos observados, indican estabilidad en las NPs, lo que permite una buena dispersión y movilidad a través de las plantas. La estabilidad química está relacionada con el tamaño final de las partículas y la capacidad de encapsulación, en este sentido se han reportado NPs de quitosan y alginato con valores de pH entre 4.5 y 4.6 (^{Tucuch-Pérez et al., 2023}).

Actividad de enzimática de PAL, POD y SOD en plantas de Shorgum bicolor tratadas con micro-nano encapsulados

En los primeros tiempos de muestreo, la actividad enzimática fue baja, aumentando a partir de las 6 h. Posteriormente, a partir de las 12 h la cantidad de la enzima PAL aumentó, hasta alcanzar su pico máximo a las 24 h, no observándose diferencia estadística entre los tratamientos con mejor actividad enzimática los cuales fueron las NPS con EVSR, NPs con MSAs y el EVSR con 0.36, 0.34 y 0.32 U mol^-1 (Figura 1).

Figura 1 Actividad de PAL en plantas de S. bicolor a las 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h después de la aspersión. 

En el caso de la enzima POD, la actividad enzimática fue baja en las primeras horas, incrementando a partir de las 6 h, alcanzado la mayor actividad a las 48 h, siendo los tratamientos de NPs cargadas con EVSR y MSAs los que presentaron mayor cantidad de la enzima con 4.7 y 4.3 U mol^-1, observándose diferencia estadística entre las NPs con EVSR con relación a los tratamientos sin encapsular y el testigo absoluto (Figura 2).

Figura 2 Actividad de POD en plantas de S. bicolor a las 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h después de la aspersión. 

La actividad enzimática de SOD aumento a partir de las 6 h, alcanzando el pico máximo de activad enzimática a las 12 h, observándose diferencia estadística entre las NPs con EVSR y los demás tratamientos, siendo los tratamientos correspondientes a las NPs con EVSR y MSAs los que presentaron mayor actividad con 7.3 y 6.5 (Figura 3).

Figure 3 Actividad de SOD en plantas de S. bicolor a las 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h después de la aspersión. 

La baja actividad enzimática inicial observada en S. bicolor por parte de las enzimas puede ser debido al tiempo que toma a las plantas reconocer estímulos aplicados para activar vías metabólicas, lo cual requiere una serie de procesos previos como la señalización intracelular y la transcripción génica (Vogt, 2010).

Los bioherbicidas aumentan niveles de ROS debido al estrés que causan en las plantas (^{Fancy et al., 2017}; ^{Traxler et al., 2023}). En este sentido, las ROS desencadenan vías de transducción de señales en respuesta al estrés. Sin embargo, un exceso de ROS, generan daños celulares lo que causa alteraciones en la morfología (^{Huang et al., 2019}).

Para contrarrestar el efecto de las ROS, las plantas desarrollaron un sistema antioxidante enzimático, el cual las protege del estrés oxidativo. En dicho sistema intervienen enzimas que catalizan reacciones que producen compuestos que actúan como antioxidantes o enzimas que usan directamente las ROS como sustrato para la producción de compuestos que desintoxican a la planta (^{Grewal et al., 2022}).

En este sentido, las enzimas PAL, POD y SOD tienen un papel clave contra el estrés oxidativo causado por los bioherbicidas. La PAL interviene en la biosíntesis de compuestos fenólicos catalizando la fenilalanina a acido cinámico iniciando la producción de fenoles con propiedad antioxidantes que pueden ser transformados a lignina que fortalece las paredes celulares de las plantas (^{Kumar et al., 2024}).

Dentro de las ROS el peróxido de hidrogeno (H₂O₂) oxida proteínas y lípidos, para contrarrestar este efecto la POD utiliza el H₂O₂ como sustrato para oxidar compuestos fenólicos los cuales son usados para la polimerización de lignina en las paredes celulares, incrementando la resistencia de las plantas (^{Caverzan et al., 2019}). Finalmente, la enzima SOD, cataliza la dismutación del superóxido en H₂O₂ y oxigeno molecular, y sirve como precursora de enzimas antioxidantes como la catalasa y la POD, de este modo estas tres enzimas neutralizan los efectos tóxicos de las ROS protegiendo a las plantas de los efectos inducidos por los bioherbiciadas (^{Traxler et al., 2023}).

Dentro de los metabolitos y compuestos fitoquímicos detectados, se observaron compuestos que inducen ROS como la escopoletiona y el ácido cafeico, los cuales pudieron inducir producción de ROS en las plantas de S. bicolor, siendo los NPs cargados con MSAs y el EVSR, los que indujeron estrés oxidativo, desencadenando radicales fenóxilos y ROS que afectan el ADN, la peroxidación lipídica y la división celular (^{Tucuch-Pérez et al., 2023}), debido a que las NPs mejoran la eficacia de los compuestos por una mayor penetración en las plantas y liberación dosificada (^{Zabot et al., 2022}).

El uso de las enzimas antioxidantes anteriormente mencionadas como biomarcadores, permite inferir que los tratamientos correspondientes a las NPs cargadas con EVSR y MSAs actuaron sobre las plantas, generando un mayor estrés oxidativo a nivel celular, ocasionando que las plantas, produzcan más enzimas antioxidantes (^{Yin et al., 2008}).

Respecto a lo anterior mencionado, se han realizado estudios para correlacionar la actividad de enzimas antioxidantes con la actividad herbicida de productos para control de malezas, y se ha documentado el aumento de las enzimas PAL y POD en plántulas de lenteja al ser tratadas con imazethapyr (^{Kumar et al., 2024}), el aumento de la enzima SOD en arroz al ser tratadas con bentazon, penoxsulam y Cyhalofop-butyl (^{Nohatto et al., 2016}) y el aumento de la enzima POD en Avena sativa, Vicia sativa, Raphanus sativus y Lupinus albus al aplicar fomesafen y sulfentrazone (^{Alves et al., 2018}).

Los cambios observados en la actividad enzimática indican alteración en los procesos metabólicos de las plantas de S. bicolor al utilizar MSAs y el EVSR solos y en NPs como bioherbicidas, los cuales demostraron inducir ROS, activando las enzimas PAL, POD y SOD, sugiriendo una respuesta de defensa por parte de las plantas al estrés oxidativo (^{Sinegovskaya & Dushko et al., 2021}). Estos resultados se presentan destacando el potencial de los MSAs y el EVSR en NPs como agentes que pueden modificar procesos bioquímicos en plantas.