Material biológico

Los hongos fitopatógenos F. solani, R. solani, A. alternata y C. acutatum, fueron aislados, purificados e identificados en el laboratorio de Toxicología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), los cuales se cultivaron en medio de cultivo agar dextrosa y papa (PDA) (BD Bioxon^®) para su posterior uso.

Preparación de extractos de B. amyloliquefaciens enriquecidos con NPs de dióxido de silicio (SiO ₂ ) y grafeno (Graf)

Se utilizó la cepa de B. amyloliquefaciens (EcBa) previamente identificada en el laboratorio de Toxicología de la UAAAN, dicha cepa se la cual se cultivó en tubos inclinados con agar nutritivo (TM Media^®) para su crecimiento. Posteriormente se prepararon 500 ml de medio de cultivo líquido para la producción de iturinas por fermentación mediante el procedimiento descrito por ^{Mckeen et al. (1986}). Se ajustó el pH a 6 y se esterilizó en autoclave durante 15 min a 121 °C.

Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se inoculó con 1 ml de suspensión bacteriana 1x10⁶ UFC, dejando en incubación a 30 °C y en agitación constante en una incubadora con agitación (150 rpm) por tres días. Transcurrido este tiempo se realizó el extracto, eliminando las bacterias por centrifugación a 5 000 rpm por 20 min y el uso de filtros de 0.22 µm de diámetro de poro (Linktor^® Syringe filters). Una vez obtenido el extracto de EcBa se procedió a realizar los productos formulados con NPs de dióxido de silicio (NPs SiO₂) y grafeno (NPs Graf) proporcionadas por la empresa Culta, SA de CV (Ciudad Mante, Tamaulipas).

Para ello se mezclaron 2 g de NPs por cada 100 ml de extracto bacteriano, la solución se sonificó sumergiendo la sonda de ultrasonido (Branson^® Sonifier 450 EUA) a 35% de potencia constante durante 10 min a una temperatura de 60 °C para su mejor dispersión, se conservó a 4 °C protegida de la luz.

Evaluación in vitro de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs SiO ₂ y Graf sobre el desarrollo micelial de hongos fitopatógenos

Se utilizó el hongo F. solani para determinar la ventana biológica correspondiente al bioensayo uno de inhibición micelial, donde se evaluaron cinco tratamientos: extracto solo de B. amyloliquefaciens (EcBa), NPs SiO₂ y mezcladas en agua destilada estéril (NPs SiO₂ + H₂O), NPs SiO₂ f y mezcladas con extracto de B. amyloliquefaciens (NPs SiO₂ + EcBa) y NPs Graf y mezcladas en agua destilada estéril (NPs Graf + H₂O), NPs Graf y mezcladas con extracto de B. amyloliquefaciens (NPs Graf + EcBa) con nueve dosis (0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 8, 16, 32 y 40 ml L^-1 y el testigo) por tratamiento, con 10 repeticiones.

Se usó la técnica del medio envenenado (^{Ochoa et al., 2012}), que consistió en colocar explantes de 0.5 cm de diámetro al centro de la caja Petri de 9 cm de diámetro, con cada fitopatógeno de interés y se incubaron a 25 ±2 °C en oscuridad hasta que el crecimiento de micelio del testigo (solo PDA) alcanzó las medidas de la placa. El crecimiento micelial se midió cada 24 h con un vernier, los datos de crecimiento se usaron para calcular los porcentajes de inhibición mediante la siguiente fórmula: (PICR= [(R1-R2)/R1] x 100). Donde: PICR= porcentaje de inhibición del crecimiento radial; R1= crecimiento micelial del testigo y R2= crecimiento micelial del tratamiento.

Con los datos obtenidos del PICR se calcularon las dosis (D _E 30, D _E 50, D _E 70 y D _E 90) mediante análisis Probit. Se realizó una prueba de efectividad biológica (bioensayo dos) usando las dosis recomendadas para (D _E 70 y D _E 90) de los tratamientos EcBa, NPs SiO₂ + EcBa, NPs Graf + EcBa y Testigo con 20 repeticiones (caja Petri) sobre los fitopatógenos F. solani, R. solani, A. alternata y C. acutatum.

Evaluación in vitro de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs de SiO ₂ y Graf sobre la producción de estructuras reproductivas de hongos fitopatógenos

Se realizó un tercer bioensayo, donde se evaluaron las dosis efectivas (D _E 30 y D _E 50 y D _E 70) de EcBa, NPs SiO₂ + EcBa, NPs Graf + EcBa y testigo con tres repeticiones para cada uno de los hongos fitopatógenos, usando la técnica medio envenenado (^{Ochoa et al., 2012}). Para esto a los 10 días posteriores a la siembra del hongo en la caja Petri, se adicionaron 5 ml de agua destilada estéril a la caja Petri. Se tomó una alícuota de 1 ml y se contaron las esporas por triplicado en una cámara de Neubauer en un microscopio óptico a 40X (Nikon^® Japan 449193).

En los hongos F. solani, A. alternata y C. acutatum, las esporas se transfirieron a tubos de ensayo y se homogenizaron en un vortex, Se tomaron 20 µl de la suspensión y contaron como anteriormente se ha descrito (^{Barroso et al., 2021}). Para el caso de R. solani, se realizó un conteo de esclerocios. En este caso la caja Petri se dividió en cuatro cuadrantes y se contabilizaron los esclerocios en un microscopio estereoscopio (Olympus^® SZ2-LGB).

Diseño experimental

En la inhibición micelial (bioensayo uno), se utilizó un diseño completamente al azar en cada tratamiento con seis dosis: EcBa (2.5, 5, 8, 16, 32 y 40 ml L^-1) y en NPs SiO₂ + EcBa, NPs Graf + EcBa, NPs SiO₂ + H₂O y NPs Graf + H₂O (1, 2.5, 5, 8, 16, 32 ml L^-1) más un testigo (0 ml L^-1) PDA sin tratamiento como control absoluto, cada dosis tuvo 10 repeticiones, dando un total de 70 unidades experimentales por cada tratamiento evaluado sobre F. solani, respectivamente.

En las pruebas de efectividad bilógica (bioensayo dos), se usó un diseño completamente al azar para cada hongo fitopatógeno (F. solani, R. solani, A. alternata y C. acutatum), evaluando las dosis efectivas D _E 70 y D _E 90, más un testigo (0) con 20 réplicas, dando un total de 60 unidades experimentales por cada tratamiento evaluado (EcBa, NPs SiO₂ + EcBa, NPs Graf + EcBa).

En cuanto a la producción de estructuras reproductivas (bioensayo tres), se realizó en un diseño completamente al azar de tres dosis efectivas: 1= D _E 30, 2= D _E 50, 3= D _E 70 y un testigo (0) con tres observaciones, dando un total de 12 unidades experimentales por cada tratamiento y hongo fitopatógeno evaluado.

Análisis de datos

En las variables evaluadas se utilizó un diseño completamente al azar en cada tratamiento. Se utilizó un análisis de varianza y comparación de medias de la diferencia mínima significativa por Tukey (p≤ 0.05) usando el programa estadístico Statistical Analysis System versión 9.0. En la determinación de las dosis efectivas, se usaron los datos de PICR obtenidos por medio de la fórmula y se calcularon las dosis por análisis Probit con el mismo programa estadístico.

Evaluación in vitro de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs de SiO ₂ y Graf sobre el crecimiento micelial de hongos fitopatógenos

Los resultados del bioensayo 1 (ventana biológica) con el hongo F. solani, Los tratamientos con NPs mostraron efecto inhibitorio a partir de 1 a 40 ml L^-1 (Figura 1). El tratamiento NPs SiO₂ + EcBa mostró 100% de inhibición micelial en las concentraciones de 5 a 32 ml L^-1, seguido del tratamiento NPs Graf + EcBa con inhibiciones de 100 a las concentraciones de 8 a 32 ml L^-1, mientras que los tratamientos NPs SiO₂ + H₂O y NPs Graf + H₂O mostraron efecto inhibitorio de 100% en las concentraciones16 y 32 ml L^-1.

Figura 1 Efecto inhibitorio micelial de diferentes concentraciones de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs de oxido de silicio y grafeno sobre F. solani. EcBa= extracto de B. amilolyquefaciens; NPs SiO₂ + EcBa= NPs de dióxido de silicio y mezcladas con EcBa; NPs SiO₂ + H₂O= NPs de dióxido de silicio y suspendidas en agua destilada estéril; NPs Graf + EcBa= NPs de grafeno y mezcladas con EcBa y NPs Graf + H₂O= NPs de grafeno y suspendidas en agua destilada estéril. 

Con respecto al extracto bacteriano EcBa, se obtuvo 91.71% usando la concentración más alta (40 ml L^-1). La combinación de las NPs con el extracto de B. amyloliquefaciens se produjo un efecto sinérgico, el cuál potencializa el efecto fungicida desde las concentraciones más bajas. Al respecto podemos mencionar que las moléculas bioactivas de B. amyloliquefaciens son los lipopéptidos circulares de las familias de surfactina, iturina y fengicina, afectan a las células a nivel de membrana provocando una degradación física, causando la actividad inhibidora del crecimiento, además de inducir resistencia sistémica en las plantas y competir por nichos ecológicos con los patógenos vegetales (^{Ngalimat et al., 2021}).

En el caso de las nanopartículas de óxido de silicio, interrumpen funciones celulares como la diferenciación, aumento de la permeabilidad de la pared, desactivación de moléculas de proteínas y afectar el ciclo energético transmembrana (^{Derbalah et al., 2018}). Con relación a las nanopartículas de grafeno, estas inducen la alteración de la membrana celular, daña el ADN, influyó en las vías metabólicas energéticas para inactivar los microorganismos y También tiene actividad fotoquímica al causar estrés oxidativo (^{Fernando et al., 2018}).

Estos resultados concuerdan con ^{Duan et al. (2021}) donde reportan un efecto inhibidor (86.7, 84.2, 72.8 y 74%) sobre Fusarium proliferatum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides y Fusarium oxysporum respectivamente. Por su parte ^{Peng et al. (2022}) reportaron que 50, 100 y 150 mg L^-1de nanopartículas de óxido de silicio aumentaron la firmeza del rizoma de jengibre, la pérdida de agua aumentó de la actividad de enzimas antioxidantes, contenido total de fenólicos y flavonoides, además inhibióFusarium solanial impedir la penetración de hifas en las células.

Asimismo, ^{El-Abeid et al. (2020}) mencionan que nanopartículas de grafeno con cobre mencionan una mayor actividad antifúngica con solo 1 mg L^-1 que el fungicida convencional con 2.5 g L^-1. creando hoyos y poros en las membranas celulares de los hongos, lo que induce la muerte celular, para reducir la gravedad de las enfermedades del marchitamiento por Fusarium.

La finalidad de determinar las dosis inhibitorias (bioensayo 1), fue para conocer la cantidad del tratamiento para inhibir el desarrollo del fitopatógeno, similar a lo reportado por ^{Ochoa et al. (2012}) en donde se determinó la dosis efectiva media (ED₅₀). Por lo que, en este estudio se utilizaron los datos obtenidos de PICR para calcular las dosis efectivas (D _E ) de los tratamientos (Cuadro 1). Se observó que el tratamiento NPs SiO₂ + EcBa mostró las concentraciones más bajas para controlar de manera in vitro a F. solani con D _E 30= 1.75 ml L^-1, D _E 50= 2.3 ml L^-1, D _E 70= 3.01 ml L^-1 y D _E 90= 4.46 ml L^-1, un efecto similar presentó el tratamiento NPs Graf + EcBa.

Mientras que los tratamientos NPs SiO₂ + H₂O y NPs Graf + H₂O mostraron una D _E 90 de 14.4 y 13.88 ml L^-1 consideradas como dosis intermedias en comparación con la dosis más alta en EcBa, que presentó una D _E 90= 64.43 ml L^-1. Los resultados obtenidos difieren a los reportados por ^{Lee et al. (2017}) donde el extracto de B. amyloliquefaciensDA12 inhibió la germinación deF. graminearumcon una tasa de inhibición del 83% a una concentración de 31.3 μg ml^-1 y del 100% a una concentración de 250 μg ml^-1. Es importante mencionar que no hay estudios científicos que aporten información sobre la determinación de dosis efectivas de extractos bacterianos con NPs de silicio y grafeno en la inhibición micelial de hongos fitopatógenos.

En las pruebas de efectividad bilógica de las dosis efectivas en el Cuadro 2 se muestran las diferencias significativas. Se observó que el tratamiento EcBa inhibió en un 100% a los cuatro hongos fitopatógenos con una D _E 90 (64.43 ml L^-1), el cual se observa en la Figura 2 (T1.2). El efecto inhibitorio prevaleció desde las primeras 24 h hasta 168 h.

Figura 2  Actividad inhibitoria in vitro de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs de oxido de silicio y grafeno sobre hongos fitopatógenos. T1.1 and T1.2= D _E 70 and D _E 90 of EcBa; T3.1 and T3.2= D _E 70 and D _E 90 of SiO₂ NPs + EcBa; T4.1 and T4.2= D _E 70 and D _E 90 de NPs Graf + EcBa y T= testigo. 

Estos resultados difieren a los reportados por ^{Ahumada et al. (2019}) con extractos de B. amyloliquefaciens, presentó niveles de inhibición del 37.8 al 55.2% en diferentes cepas de Fusarium. Mientras que ^{Maslennikova et al. (2023}) muestran la inhibición deR. solanipor la mezcla deB. amyloliquefaciensyB. subtilisla actividad inhibidora del tratamiento con mezcla de bacterias sobre el hongo fue del 81%.

Autores como ^{Es-Soufi et al. (2020}) mencionan, que al evaluar el aislado contra siete cepas deColletotrichum acutatum, mostraron la capacidad de inhibir el crecimiento micelial del patógeno entre un 37 a 72%.^{Jia et al. (2023}) mencionan que aislados de A. alternata, el porcentaje de inhibición a los siete días de incubación fue del 60.6 al 72.72%. Mientras que usando una D _E 90 (4.46 ml L^-1) de NPs SiO₂ + EcBa inhibió 100, 95.06, 90.71 y 72.68% a los fitopatógenos R. solani, C. acutatum, F. solani y A. alternata. Un efecto similar se observó con el tratamiento NPs Graf + EcBa que presentó 100, 91.62, 79.21 y 73.40% a R. solani, F. solani, A. alternata y C. acutatum, bajo una D _E 90 de 8.59 ml L^-1.

Por lo anterior, se demostró que las dosis del extracto de B. amyloliquefaciens con NPs de dióxido de silicio y grafeno, fueron menores en comparación con el extracto bacteriano solo, logrando un control similar y eficiente. En otras investigaciones se ha demostrado la actividad antifúngica de las NPs sobre los hongos fitopatógenos; por ejemplo, ^{Koka et al. (2019}) mencionaron que las NPs de MgO a 0.5 mg ml^-1 lograron una zona de inhibición en A. alternata de 16.33 mm en placa Petri aproximadamente de 18.14% y 14.33 mm y en R. solani 15.92%, si se comparan estas dosis con las utilizadas en la presente investigación donde se aplicaron 89.2 mg L^-1 ó 0.08 mg ml^-1 del tratamiento NPs SiO₂ + EcBa, se observó que al usar dosis muy bajas de dióxido de silicio, se obtuvieron excelentes porcentajes de inhibición micelial.

Por su parte, ^{Pariona et al. (2018}) indicaron que las NPs de cobre (NPs-Cu) presentaron un 87 y 90% de inhibición de crecimiento de micelio de F. solani con dosis de 0.75 y 1 mg ml^-1, respectivamente. ^{Correa et al. (2018}) señalaron un 100% de inhibición micelial en los hongos: A. alternata, C. gloeosporoides, C. fragariae y Rhizopus stolonifer usando NPs de quitosano y aceite esencial de tomillo (NPs-TEO-Np 3 y 5%).

Evaluación in vitro de extractos de B. amyloliquefaciens con NPs de oxido de silicio y grafeno sobre la producción de estructuras reproductivas de hongos fitopatógenos

Los resultados de la producción de estructuras reproductivas de los hongos fitopatógenos mostraron una reducción significativa (p≤ 0.05) entre los tratamientos (Cuadro 3). En general el tratamiento NPs SiO₂ + EcBa presentó los valores más bajos en la producción de conidios en F. solani, R. solani y C. acutatum con las tres dosis evaluadas (D _E 30, D _E 50 y D _E 70) con una inhibición de 96.89, 84.06, 92.45 y 89.28% en F. solani, R. solani, C. acutatum, A. alternata, respectivamente. Un efecto similar se observó con NPs Graf + EcBa con valores de inhibición de 82.17, 75.93, 86.79 y 96.54% en F. solani, R. solani, C. acutatum, A. alternata, bajo la dosis más alta (D _E 70), seguido del tratamiento EcBa, con respecto al testigo, en el cual los hongos produjeron alto número de conidias y esclerocios con 0% de inhibición.

Diversos compuestos antimicrobianos reducen la producción y germinación de esporas de los hongos fitopatógenos, lo que resulta beneficioso ya que limitan su reproducción y diseminación. En un estudio realizado por ^{Ley et al. (2018}) señalaron 88.15% de inhibición en la germinación de zoosporas de Phytophthora capsici usando B. amyloliquefaciens, quizá por esta razón el extracto usado disminuyó significativamente la producción de las estructuras reproductivas de los hongos.

Por su parte ^{Jiao et al. (2021}) mostraron en estudiosin vitrocon hongos del tabaco, que la inhibición de germinación de esporas se debe a los lipopéptidos antimicrobianos, especialmente la bacilomicina D y la fengicina. Mientras que Yan et al. (2020) determinaron que el componente con actividad antifúngica era el antibiótico lipopéptido iturina, esta puede inhibir el crecimiento de micelios y la germinación de esporas del hongo C. gloeosporioides. Induciendo un aumento de la permeabilidad de la membrana celular y una disminución del contenido de proteínas en la célula fúngica.