Introducción
El estado de Sinaloa es el principal productor nacional de solanáceas como tomate, chile y berenjena, cuyo valor de producción en conjunto rebasa los de18 mil millones de pesos (SIAP, 2019). El comercio de estas hortalizas depende en gran medida del mercado estadunidense ya que Sinaloa funge como el principal productor y exportador durante el invierno a los Estados Unidos de América (FAS-USDA, 2018).
La mosca blanca Bemisia tabaci es una de las plagas más destructivas e invasivas del mundo (GISD, 2020), posee un rango de hospederos que asciende a más de 1 000 plantas cultivadas y silvestres (Oliveira et al., 2001; Simmons et al., 2008; Abd-Rabou y Simmons, 2010) y ocasiona daños directos a los cultivos al alimentarse de la savia de las plantas y excretar sustancias azucaradas sobre hojas y frutos que dañan su calidad y promueven el desarrollo de hongos como Fumago spp., asimismo, causa daños indirectos al ser vector de más de 100 virus fitopatógenos (Horowitz y Ishaaya, 2014).
Las excesivas poblaciones de B. tabaci pueden reducir el rendimiento de las cosechas hasta en un 50% (Raveesh, 2018), por lo tanto, se realizan aplicaciones continuas de insecticidas químicos para su control, lo cual provocó el desarrollo de resistencia (Palumbo et al., 2001; Ahmad et al., 2010).
Los registros mundiales sobre B. tabaci mencionan resistencia a 64 ingredientes activos de grupos toxicológicos como avermectinas, neonicotinoides, buprofezin, organofosforados, piretroides, carbamatos, fenilpirazoles, ciclodieno clorados, butenolides, piridina azometina, acaricidas e insecticidas METI y pyriproxifen (APRD, 2020).
Esto se debe a un diverso conjunto de mecanismos de resistencia, los cuales fueron corroborados en países que lideran la producción mundial de solanáceas, China (Wang et al., 2018), India (Naveen et al., 2017), Turquía (Erdogan et al., 2008), Egipto (Farghaley et al., 2016) y Estados Unidos de América (Longhurst et al., 2013). En México, Aguilar- Medel et al. (2007) evaluaron la susceptibilidad de poblaciones provenientes de los estados de Baja California y Sinaloa a los insecticidas acetamiprid, cipermetrina, imidacloprid, pymetrozina y thiamethoxam, siendo la población proveniente de Sinaloa la más resistente, en otro estudio Gutiérrez-Olivares (2007) reporta tolerancia en poblaciones de San Luis Potosí a imidacloprid y Servín-Villegas et al. (2006) a thiametoxam y a endosulfan en Baja California.
La resistencia a los insecticidas involucra mutaciones en los sitios de acción, sobre expresión de genes, menor penetración cuticular, resistencia al derribo, mayor almacenamiento y excreción, además de la producción de enzimas detoxificativas (Vais et al., 1997; Ahmad et al., 2006; Bass y Field, 2011).
Estas últimas son el principal mecanismo de resistencia, particularmente la producción de esterasas, oxidasas y glutatión S-transferansas (GST) (Flores et al., 2006). El objetivo del presente trabajo fue la cuantificación de enzimas detoxificativas en B. tabaci en las tres principales zonas productoras de solanáceas del estado de Sinaloa.
Materiales y métodos
Para la realización de este estudio se colectaron tres poblaciones de B. tabaci en las zonas productoras del norte (Guasave, Sinaloa de Leyva, Mochis) centro (Culiacán, Navolato, Elota) y sur (Concordia, Rosario, Esquinapa) de cultivos de solanáceas a campo abierto en el estado de Sinaloa, México, en el ciclo agrícola 2018-2019.
Además, se incluyó una línea susceptible mantenida en laboratorio, la cual ha estado libre de presión de selección por un período de más de dos años. Los adultos de mosca blanca capturados se colectaron en contenedores de plástico para su conservación en alcohol al 70% y a una temperatura de 4 °C en refrigeración. Los análisis se realizaron en el Laboratorio de Toxicología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.
Determinación de proteína
La fuente de proteína se obtuvo de ocho muestras, con tres repeticiones, de 100, 150, 200, 250, 300, 350 y 400 individuos de B. tabaci, mediante la metodología descrita por Bradford (1976) modificada por Brogdon (1984); Brogdon y Barber (1987). En tubos Eppendorf de 2 ml se agregaron 1 000 μl de solución buffer (KPO4 0.05 M, pH 7.2) y las diferentes densidades del insecto antes mencionadas, para después triturarlos y aforar a 1 ml.
En una microplaca de 96 pozos, se colocó por triplicado para cada repetición 20 μl del homogenato, 80 μl de solución buffer y 200 μl de colorante diluido (4:1 colorante: agua) de azul brillante de Comassie (Kit II Bio-Rad). Las lecturas de absorbancias se tomaron con un filtro de 630 nm. Se calcularon los valores de μg ml-1 de proteína comprendidos en el rango de 80 a 120 μg (homogenato realizado con 300 individuos).
Determinación de niveles enzimáticos
Los niveles enzimáticos de las α-esterasas y β-esterasas se determinaron con la metodología de Brogdon y Dickinson (1983). En una microplaca transparente de 96 pozos se agregaron 100 μl el homogenato con 100 μl del sustrato α-naftil acetato para las α-esterasas y β- naftil acetato para el caso de β-esterasas, se incubó por 10 min y se agregaron 100 μl de colorante Fast-Blue para incubar nuevamente por 2 min, las absorbancias fueron tomadas con un filtro de 540 nm.
Para la determinación del glutatión S-transferasas, se utilizó la metodología descrita por Brogdon y Barber (1990) para esto, en una microplaca se agregaron 100 μl de homogenato, 100 μl de Glutatión reducido como sustrato y 100 μl de 1-cloro-2,4’-dinitrobenceno (CDNB) como colorante. Las absorbancias se registraron con un filtro de 340 nm, las lecturas fueron al tiempo cero (T0) y al cinco (T5), la diferencia entre las dos (T5-T0), se consideró para el resultado para el análisis.
Los niveles de acetilcolinesterasa se determinaron con la metodología de Brogdon (1988), aplicando en una microplaca 100 μl del homogenato, como sustrato 100 μl acetilcolina-yodisada 3 mm y como colorante 100 μl de ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB). Las absorbancias se registraron con un filtro de 414 nm y se tomaron las lecturas al tiempo cero (T0) y diez (T10), la diferencia consideró como resultado para el análisis.
Finalmente, la determinación de niveles de oxidasas se obtuvo con el método de Brogdon et al. (1997), agregando 100 μl del homogenato, 200 μl de 3,3’,5,5’- Tetramethyl-Benzidina Dihydrochloride (TBMZ) como sustrato y 25 μl de H2O2 al 3% como colorante, se incubaron por 5 min y se tomaron las lecturas con un filtro de 620 nm.
Análisis de resultados
Con las lecturas de las absorbancias obtenidas se realizó una distribución de frecuencias y se estableció un umbral de resistencia tomando como base el valor (absorbancia) más alto de la línea susceptible. El porcentaje de resistencia se obtuvo con el número de medias que excedían el umbral de resistencia y fueron clasificados según Montella et al. (2007) con pequeñas modificaciones como: en ‘inalterado’ (0-5%), ‘incipientemente alterado’ (6-30%), ‘moderadamente alterado’ (31-50%), ‘alterado’ (51-75%) y ‘muy alterado’ (>76%). Para conocer la variación en la actividad enzimática entre poblaciones se realizó un Anova y prueba de Tukey (p= 0.05) con el programa estadístico R versión 3.3.1.
Resultados y discusión
Determinación de proteína
La densidad de 300 adultos alcanzó los niveles requeridos de proteína (80 a 120 μg), la mayoría de sus repeticiones se ubicaron cerca del umbral, mientras que en las densidades 200 y 400 individuos los valores de las absorbancias se distribuyeron en diferentes contenidos de proteína (Figura 1). Bradford (1976) menciona que valores fuera del rango no son confiables para la cuantificación de enzimática en tejidos; por su parte Dary et al. (1990) reportan que existe estrecha relación entre tamaño de muestra y cantidad de proteína, por lo valores fuera de este rango pueden presentar diferencias en los resultados obtenidos.
Niveles enzimáticos
Con relación a las α-esterasas y β-esterasas las tres poblaciones de campo se comportaron de forma homogénea (Cuadro 1) con medias de 3.453, 3.489 y 3.513, parar las poblaciones norte, centro y sur, respectivamente; sin embargo, fueron diferentes respecto a la línea susceptible con la media más baja de 1.488.
Cuadro 1 Medias y absorbancias de las enzimas α-esterasas, β-esterasas, de las diferentes zonas productoras de solanáceas en el estado de Sinaloa.
Zona | α-esterasas | β-esterasas | ||||
Media ± SD1 | Media ± SD1 | |||||
LS2 | 1.488 ±0.027 | b | 1.592 ±0.011 | b | ||
Norte | 3.453 ±0.049 | a | 3.539 ±0.09 | a | ||
Centro | 3.489 ±0.093 | a | 3.539 ±0.119 | a | ||
Sur | 3.513 ±0.093 | a | 3.496 ±0.063 | a |
Medias con diferente letra presentan diferencia significativa (p= 0.05). 1= desviación estándar. 2= línea susceptible.
Las α-esterasas y β-esterasas pueden presentarse separadas o en conjunto en los insectos (Bisset, 2002), dependiendo de la interacción tóxica, la desintoxicación se puede llevar a cabo por dos mecanismos: hidrolisis catalítica que no son inhibidas por los organofosforados y no catalítica al ser inhibida por organofosforados (Costa, 2006).
Estudios previos reportaron que estas enzimas confieren resistencia a insecticidas como piretroides (Yang et al., 2001; Flores et al., 2006; Landeros et al., 2010), organoclorados (Bisset et al., 2001), neonicotinoides (Dávila-Medina, 2012), organofosforados y carbamatos (Cerna et al., 2013), la alta actividad de esterasas en las poblaciones se relaciona directamente con la resistencia a estos insecticidas, coincidiendo con estudios previos en mosca blanca (Byrne y Devonshire, 1993; Kang et al., 2006; Roditakis et al., 2006; Liang et al., 2007; Alon et al., 2008). Las oxidasas fueron las enzimas con los valores más elevados en la zona centro con una media de 1.216, seguido por la zona norte con 1.073 y sur con 1.068 (Cuadro 2), las medias de las tres zonas fueron significativamente diferentes respecto a la línea susceptible (p-valor 0.002), la cual presentó el valor más bajo de absorbancia con 0.971.
Cuadro 2 Medias y absorbancias de las enzimas oxidasas y glutatión S-transferasas, de las diferentes zonas productoras de solanáceas en el estado de Sinaloa.
Zona | Oxidasas | Glutatión S-transferasas | ||||
Media ± SD1 | Media ± SD1 | |||||
LS2 | 0.971 ±0.007 | c | 0.04 ±0.068 | a | ||
Norte | 1.073 ±0.04 | b | 0 ±0 | a | ||
Centro | 1.216 ±0.04 | a | 0.152 ±0.155 | a | ||
Sur | 1.068 ±0.006 | b | 0.034 ±0.084 | a |
Medias con diferente letra presentan diferencia significativa (Tukey> 0.05). 1= desviación estándar; 2= línea susceptible.
Las oxidasas actúan oxidando la molécula insecticida permitiendo que entren en otros sistemas enzimáticos y sean expulsados (Pimentel et al., 2008), en B. tabaci su actividad se ha correlacionado con la resistencia a neonicotinoides y avermectinas (Rauch y Nauen, 2003; Wang y Wu, 2007; Roditakis et al., 2010). En el caso de glutatión S-transferasas la línea susceptible presentó una media de 0.04, al tomarse como umbral de resistencia, la media más elevada se presentó en población del Centro con 0.152, la población del Sur que mostró una media de 0.034, el alto contenido de glutatión S-transferasas (Cuadro 2).
En B. tabaci inhabilita la acción de neonicotinoides (Yang et al., 2016), organofosforados y piretroides (Ortelli et al., 2003; Hu et al., 2014) piriproxifen (Ma et al., 2010) y diafenthiuron (Zhang et al., 2015). Se ha reportado que estas enzimas actúan conjugando el grupo tiol de glutatión (GSH;\(L-g-glutamil-L-cisteinil-glicina) a compuestos que poseen un centro electrofílico, con lo que pueden eliminar los sustratos de una célula al aumentar su solubilidad en el agua (Low et al., 2010).
Finalmente, la presencia de acetilcolinesterasas en las poblaciones de Sinaloa y en la línea susceptible de laboratorio no presentó diferencias significativas (Cuadro 3). En otros estudios se menciona que la resistencia de B. tabaci a insecticidas (como metamidofos, clorpirifos, foxim, fenvalerato, avermectina, benzoato de emamectina, spinosad, fipronil e imidacloprid) se relaciona con la insensibilidad o ausencia de la acetilcolinesterasa Kang et al. (2006) ya que se considera como resistencia no metabólica la cual está asociada a mutación en el sitio de acción de Acetilcolinesterasa (Ramya et al., 2016).
Cuadro 3 Medias y absorbancias de la enzima acetilcolinesterasa de las diferentes zonas productoras de solanáceas en el estado de Sinaloa.
Zona | Acetilcolinesterasa | ||
Media ± SD | |||
LS2 | 0.006 ±0.011 | a | |
Norte | 0 ±0 | a | |
Centro | 0.006 ±0.003 | a | |
Sur | 0.005 ±0.003 | a |
Medias con diferente letra presentan diferencia significativa (Tukey> 0.05). 1= desviación estándar; 2= línea susceptible.
Los principales mecanismos detoxificativos en el estado de Sinaloa fueron las α-esterasas, β-esterasas y oxidasas al presentar una proporción de resistencia de 100% y categorizándose como muy ‘alterado’ para las tres zonas en estudio. Para el caso de glutatión S-transferasas sólo en la zona centro se presentó como un importante mecanismo detoxificativo al reportar un factor de resistencia de 66% y una clasificación de ‘alterado’, mientras en las zonas Norte y Sur, no se considera como un mecanismo importante de resistencia a insecticidas al mostrar una nula proporción de resistencia y clasificándose como ‘inalterado’.
En lo que se refiere a acetilcolinesterasa se considera como un mecanismo poco relevante para el desarrollo de resistencia a insecticidas en B. tabaci en el estado de Sinaloa al no registrarse en las pruebas fisicoquímicas (Cuadro 4).
Cuadro 4 Proporción de resistencia (%) en las zonas norte, centro y sur de Sinaloa, en comparación.
Zona | α-esterasas | β-esterasas | Glutatión S-transferasas | Acetilcolinesterasa | Oxidasas |
Norte | 100 e | 100 e | 0 a | 0 a | 100 d |
Centro | 100 e | 100 e | 66 d | 0 a | 100 d |
Sur | 100 e | 100 e | 0 a | 0 a | 100 d |
Clasificación según Montella et al. (2007). a= ‘inalterado’; b= ‘incipientemente alterado’; c= ‘moderadamente alterado’; d= ‘alterado’; e= ‘muy alterado’.
La comprensión de estos mecanismos de resistencia es el aspecto más importante para el manejo de la resistencia en insectos plaga (Guo et al., 2014; Zhang et al., 2016; Horowitz, et al., 2020). Kang et al. (2006) señalan que la presencia o ausencia de enzimas detoxificativas y la diferencia de resistencia a insecticidas podría estar asociada con diferentes antecedentes de aplicación química en el campo; el estado de Sinaloa, fue documentado por Cortinas (2000) como una de las zonas con más consumo de plaguicidas representando 30% del consumo nacional, mientras que 70% es representado por el conjunto de otras zonas productoras (Jalisco-Nayarit-Colima, Sonora-Baja California, Tamaulipas, Michoacán, Chiapas, Veracruz, Tabasco, Estado de México, Puebla y Oaxaca).
Los plaguicidas empleados con más frecuencia en el Noroeste de México son los ditiocarbamatos, bipiridilos, organofosforados, organoclorados, carbamatos, piretroides y compuestos inorgánicos (Leyva-Morales et al., 2014), lo cual coincide con los altos niveles de resistencia y mecanismos detoxificativos reportados en el presente trabajo.
Conclusiones
Mediante el análisis de los niveles enzimáticos de tres poblaciones de B. tabaci provenientes del estado de Sinaloa, fue posible atribuir la resistencia a insecticidas de las poblaciones Norte Centro y Sur del estado a los sistemas enzimáticos de α-esterasas, β-esterasas y Oxidasas además de Glutation S-transferasas para la población del centro. Estos mecanismos de resistencia coinciden con los insumos químicos utilizados para el control de B. tabaci en el estado, como son: piretroides, organoclorados, neonicotinoides, organofosforados y carbamatos. Debido a esto, la detección del origen de la resistencia y su comprensión nos permite tomar las medidas y acciones para manejar la resistencia fisiológica y restaurar la sensibilidad en las poblaciones. Lo cual reduciría los altos costos en el control, las perdidas en las cosechas y la contaminación del medio ambiente.