Material biológico

Se emplearon cuatro aislados de la raza de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc). La raza Foc 5 provenientes de la zona Noroeste y las razas Foc. 0, Foc. 1 B/C y Foc 6 de la zona de El Bajío Guanajuatense, las cepas se identificaron previamente por medio marcadores moleculares tipo SCARs y RAPDs descritos por ^{Jiménez-Gasco et al. (2004}). Una cepa de F. solani y Sclerotium rolfsii, y dos cepas de Macrophomina phaseolina aisladas de Sonora (M-Sonora) y Guanajuato (M-GTO).

Las cepas de Trichoderma harzianum (T1 y T2) fueron donadas por el Campo Experimental Bajío (CEBAJ) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), aisladas de suelos agrícolas de Valle de Santiago, Guanajuato. Se empleó semilla de garbanzo tipo blanco var. Blanoro (cosecha primavera otoño 2013) proporcionada por el banco de germoplasma del CEBAJ, cuyo resguardo fue a -4 °C con 80% HR.

Pruebas de antagonismo in vitro (cultivos duales)

Se evaluaron los mecanismos de acción antagónica de T1 y T2 frente los ocho fitopatógenos involucradas en la fusariosis del garbanzo (Foc 250. Foc. 71, Foc 27, Foc 12, Macrophomina phaseolina y Sclerotium rolfsii) empleando la técnica de cultivos duales (^{Dennis and Webster, 1971}). La evaluación se realizó mediante la observación de los mecanismos de competencia, micoparasitismo y antibiosis de acuerdo con la escala descrita por ^{Bell et al. (1982}) (Cuadro 1).

Los discos se colocaron en los extremos equidistantes de la caja y se incubaron a temperatura ambiente (22 °C). La evaluación de la capacidad antagónica se calculó estimando el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR). Este se obtuvo a partir del crecimiento de cada patógeno en cultivo dual, con respecto a los testigos, empleando la fórmula utilizada por ^{Suárez et al. (2008}).

Las pruebas se realizaron con cinco repeticiones (placas), en un diseño factorial de dos factores (cepa de Trichoderma y fitopatógenos), se realizó un análisis de varianza y comparación de medias Tukey (p≤ 0.05). El nivel de micoparasitismo se estimó considerando los criterios establecidos por ^{Widyastuti (2006}), para las observaciones microscópicas se utilizó la técnica de impronta con diurex, se empleó un microscopio compuesto Carl Zeiss Axiostar plus con un campo de visión de 40X.

Efecto de Trichoderma harzianum en el cultivo de garbanzo

Se estableció una parcela de garbanzo de la variedad Blanoro con un diseñó de bloques al azar con tres tratamientos experimentales correspondientes a TC: testigo sin fertilización, TQ: aplicación de 60 kg de nitrógeno ha^-1 y 40 kg de fósforo ha^-1, empleando urea (50-00-00) y superfosfato triple (50-00-00) y TB: aplicación de la cepa T2 (1x10⁸ UFC g^-1).

Para el efecto de la aplicación de Trichoderma en campo, se empleó la cepa T2, en función de que el tiempo de obtención de conidios fue más rápida. Cada tratamiento consistió en tres repeticiones, para un total de 9 unidades experimentales, cada una con 10 plantas repartidas de 39 surcos de 100 m y 0.8 m de ancho. A los 45 días después de la siembra (DDS) se realizaron las aplicaciones ‘in drench’ de los tratamientos TQ y TB.

Dos días después de la aplicación se iniciaron mediciones semanales hasta los 108 DDS de la altura de planta, diámetro del tallo, número de flores y de vaina y al finalizar el ciclo se midió la longitud de la raíz, peso de la planta y rendimiento. La altura de la planta se midió a partir del cuello al ápice empleando un flexómetro; el diámetro se consideró de la parte media de la planta y se evaluó con un vernier digital.

Posterior a la cosecha, se determinó la longitud de la raíz con un flexómetro; el rendimiento en grano se estimó obteniendo el peso de los granos de las plantas cosechadas por unidad experimental y transformada a rendimiento por hectárea a una humedad de 12%. Los datos obtenidos se analizaron con el software SAS v. 9, empleando un análisis de varianza y comparación de medias Tukey (p≤ 0.05).

Confrontaciones in vitro con Trichoderma harzianum (cultivos duales)

De acuerdo con la escala descrita por ^{Bell et al. (1982}), el nivel de antagonismo de T1 frente a las cepas de Fusarium fue de clase 1 ya que la cepa T1 invadió la superficie de la caja. En tanto en las confrontaciones con S. rolfsii, M. phaseolina (M-Sonora) y (M-GTO) el nivel de antagonismo de T1 se encontró en clase 2, debido a que solo cubrió dos terceras partes del área de crecimiento de los patógenos (Figura 1).

Figura 1 Evaluación antagónica in vitro cepa T1 (cultivos duales). Evaluación de la interacción 7 días de crecimiento. a) Foc 250, micoparasitismos y competencia por nutrientes; b) Foc 71, micoparasitismos y competencia por nutrientes; c) F. solani, micoparasitismos y posible antibiosis; d) S. rolfsii, micoparasitismos y competencia por nutrientes; e) Foc 27, micoparasitismos y presencia de enzimas antifungicas; f) Foc 12, micoparasitismos y competencia por nutrientes; y g) M-Sonora, micoparasitismos y competencia por nutrientes y H) M-GTO, micoparasitismos y competencia por nutrientes. 

Según los criterios de ^{Widyastuti (2006}), la cepa T1 exhibió mayor crecimiento con respecto al crecimiento de los patógenos asociados a la fusariosis vascular del garbanzo. Frente a las cepas Foc 250, Foc 71, Foc 12 se presentó micoparasitismo leve y competencia por los nutrientes; con F. solani posible antibiosis, mientras que con Foc 27 hubo producción de enzimas antifúngicas debido al cambio de coloración rosa pálido en el sitio de contacto.

En cuanto a S. rolfsii, presentó micoparasitismo moderado y competencia por nutrientes, las dos cepas de M. phaseolina (M-Sonora) y (M-GTO) mantuvieron micoparasitismo moderado y competencia por nutrientes. En cuanto a la cepa T2, se obtuvo un comportamiento similar de colonización de T1, el antagonismo contra las cepas Foc 250, Foc 27, Foc 71 y el Foc 12, F. solani, S. rolfsii y M. phaseolina (M-GTO) se encontró en la clase 1, mientras que con la cepa M-Sonora se observó una colonización de la mitad de la superficie del medio, lo que correspondió a un nivel de antagonismo clase 2 (Figura 2).

Figura 2 Evaluación antagónica in vitro cepa T2 (cultivos duales). Evaluación de la interacción 7 días de crecimiento. a) Foc 250, micoparasitismo y competencia por nutrientes; b) Foc 71, micoparasitismo y competencia por nutrientes; c) F. solani, micoparasitismo y competencia por nutrientes; d) S. rolfsii, micoparasitismo y competencia por nutrientes; e) Foc 27, micoparasitismo; f) Foc 12, micoparasitismo y competencia por nutrientes; g) M-Sonora, micoparasitismo y competencia por nutrientes; y h) M-GTO, micoparasitismo y competencia por nutrientes. 

En cuanto al mecanismo de antagonismo, siete de las cepas del patógeno presentaron micoparasitismo y competencia por nutrientes, excepto la cepa Foc 27 que exhibió micoparasitismo y crecimiento rápido (^{Widyastuti, 2006}) Otros estudios han coincidido que especies de Trichoderma mantienen valores de micoparasitismo frente a fitopatógenos en una escala de 1 (invasión completa); 2 (invasión a dos terceras partes); y 3 (Trichoderma y el fitopatógeno colonizan cada uno la mitad de la superficie) (^{Michel-Aceves et al., 2009}).

Según ^{Guédez et al. (2012}) una característica principal en la elección de cepas de Trichoderma para emplearse en el control biológico es la agresividad para micoparasitar y la velocidad de crecimiento, esta debe superar a la del patógeno a controlar. La invasión del micelio que ejerció Trichoderma confirmó su efecto hiperparásitico que redujo el desarrollo de micelios de los patógenos, se han señalado diferentes mecanismos de antagonismo que van desde la competencia por nutrientes y espacio, producción de metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas.

Las propiedades antagónicas de este hongo se basan en la activación de múltiples mecanismos que también promueven la producción de compuestos específicos y metabolitos que funcionan como factores de crecimiento de plantas y mejoran su resistencia sistémica contra las enfermedades (^{Hernández-Melchor et al., 2019}). A nivel de microscopio, los mecanismos de micoparasitismo de las cepas T1 y T2 sobre las ocho cepas fitopatógenas se observaron de forma general a través del enrollamiento, penetración y vacuolización (Figura 3).

Figura 3 Mecanismos de micoparasitismo de T2 contra a Foc 250. a) enrollamiento (flecha amarilla); b) penetración (flecha negra); c) penetración flecha azul; y d) vacuolización (flecha roja).  

Diferentes investigaciones indican que el proceso de micoparasitismo es el mejor mecanismo antagónico mostrado por Trichoderma, éste inicia cuando reconoce al hospedante y se une a las hifas mediante apresorios, posteriormente degrada la pared celular mediante la secreción de enzimas, principalmente quitinasas y β-1,3-glucanasas, celulasas, proteasas y fosfatasas (^{Qualhato et al., 2013}).

Los valores de porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR) en las ocho cepas evaluadas se encontraron en un intervalo de 49 a 85% (Cuadro 2). De acuerdo con el análisis de varianza (p≤ 0.05) se observó una diferencia significativa en los PICR con respecto a T1 y T2 y su efecto sobre los ocho patógena (Cuadro 2). La cepa T1 presentó mayor inhibición frente a F. solani, Foc 250, Foc 71 y Foc 12.

Un efecto similar se observó con T2 frente a F. solani, Foc 250 y Foc 71; sin embargo, la inhibición aumentó para Foc 27, S. rolfsii, M-GTO y M-Sonora, en este último el PICR fue considerable al observarse un aumento de 53% con respecto a T1. Estos resultados coinciden con lo documentado por autores como ^{Michel-Aceves et al. (2009}) quienes indicaron PICR en un intervalo de 16.4 a 77.8% cuando evaluaron Trichoderma frente a F. oxysporum f. sp. lycopersici y 13.1 a 94.4% para S. rolfsii.

En otro estudio realizado por ^{Rudresh et al. (2005}) empleando T. harzianum, obtuvieron valores de inhibición en un rango de 12.2 a 59.9% para S. rolfsii y de 65.2 a 77% para F. oxysporum f. sp. ciceri. En tanto, para M. phaseolina^{Salazar et al. (2012}) determinaron PICR en intervalos de 67 al 91%; mientras que Cubilla-Ríos et al. (2019) obtuvieron inhibición entre 55.6 a 52.8%.

Efecto de T. harzianum en el cultivo de garbanzo

Las plantas inoculadas con TB (aplicación de la cepa de Trichoderma T2) presentaron incrementos en altura de 2.2, 3 y 2.3% en los días 66, 73 y 81, respectivamente, comparadas con el control (Figura 4a); mientras que con TQ (aplicación de fertilizante químico) los valores fueron 1.3% menores. Con respecto al diámetro del tallo, las principales diferencias se observaron a partir del día 94, durante este periodo las plantas con la aplicación de Trichoderma y la fertilización química presentaron incrementos de 3.3 y 3.5%, respectivamente (Figura 4b).

Figura 4 Evaluación de la altura (a) y diámetro del tallo (b) en plantas de garbanzo. n= 30. 

El efecto en la altura y diámetro de las plantas que se encontraron en este estudio fueron menores en comparación con otros estudios, como el documentado por ^{Boureghda y Bouznad (2009)}, quienes aplicaron T. harzianum en plantas de garbanzo, sus resultados indicaron aumentos en promedio de 8% en la altura de las plantas. En tanto Oliva-Ortíz et al. (2017) al evaluar el efecto de cepas de Trichoderma obtuvieron incrementos de 26% con respecto al testigo, adicionalmente, observaron un incremento del diámetro del tallo del 8% con respecto al control.

En relación con la variable número de flores y de vainas, se observó que TB estimuló la floración a partir del día 56, de esta forma, para el día 66 se estimó un aumento de 30% con respecto al control, mientras que con el tratamiento TQ se determinó 10% menos de flores con relación al control. En general, no se observaron diferencias significativas (p< 0.05). Después del día 81 ambos tratamientos presentaron un comportamiento similar (Figura 5a).

En cuanto a la formación de vainas con TB hubo un aumento de estas a partir del día 73 con respecto al control, mientras que con TQ esta tuvo un ligero aumento a partir del día 87, en promedio el aumento fue de 24 y 11%, con TB y TQ, respectivamente (Figura 5b). Autores como ^{Mukherjee et al. (2019}) encontraron adelanto de la floración (7-10 días) en garbanzo y lenteja cuando aplicaron T. virens, además de observar 26% de incremento en la producción.

Figura 5 Evaluación del número de flores (a) y vainas (b) en plantas de garbanzo. n= 30. 

En este sentido ^{Mishra y Nautiyal (2018}) obtuvieron incrementos de 20% en la producción de vainas de garbanzo cuando aplicaron T. viride. En otro estudio realizado por ^{Ávila-Miramontes et al. (2015}) donde evaluaron diferentes tratamientos a base de T. harzianum, B. subtilis, Mesorhizobium ciceri y fertilización nitrogenada, pudieron observar que con la combinación T. harzianum + fertilización se tuvo mayor precocidad y emisión constante de flores, así como un periodo largo de fructificaciones.

Para la variable longitud de raíz se determinó diferencia significativa (p≤ 0.05) entre tratamientos TB y TQ causaron un aumento de 40 y 13%, respectivamente, con referencia al control (Cuadro 3). Este comportamiento se ha presentado en diversos estudios en los que se aplica Trichoderma y que registran incrementos en la longitud de la raíz, debido a la estimulación de la producción de hormonas, principalmente auxinas, las que son sintetizadas a partir de fuente de triptófano que se secretan naturalmente en los exudados de las raíces de las plantas (^{Hoyos-Carvajal et al., 2009}).

Es entonces, que el incremento de la raíz permite a las plantas abarcar volúmenes extensos de suelo y aumentar la absorción de nutrientes disponibles y los que han sido solubilizados por el mismo hongo (^{Jyotsna et al. 2008}; ^{Hoyos-Carvajal et al., 2009}). Al respecto ^{Kumar et al. (2014}) obtuvieron resultados similares al emplear 5% de T. harzianum con relación a un kg de semilla de garbanzo, adicionalmente, redujo la incidencia de la marchitez asociada al complejo F. oxysporum f. sp. ciceris, M. phaseolina y S. rolfsii.

De la misma forma, ^{Jyotsna et al. (2008}) detectaron incrementos en el tamaño de la raíz entre 25 a 27% y la disminución de enfermedades en 40 a 60%, los autores indicaron que la estimulación de la producción de hormonas en etapas tempranas de crecimiento puede ayudar al crecimiento de la planta y el desarrollo de raíces. ^{Hoyos-Carvajal et al. (2009}) recomienda que cepas de Trichoderma promotoras de crecimiento pueden ser empleadas para la formulación de nuevos productos que sean benéficos para en la agricultura.

Con respecto al rendimiento, se determinó que con TQ hubo un aumento de 13% y con TB de 23%, ambos datos con respecto a TC. Estos resultados coinciden con diferentes autores que señalan incrementos en el rendimiento de cultivos (^{Oliva-Ortiz et al., 2017}; ^{Ávila-Miramontes et al., 2015}; ^{Ruiz-Cisneros et al., 2018}).

En garbanzo los estudios realizados con Trichoderma están enfocados al control de patógenos, principalmente, F. oxysporum f. sp. ciceris y de forma secundaría estiman los efectos en el crecimiento y producción de las plantas, de tal forma, que sus resultados indican la disminución de la severidad de la enfermedad, así como incrementos en el rendimiento, tal es el caso de ^{Oliva-Ortiz et al. (2017}) quienes encontraron un aumento de más de 70% al aplicar la cepa HRG-060.

Así como la disminución de incidencia y marchitez de raíz, los autores obtuvieron diferentes resultados entre cepas, señalando que no todas mantienen los mismos efectos con respecto a las variables estudiadas. En tanto, ^{Khan et al. (2014}) demostró que al hacer aplicaciones de Trichoderma en suelo obtuvieron reducción de la severidad de la enfermedad de 25% a 67%, a la vez que obtuvieron incrementos de rendimientos en un intervalo de 8 a 24%. Así también, ^{Kumar et al. (2014}) demostró que la aplicación de T. harzianum incrementó el rendimiento en 68% y al mismo tiempo la incidencia disminuyó en 91%.

Los incrementos en producción pueden atribuirse por un lado a la protección antagónica de Trichoderma sp. Contra agentes causales de enfermedades en la planta y por otro lado a la síntesis de compuestos reguladores de crecimiento o que intervienen en la asimilación de nutrientes para la planta (Hoyos-Carbajal et al., 2009; ^{Hernández-Melchor et al., 2019}).

Asimismo, en algunos cultivos como fríjol se reconoce que Trichoderma sp. Favorece la germinación de la semilla a través de la producción de enzimas líticas que degradan el epispermo, el cual es una cubierta seminal que constituye a la testa; adicionalmente, el hongo es capaz de promover el desarrollo de los tejidos meristemáticos primarios, los que son responsables del crecimiento de la planta con relación a la altura, peso y desarrollo de raíces (^{Zúñiga-Silgado y Vélez-Vargas, 2016}).

De acuerdo a los resultados que se obtuvieron con T1 y T2, ambas cepas tuvieron potencial para usarse en el control de patógenos, así como para el incremento de las características agronómicas que se evaluaron; sin embargo, considerando las experiencia de los productores es necesario realizar evaluaciones para determinar la dosis óptima de aplicación Trichoderma (UFC g^-1) considerando en las condiciones de cada unidad de producción, principalmente el nivel de inóculo inicial de fitopatógenos, la disponibilidad de nutrientes y las condiciones climáticas y edafológicas del área.