Localización del área de estudio

Ejemplares de la especie Entoloma sp. fueron colectados en relictos de bosque mesófilo de montaña ubicados en la finca Ocotitla, en la comunidad de Xaltepuxtla, en el estado de Puebla, entre las coordenadas 20° 11’ 23.06” a 20° 10’ 57.124” latitud norte y 97° 58’ 5.303” a 97° 57’ 30.836” longitud oeste, a una altura promedio de 1 280 msnm (^{Mateo-Guzmán, 2018}). El clima corresponde a un semicálido húmedo con lluvias todo el año, precipitación del mes más seco mayor de 40 mm y menos de 18% de lluvia invernal con respecto a la lluvia total y su temperatura media anual oscila entre los 18° y 24 °C.

Colecta y desinfección del material

Se recolectaron hongos de cuerpo completo durante el período de emergencia de estos, entre diciembre y enero, cuando las condiciones de sustrato orgánico, temperatura y humedad son favorables para su crecimiento (^{Mateo, 2018}). Se cubrieron con papel aluminio y se transportaron en una hielera para contar con material fresco para su aislamiento. En el laboratorio, este proceso consistió en seleccionar hongos enteros y sanos; desinfectar la superficie de los hongos por medio de un algodón embebido en una solución de agua con detergente, posteriormente con una solución de cloro al 10% y finalmente en una solución al 0.2% de antibiótico gentamicina de uso veterinario.

Obtención de micelio

La obtención del micelio en los tres medios de cultivo se hizo mediante la metodología de ^{Ardón (2007)}; Silva et al. (2010), que consiste en aislamiento por contexto, proceso de purificación y prueba de crecimiento del micelio en medios de cultivo. Ésta última etapa consistió en: a) resembrar las cepas obtenidas del aislamiento por contexto (vegetativo) en tres medios de cultivo (extracto de malta-extracto de levadura-polipeptona-agar (MYPA); peptona de carne-dextrosa-extracto de levadura-agar bacteriológico (CYM) y extracto de malta-salvado (EMS); b) comparar su crecimiento en cada uno; c) definir el medio en el que mejor se adapta y crece el micelio; d) inocular más de cinco cajas por medio; e) escoger cinco de éstas con mejor apariencia y ausencia de contaminantes; f) extraer una fracción de cepa en forma circular de aproximadamente 0.5 cm; g) colocar ésta en el centro de una caja Petri; h) sellar ésta con parafilm y etiquetarla con el nombre del medio y la fecha de inoculación; i) colocar la caja sellada y etiquetada a temperatura ambiente; y j) medir el diámetro de crecimiento micelial cada dos días.

Análisis de datos

Para el análisis de datos del crecimiento del diámetro micelial en los tres medios de cultivo: MYPA, CYM y EMS, se aplicó un análisis de varianza (Anova) de una vía (1V) para medidas repetidas (MR), Anova-1V-MR (^{Davis, 2002}), para determinar si estos tienen algún efecto en el crecimiento del diámetro del micelio del hongo Totolcozcatl, donde los medios de cultivo corresponden al factor categórico con tres niveles. El método consistió en: a) comprobar los supuestos de homogeneidad entre las varianzas de las diferencias entre todos los posibles pares de medio de cultivo y la normalidad de los errores por medio de la prueba de esfericidad de Mauchly y Shapiro-Wilk, respectivamente; b) aplicar la prueba de épsilon Greenhouse y Geisser o el enfoque multivariante, en los casos donde no se cumpla el supuesto de esfericidad; y c) aplicar el modelo estadístico yij= μ+πi+τj+εij .

Para cada i = 1,⋯, n y j = 1,⋯, J en la ecuación, yij es la respuesta del crecimiento del diámetro micelial del sujeto i en el j -ésimo nivel del factor o medio del cultivo j , μ es la media general de la variable respuesta, πi es el efecto aleatorio asociado al sujeto el cual es constante en todas las repeticiones, τj es el efecto fijo en el j -ésimo nivel del medio del cultivo, y εij es el error experimental asociado al sujeto i bajo el tratamiento j . Se asume que los efectos aleatorios πi son normales N(0,σπ2) independientes, los errores aleatorios εij son normales N(0,σε2) independientes y los efectos aleatorios πi y los errores aleatorios εij son independientes. Se asume que los efectos fijos τj satisfacen la restricción de que la suma de estos sea igual a 0. ∑j=tτj=0 . Dicho modelo se aplicó para comparar las medias de las variables; es decir, evaluar sus diferencias y probar las siguientes hipótesis.

Ho : el efecto de los medios de cultivo MYPA, CYM y EMS es el mismo en el crecimiento del diámetro micelial versus H1 : al menos uno es diferente.

Las pruebas de hipótesis se realizaron con un nivel de significancia α= 0.05 y la comparación entre medias mediante el método de Bonferroni (^{Morell, 2014}) con el software SPSS (^{IBM Corp. Released, 2012}).

Determinación de la dinámica del crecimiento micelial

La dinámica del crecimiento del diámetro fúngico o aumento de biomasa micelial está en función de los parámetros de fermentación e inclusive frente a situaciones de estrés (^{Deacon, 2006}; ^{Huang et al., 2010}). Varios modelos se han aplicado para describir la cinética del crecimiento del diámetro micelial en distintos tipos de cultivo, como el modelo lineal, exponencial, modelo logístico, como también, modificaciones de éstos (^{Viniegra-González et al., 1993}; ^{Mitchell et al., 2004}). Para la determinación de la dinámica del crecimiento del diámetro promedio micelial se utilizó la ecuación diferencial propuesta por ^{Sarikaya y Ladisch (1997)}.

dDdt=μ1D-k1D2

Donde: D= diámetro de crecimiento micelial (mm), t= tiempo (días), μ1= la tasa específica de crecimiento (días^-1), K= es el diámetro máximo de crecimiento micelial (mm) y k1=μ1K= es el factor de retención de crecimiento. Cuando el crecimiento del D es pequeño, el facto k1D2 es insignificante, por lo que la población microbiana tiene un crecimiento exponencial. Sin embargo, si la cobertura de la superficie por biomasa microbiana es grande, la tasa de crecimiento del micelio se reducirá como resultado de la competencia de una población en crecimiento por un sustrato limitado; es decir, el efecto de la competencia estaría relacionado solo con la longitud de hifas.

El modelo de la dinámica del crecimiento micelial, obtenido de la integración de dDdt , ajustado a los datos fue: Dt=K1 + Ce-μ1t donde: C=ck1 , y c= es la constante de integración. El punto en el que la población Dt crece rápidamente de un tiempo a otro se obtuvo en el instante en que D't es máximo y D"t= 0 :

d2Ddt2=d(μ1D-k1D2)dt= 0 tal queDtmáx=K2

Y esto sucedió cuando t es igual a: K2=K1+Ce-μ1ttal quetmáx=ln⁡Cμ1 . Finalmente, la producción excedente o número de individuos agregados a la población de un tiempo a otro, se obtuvo mediante: dDdt=μ1K2-k 1K22tal quedDdtmáx=μ1K4 .

Los parámetros K, C yμ1 se obtuvieron; a través, del ajuste modelo logístico a los datos experimentales por medio del algoritmo de Marquardt con el software Curve Expert versión 1.3 (^{Hyams, 2003}).

Determinación del crecimiento del diámetro micelial

En el Cuadro 1, se muestran los resultados obtenidos del crecimiento promedio del diámetro micelial del hongo Totolcozcatl en los tres medios de cultivo. El crecimiento promedio neto del micelio fue 88.5, 78.3 y 89.5 mm, para el medio de cultivo MYPA, CYM y EMS, respectivamente. Diferenciando entre los medios de cultivo, en EMS se alcanzó un diámetro promedio máximo de crecimiento de 90 mm a los 16 días, seguido de MYPA y CYM con 89 y 78.8 mm, respectivamente, en el mismo período de tiempo.

Con base a la variabilidad observada durante el desarrollo del micelio y los datos ajustados, la Figura 1 muestra que el desarrollo en diámetro promedio micelial del hongo Totolcozcatl fue más favorable en el medio de cultivo EMS, logrando colonizar la caja Petri en un período de 14 días, seguido del MYPA y del CYM.

Figura 1 Desarrollo del diámetro promedio micelial de cepas de hongo Totolcozcatl, cultivadas en tres medios de cultivo. MYPA= extracto de malta-extracto de levadura-polipeptona-agar; CYM= peptona de carne-dextrosa-extracto de levadura-agar bacteriológico; y EMS= extracto de malta- salvado. 

Análisis de varianza de medias repetidas de una vía (Anova-MR-1V) para medios de cultivo

Con la finalidad de determinar si los medios de cultivo tienen algún efecto en el crecimiento promedio del diámetro micelial del hongo Totolcozcatl, se aplicó la técnica estadística del Anova-MR-1V a los datos experimentales. El medio de cultivo correspondió al factor categórico con tres niveles; es decir, los medios de cultivo: 1-MYPA, 2-CYM y 3-EMS, respectivamente. El crecimiento del diámetro promedio del micelio se definió como la variable dependiente; es decir, caja petri 1. Efecto del MYPA, caja petri 2. Efecto del CYM y caja petri 3. Efecto del EMS. El tamaño de la muestra fue de ocho, que son veces que se tomaron los datos.

En el Cuadro 2, los resultados de la prueba de esfericidad de Mauchly indican que las varianzas de las diferencias entre cada dos niveles del factor no son iguales. Esto significa que la matriz de varianzas y covarianzas no es circular o esférica, dado que el nivel crítico asociado al estadístico (significancia: 0.014) no es mayor que 0.05. En consecuencia, se utilizó el estadístico F univariado, aplicando un índice corrector llamado épsilon, el cual expresa el grado en que la matriz de varianzas-covarianzas se aleja de la esfericidad. En condiciones de esfericidad perfecta, épsilon debe de valer 1. Épsilon fue estimado mediante el estadístico de Greenhouse-Geisser y Huynh-Feldt, siendo la primera de ellas más conservadora. Épsilon también se estimó con el valor límite inferior, el cual expresa el valor que adoptaría en el caso de incumplimiento extremo del supuesto de esfericidad.

Por lo anterior, se hizo la corrección de los grados de libertad de F (tanto en el numerador como en el denominador) multiplicándolos por el valor estimado de épsilon. En consecuencia, en el Cuadro 3, los resultados obtenidos en los cuatro estadísticos F indican que se rechaza la hipótesis nula, dado que el nivel crítico asociado a cada una de las pruebas es menor que 0.05, esto significa que existen diferencias estadísticamente significativas en el desarrollo del hongo en al menos uno de los tres medios de cultivo.

Comparación de medias por medio de la prueba de Bonferroni

Los resultados obtenidos de las comparaciones dos a dos entre los medios de cultivo de acuerdo con los niveles críticos asociados a cada comparación indican que únicamente existen diferencias significativas entre el medio de cultivo 2 con respecto al 1 y 3, mientras que entre 1 y 3 no hay diferencias (Cuadro 4). Este primer análisis indicó que los medios de cultivo MYPA y EMS son los más favorables para el desarrollo del crecimiento del diámetro promedio micelial del hongo Totolcozcatl que el CYM.

Las diferencias encontradas en el crecimiento del diámetro entre los tres medios empleados se asocian a la composición química de estos. El medio EMS posee características nutritivas que favorecen el desarrollo de la especie, ya que proporciona nutrientes como maltosa, glucosa y el salvado de trigo, que suministra celulosa, polisacáridos y hemicelulosa, que, en el hábitat natural del hongo, la celulosa está siempre presente en la materia en descomposición (^{Mateo, 2018}). Esto favorece que los hongos incrementen la ramificación de sus hifas y por consiguiente, la cantidad de biomasa y el área superficial del micelio (^{Harris, 2008}). Por el contrario, si los nutrientes son limitados, el micelio tiende a ser menos ramificado (^{Prosser y Tough, 1991}).

Determinación de la dinámica del crecimiento micelial

El modelo ajustado a los datos de crecimiento medido como diámetro promedio micelial del hongo Totolcozcatl, en los tres medios de cultivo fue el logístico, lo cual coincidió con lo expuesto por ^{Sarikaya y Ladisch (1997)}, quienes mencionan que las mediciones del diámetro micelial presentan un buen ajuste con un modelo logístico, aunque, este ajuste resulta mejor cuando se utiliza el área de las colonias como variable.

De acuerdo con ^{Madigan et al. (2004)}, este comportamiento característico del desarrollo microbiano, evidencia tres etapas. La primera es de latencia, asociada a la síntesis de enzimas que permiten la utilización de los nutrientes del medio de cultivo. La segunda es exponencial, obteniéndose en ésta el punto de crecimiento máximo Dtmáx=K2 y la tercera es estacionaria, donde la velocidad de crecimiento disminuye debido, posiblemente, a la menor disponibilidad de nutrientes y es donde se alcanza el máximo crecimiento (K). En los tres modelos ajustados, sus coeficientes de determinación R² fueron próximos a 0.99 (Figura 2, 3 y 4).

Figura 2a Desarrollo del diámetro promedio micelial de cepas de hongo Totolcozcatl cultivadas en el medio cultivo MYPA. 

Figura 2b Producción excedente o número de hifas agregadas al micelio de un tiempo a otro, en función del tamaño de su población. 

Figura 3 a) desarrollo del diámetro promedio micelial de cepas de hongo Totolcozcatl cultivadas en el medio cultivo CYM; y b) producción excedente o número de hifas agregadas al micelio de un tiempo a otro, en función del tamaño de su población. 

Figura 4a Desarrollo del diámetro promedio micelial de cepas de hongo Totolcozcatl cultivadas en el medio cultivo EMS. 

Figura 4b Producción excedente o número de hifas agregadas al micelio de un tiempo a otro, en función del tamaño de su población. 

Respecto a la dinámica del desarrollo del diámetro del micelio del hongo Totolcozcatl en el medio MYPA, en la Figura 2, el modelo ajustado indica que su máximo crecimiento, conocido también como capacidad de carga, se consiguió en K= 91.51 mm, en un período de 16 días. Mientras que el punto en que las hifas crecen rápidamente de un tiempo a otro fue Dtmáx=K2=91.512= 45.76 mm y se alcanzó en tmáx=ln⁡Cμ1=ln⁡17.880.39= 7.48 días. La producción excedente o el máximo número de hifas o ramificaciones agregados al micelio; es decir, el crecimiento óptimo del diámetro promedio del micelio fue dDdtmáx=μ1K4=0.39*91.514= 8.83 mm y análogamente se logró a los 7.48 días y tiene lugar en K2= 45.76 .

De acuerdo con ^{Madigan et al. (2004)}, al inicio, la suficiencia de recursos, en espacio y alimento, permite crecer a las hifas en número e individualmente casi sin restricciones, de manera geométrica, ya que cada unidad de diámetro incrementada significa una disminución en la disponibilidad de los recursos. En consecuencia, la velocidad con que venía creciendo las hifas se reduce paulatinamente hasta que todos los recursos del medio de crecimiento son consumidos tan rápido como se producen, y el micelio deja de crecer.

Este punto se le conoce como capacidad de carga tal y como ya se mencionó anteriormente ( K ; Figura 2a). Si se considera solo el número de hifas (biomasa) que se agrega al micelio de un tiempo a otro (producción excedente), éste aumentó en las primeras etapas, alcanzando un máximo y comenzó a disminuir de manera simétrica a la parte inicial, llegando a cero cuando el tamaño del micelio alcanzó el valor de K ( Dtmáx=K2 ) (Figura 2a). El mayor número posible de hifas que pudo sumarse al micelio durante un lapso determinado (máxima productividad o máximo crecimiento neto) igualmente se obtiene justo a la mitad de K ( dDdtmáx=μ1K4 ) (Figura 2b).

El modelo ajustado a los datos experimentales con el medio de cultivo CYM y EMS (Figura 3 y 4) indican que su capacidad de carga y el punto de máximo crecimiento resultó cerca de (K=83.23 mm yDtmáx=41.61 mm) 9% y (K=95.95 mm yDtmáx=47.97 mm) 5% menor y mayor que la correspondiente al MYPA, respectivamente (Figura 3a y Figura 4a). Mientras que la producción excedente o número de hifas, agregadas al micelio de un tiempo a otro fue dDdtmáx=6.86 , para el sustrato CYM, y dDdtmáx=9.59 , para el sustrato EMS, resultando cerca del 22 y 9 % menor y mayor que el MYPA, respectivamente (Figura 3b y Figura 4b). Finalmente, el tiempo en que las hifas crecen rápidamente fue tmáx=7.48 para el medio CYM y tmáx=7.37 para el medio EMS, resultando cerca del 15% y 1 % mayor y menor, respectivamente, que en MYPA.