Análisis morfométrico de la hoja de aguacate

Se colectaron muestras de hojas en árboles de una huerta de aguacate Hass en el municipio Tetela del Volcán, estado de Morelos, considerando como patrones de deficiencia el grado de enroscamiento, la presencia de clorosis y la disminución en el crecimiento de las hojas. Las muestras de hojas fueron colectadas con diferentes grados de deficiencia de calcio, determinado con base al diagnóstico visual una deficiencia crítica (CaC), hojas con deficiencia media de calcio (CaM) y hojas sanas (CaS). Se evaluaron las variables grosor de la hoja, parénquima esponjoso + epidermis, largo de parénquima en empalizada y el ancho del parénquima de empalizada, para lo cual se utilizó la microscopia electrónica de transmisión. Para su análisis se siguió la metodología de ^{Hayat (2000)}.

Los tejidos seleccionados fueron cortados partes de 1 mm² los cuales fueron fijados con glutaraldehído al 6% en buffer cacodilato de sodio al 0.2M pH 7.4 por 24 h. Posteriormente, se lavaron tres veces con el buffer cacodilato de sodio 0.05M pH 7.4 y fueron postfijados con tetraoxido de osmio 2% por 24 h. Después, se lavaron las muestras nuevamente con el buffer cacodilato de sodio 0.05M pH 7.4 para así empezar una secuencia de deshidratación con series crecientes de alcohol etílico anhidro. Luego se hizo una infiltración con tolueno y finalmente, los tejidos fueron incluidos con resina araldita por 24 h a temperatura ambiente. Se hicieron cortes de las secciones con un ultramicrotomo a 20 nm a 3 mm s^-1 con navaja de diamante, dichos cortes fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo. La observación se realizó en un microscopio electrónico de transmisión (MET) de la marca FEI modelo TECNAI 1 a 120 kV.

Muestreo de suelos. En la huerta se seleccionaron de manera aleatoria 25 sitios de muestreo, ubicados en las zonas de goteo del árbol. En cada sitio de muestreo se extrajo con una barrena de acero inoxidable, una submuestra de 50 g de suelo a una profundidad de 0-30 cm. La muestra colectada fue de 1.25 kg de suelo, con la cual se formó figura esférica que fue dividida en cuatro partes, desechándose dos partes opuestas, hasta lograr obtener 300 g de muestra para su análisis.

Se determinó la fertilidad del suelo mediante el análisis del pH relación 1:2 suelo-agua con potenciómetro, CIC (cationes intercambiables extraídos con acetato de amonio 1 N pH 7). El nitrógeno por el método Kjeldahl, fósforo por el método Bray, potasio por espectrofotometría de emisión de flama, calcio y magnesio por volumetría (EDTA 0.01 N). El hierro, cobre, zinc y manganeso fueron extraídos y leídos en espectrofotómetro de absorción atómica (^{Etchevers, 2001}), mientras que el B fue determinado por el método de la azometina-H.

Muestreo foliar. En 25 árboles seleccionados al azar, se colectaron 4 hojas por árbol, ubicadas en la quinta posición a partir del ápice, sanas, sin daño físico, químico o biológico, de ramas bien iluminadas, ubicadas en los cuatro puntos cardinales y a una altura media de 2 m; a partir, de la superficie del suelo, haciendo un total de 100 hojas por muestra.

Las hojas se colocaron en bolsas de papel y fueron mantenidas en una hielera hasta su ingreso al laboratorio, donde se lavaron, secaron a 70 ºC hasta peso constante, molidas en molino de acero inoxidable a malla 40. Se tomaron 0.5 g del tejido seco y molido; posteriormente se colocaron en matraz Kjeldahl con 4 ml de mezcla diácida (4:1 de ácido sulfúrico y ácido perclórico), más 2 ml de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada al 30%) para acelerar la reacción y después el matraz se colocó en una estufa de digestión Lindenberg SB a 260 ºC, hasta que se obtuvo un extracto transparente y cristalino que se aforó a 50 mL con agua destilada.

El extracto fue analizado determinándose los nutrimentos por los métodos siguientes: nitrógeno por el método Khejdahl, fósforo por fotocolorimetría de vanadato-molibdato (amarillo) leído en espectrofotómetro Spectronic 20, potasio por flamometría leído en flamómetro Corning modelo 410, calcio, magnesio, cobre, hierro, zinc y manganeso fueron determinados en un espectrofotómetro de absorción atómica y boro fue determinado por el método de la azometina-H.

Índices de balance Kenworthy

Los resultados de los análisis foliares se interpretaron mediante la técnica de Kenworthy utilizando estándares propuestos por ^{Benton et al. (1991)} y los coeficientes de variación establecidos por ^{Maldonado (1999)}. El diagnóstico por cada tratamiento estableció como deficiente valores de 17 a 50, abajo del normal con 50 a 83, normal de entre 83 a 117, arriba del normal de 117 a 150 y exceso de 150 a 183 (^{Kenworthy, 1967}).

Diagnóstico mediante la técnica DRIS

Para el diagnóstico mediante el sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS), se utilizaron los valores de referencia propuestos por ^{Beverly et al. (1984)}.

Relaciones nutrimentales y su relación con variables morfológicas de hojas

Con los datos de los análisis de suelo y hoja, DRIS y Kenworthy, se obtuvieron las relaciones nutrimentales entre todos los elementos y posteriormente se relacionaron con las variables morfológicas grosor de la hoja, parénquima en esponjoso + epidermis, largo de parénquima en empalizada y el ancho del parénquima en empalizada.

Análisis ultraestructural en hojas de aguacate

En muestras de tejido de un corte transversal en hojas de aguacate, se realizó el análisis ultraestructural por espectroscopia de rayos X y microscopia electrónica de barrido. De igual forma que en las muestras para la microscopia electrónica de transmisión las muestras siguieron el mismo procesamiento hasta la postfijación con osmio al 2%. Las muestras luego de la postfijación y tres lavados con el buffer cacodilato de sodio 0.05 M pH 7.4, fueron montadas en stubs para su observación a alto vacío en un microscopio electrónico de barrido marca FEI modelo Quanta 450 a un voltaje de 25 kV y una corriente de emisión de 90-105 µA.

El análisis por espectrometría de dispersión de energía de rayos-X se realizó mediante un detector Edax smart insight de la compañía Ametek acoplado al microscopio electrónico de barrido. El voltaje utilizado fue de 30 kV a 10 (mm) WD.

Análisis de datos

Las dimensiones celulares y concentraciones nutrimentales obtenidas se procesaron mediante SAS y Microsoft Excel usando 5% de significancia en las pruebas de correlación de Pearson.

Análisis morfométrico de la hoja de aguacate

La uniformidad en el grosor de la hoja, el límite entre un tipo de células y otro, densidad de tricomas, uniformidad en el arreglo y distribución de las células, curvatura de la hoja, uniformidad en el tamaño del mismo tipo de células y la claridad para observar la distribución y el tipo de célula se manifestaron de forma degenerativa, de la hoja sana a la hoja con deficiencia crítica de calcio. Lo cual se atribuye a la función estructural que tiene el calcio en las paredes celulares y en la membrana, además de su colaboración en mantener la estabilidad e integridad de la célula (White et al., 2017). Por su parte, el grosor de la hoja que se muestra en el Cuadro 1, en todos los tratamientos fue menor a lo reportado por ^{González et al. (2011)} con aguacate Hass con 221.03 µm y por ^{Morales et al. (1992)} con muestras de hojas de aguacate ‘Fuerte’ tomadas al sol con 257.06 µm y a la sombra con 154.31 µm.

El largo del parénquima en empalizada se presentó en la hoja con deficiencias de calcio, lo cual puede deberse a que la ausencia de calcio estimula la expansión celular debido a un incremento en la fluidez de la pared celular (^{Chebli y Geitmann, 2017}). El largo del parénquima esponjoso y agregando el largo de la epidermis no se acercó a los valores reportados de 75.71 µm y la variabilidad de los datos colectados fue mayor en la hoja sana que la deficiente (^{González et al., 2011}).

Análisis foliares y de suelo

En el Cuadro 2 se observa que para un suelo ácido la concentración de fósforo y potasio que fueron muy elevados con relación a los contenidos de calcio y magnesio, presentando así un desbalance como bases intercambiables, lo que se atribuye a las aplicaciones de fertilizantes considerando únicamente N-P-K, fertilización convencional (^{Horneck et al., 2011}). Dicho desbalance en las bases intercambiables se aprecia con las relaciones de Ca, Mg y K, donde la relación Ca/Mg a pesar de ser baja se mantiene en el rango ideal, mientras que ambas relaciones con potasio están muy por debajo de la proporción de cationes óptima (PPI, 1988).

La densidad aparente está dentro del rango reportadas en andosoles, mientras que el contenido de materia orgánica a pesar de estar en el rango reportado, es moderadamente bajo a su potencial (^{Alcalá et al., 2009}). Por su parte la capacidad de intercambio catiónico es alta (^{Cottenie, 1980}).

Dado el bajo valor de pH se considera un suelo ácido, lo cual propicia los bajos contenidos de calcio y los excesos de hierro y cobre. Donde se atribuye el exceso de cobre, además del pH bajo, a las aplicaciones de compuestos de Cu como fungicida (^{Maldonado et al., 2007}; ^{Molano, 2015}).

Sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS) y Kenworthy

Mediante el análisis DRIS se obtuvo una relación e interpretación de las concentraciones nutrimentales en las hojas de aguacate. De acuerdo a los datos del Cuadro 3, en los tres tratamientos hubo la misma tendencia en concentración y requerimiento nutrimental, siendo el fósforo el nutrimento de mayor requerimiento seguido del calcio, debido a que ambos se encuentran en niveles muy deficientes en la planta, contrario a lo reportado por ^{Maldonado et al. (2007)} con índices de balance Kenworthy, donde la concentración de calcio y fósforo fueron elevados en las hojas. Por su parte, el nitrógeno, magnesio, boro y manganeso se reportaron como normales, siendo que con DRIS se encontraron como deficientes.

Por su parte el zinc y potasio se determinaron en un nivel de óptimo en DRIS, mientras que lo reportado en los índices Kenworthy indicó que el zinc fue el nutrimento más deficiente en huertas de aguacate en Michoacán (^{Maldonado et al., 2007}).

Esto muestra que, además de ser una huerta con un severo desbalance nutrimental, las deficiencias de calcio no se manifestaron en la sintomatología visual del cultivo durante la toma de muestras. Debido a que la sintomatología por deficiencias de calcio no tiene una ocurrencia inmediata en los tejidos vegetales (^{Kong et al., 2014}), pues el calcio, al ser un elemento estructural manifiesta su ausencia en las hojas nuevas que comienzan con su constitución estructural y que son de baja transpiración, contrario a hojas maduras, las cuales ya culminaron su etapa de crecimiento y tienen una mayor tasa de transpiración (^{White y Broadley, 2003}; ^{Meagy et al., 2013}); sin embargo, la reducción en la concentración de calcio tiene ocurrencia en toda la planta al momento de presentar una deficiencia pero no se manifiesta uniformemente en ella.

Relacionando el análisis de suelo y el foliar, se observa una concordancia con la deficiencia de calcio en el suelo y en la planta; sin embargo, en el caso del fósforo, su contenido en el suelo se reporta alto mientras que en la planta es deficiente y el de mayor requerimiento de acuerdo a los índices DRIS, lo cual se atribuye que el fósforo al ser absorbido por la planta a través de los pelos radicales y la punta de la raíz (^{Fernández, 2007}), que se ve severamente afectado por la deficiencia de calcio que reduce los puntos meristemáticos en la planta debido a su función en la división celular (^{Ge et al., 2007}; Hepler y Winship, 2010; ^{Wei et al., 2015}). Además, se ha observado que el calcio participa como un estimulante en la absorción del fósforo (^{Fernández, 2007}).

Relaciones nutrimentales

Las relaciones nutrimentales significativas para el largo del parénquima en empalizado se presentan en los Cuadros 4 y 5. Las relaciones importantes fueron: N/B, K/B, Ca/B, Mg/B, Fe/B, Zn/B, Cu/B, B/Cu y BxCa. Mientras que para el ancho del tejido fueron: N/B, K/B, Ca/B, Mg/B, Fe/B, Zn/B, Cu/B, B/Cu y BxCa, Como se puede apreciar, la participación del boro, calcio y zinc fueron las más recurrentes, siendo el boro el principal participante. De forma individual el boro reportó una correlación significativa en el largo del parénquima mientras que para el ancho el zinc fue el nutrimento significativo.

Para el largo del parénquima solo las relaciones Zn/B y Cu/B fueron directamente proporcionales, el resto de ellas fueron inversas. De forma similar, para el caso del ancho del parénquima sólo en una relación Cu/B al aumentar incrementa el ancho del tejido, el resto de las relaciones fueron inversas a este parámetro.

El ancho de la pared celular, sólo con hierro reportó una correlación significativa; sin embargo, de forma conjunta se identificó con un nivel aceptable de significancia a: KxFe, Mn/Ca, Fe/Mg, Fe/Mn, ZnxFe, Ca/Mn. Contrario al ancho del parénquima en empalizado, en el ancho de la pared celular solo la relación Mn/Ca fue inversa.

Para el grosor de la hoja se muestran los datos en el Cuadro 5, donde los elementos relacionados: N/B, Fe/B, B/Cu y BxCa fueron representativos, mientras que individualmente no manifestaron significancia, además, B/Cu y BxCa fueron relaciones inversas.

Para el largo del parénquima esponjo + epidermis las relaciones significativas fueron: K/N, NxMg, Zn/N, KxCa, KxFe, K/B, Fe/B, N/Ca y B/Ca. De forma individual el boro, potasio y nitrógeno también representaron un grado importante de significancia sobre la medida del largo del tejido. Por otro lado, el calcio, hierro, zinc y magnesio no fueron significativos individualmente, pero al interactuar con otros nutrientes manifestaron su significancia. Únicamente las relaciones NxMg, N/Ca y B/Ca fueron directamente proporcionales.

Análisis ultraestructural en hojas de aguacate

En el Cuadro 6 se aprecia que el mayor porcentaje de abundancia de calcio detectado fue en las hojas con deficiencia media de calcio, luego las hojas sanas y por último las hojas deficientes, siendo las hojas sanas las de mayor variabilidad y las de mayores porcentajes. La mayor demanda de calcio se encuentra en zonas meristemáticas, de manera que las deficiencias de calcio afectan a las hojas jóvenes que no han concluido su etapa de crecimiento, afectando su estructura, contrario a lo que sucede en hojas maduras (Hepler y Winship, 2010; ^{Wei et al., 2015}).

Las paredes celulares de mayor grosor fueron las presentes en hojas con niveles medios de calcio, luego las hojas deficientes y por último, las hojas sanas que presentaron el menor grosor.

Los cambios en la integridad de las paredes celulares probablemente resultan de las actividades de la celulosa, donde se disminuye la cohesión celular por un desajuste celular y degradación de pectinas (^{Tesfay y Magwaza, 2017}). La ausencia de calcio estimula la expansión celular debido a un incremento en la fluidez de las paredes celulares ocasionado por la desmetilesterificación de pectinas, además, la importancia del calcio también radica en la estabilidad de las pectinas ya que sus propiedades físicas están asociadas a su enlace con el calcio (^{Chebli y Geitmann, 2017}).

La firmeza de pared celular repercute en la calidad postcosecha del aguacate, pues se ha observado que la blandura del fruto se debe a una estructura débil en la pared celular, además de una perdida en la integridad de la membrana, hidrolisis de celulosa y hemicelulosas, así como la despolimerización de pectinas y almidón (^{Tesfay y Magwaza, 2017}).