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P. americana Mill. pertenece a la familia Lauraceae, uno de los grupos de angiospermas más antiguos (Renner, 1999). Se caracteriza por su gran variabilidad y por ser una de las familias del reino vegetal más numerosas, con alrededor de 92 géneros descritos y un número indeterminado de especies que varía de 2 840 a 3 340 que se distribuyen por todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo (Renner, 2004). La productividad del cultivo en esta amplia gama de ambientes depende de un conjunto de factores, algunos más o menos ligados con las características agroambientales de los huertos.
Sin embargo, factores bióticos y abióticos son limitantes para obtener buenos rendimientos y calidad de fruto (Anguiano et al., 2003). La microbiota del suelo, sirve como un bio-indicador de la salud de los ecosistemas y agro ecosistemas, reflejando el efecto de los procesos agrícolas y el manejo de los recursos sobre este componente, afectando tanto su biodiversidad, como la densidad de las poblaciones microbianas (Buckley y Schmidt, 2003; Girvan et al., 2004; Ariena et al., 2006).
El estudio de la macrobiótica del suelo cobra mayor importancia en el complejo marchitez del aguacate debido a que en esta patología pueden estar implicados agentes causales de tipo biótico y abiótico, siendo el Oomycete Phytophthora cinnamomi, el más relevante, el cual puede causar pérdidas económicas considerables (Pérez, 2008; Richter et al., 2011). La enfermedad fue descrita en 1922 por Rands en árboles de canela, se reporta atacando aguacatero por primera vez en EUA en California, se le considera como la enfermedad más importante del aguacate, para la década de los 1980’s se tenía 1 500 ha afectadas (Zentmyer, 1980).
En México, se ha detectado la enfermedad conocida como tristeza del aguacatero en todas las zonas productoras; destacando por la severidad de daños, la región de Atlixco, Puebla, donde ocasionó la desaparición de este cultivo. En la región productora de Michoacán, se considera que alrededor de 4 000 ha están afectadas por la enfermedad, presentando una tendencia exponencial (Téliz, 2000).
En este sentido, es necesario tener amplio conocimiento del comportamiento in vitro de P. cinnamomi y para esto, es necesario partir de medios de cultivos alternativos para acelerar su desarrollo y por ende efectuar evaluaciones rápidas en cuanto a su crecimiento ya que este fitopatógeno es afectado en su desarrollo in vitro por diferentes factores como la temperatura y una opción es generar información de medios de cultivo que aceleren su tasa de crecimiento.
Cabe destacar que a la fecha existe limitada información de medios de cultivo alternativos al PDA y V8 Agar. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la dinámica del crecimiento in vitro de P. cinnamomi en cuatro medios de cultivo alternativos.
Materiales y métodos
Muestreo
En los meses de octubre y noviembre de 2016, se recolectaron muestras de raíces en arboles de aguacate (Persea americana Mill. var. Hass) bajo presión de inóculo que presentaban sintomatología característica de muerte descendente conocida como tristeza del aguacate. El sitio de recolección fue la huerta experimental del Instituto nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) ubicada en San Juan Nuevo Parangaricutiro, Michoacán, cuyas condiciones climáticas semicálidas, subhúmedas con lluvias en verano, oscilan entre los 1 200 a 1 600 mm y temperaturas de 10 a 28 °C (García, 1981). Se realizó un muestreo dirigido cercano al área de goteo a una profundidad de 30 cm en cuatro puntos equidistantes.
Con ayuda de una pala recta se tomaron las muestras de raíz con presencia de daño (tejido necrosado color café obscuro) de 2 a 6 mm de diámetro y se colocaron en bolsas de polietileno previamente rotuladas con los datos de la huerta, municipio, georreferenciación y manejo agronómico (convencional u orgánico), posteriormente se transportaron al laboratorio de fitopatología del departamento de Parasitología Agrícola en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.
Aislamientos de los fitopatógenos
Se lavaron las raíces con agua destilada estéril para fragmentarlas en trozos no mayores a 0.5 cm, con apoyo de un bisturí estéril se realizó un corte longitudinal seleccionando los límites de tejido sano y enfermo, los cortes de raíz se lavaron en solución de hipoclorito de sodio al 3% por un min, seguido de tres lavados con agua destilada estéril y se colocaron en papel absorbente previamente esterilizado. Una vez secas, se sembraron en medio selectivo V8®-PARPH colocando cuatro trozos de raíces en forma horizontal en cajas Petri de 8.5 cm de diámetro; tres cajas por muestra, dando un total de 12 raíces por árbol muestreado y finalmente los aislados se incubaron a 28 °C por tres días en obscuridad total (Fierro, 2011).
Purificación y multiplicación
Se transfirieron a medio de cultivo V8®-Agar cepas con crecimiento característico de P. cinnamomi. La técnica de purificación utilizada fue por punta de hifa por triplicado, colocadas el centro de la caja Petri, fueron selladas con cling wrap y se incubaron a 28 °C en cámara bioclimática durante 72 h en el laboratorio de Fitopatología del Departamento de Parasitología Agrícola.
Identificación morfológica y molecular
Los patógenos obtenidos se identificaron morfológicamente según las claves de Davison y Ribeiro (1996) y molecularmente mediante la técnica PCR-ITS, extrayendo ADN de acuerdo con la metodología de Doyle y Doyle (1990); a partir, de 0.2 g de micelio del cultivo puro con buffer de lisis (EDTA 50 mM, pH 8.5; Tris HCl 100 mM, pH 8; NaCl 50 mM; SDS 2%). La visualización del ADN se realizó en gel de agarosa al 2% teñido con GelRed (GenScript®).
La amplificación de la región ITS se llevó a cabo con los iniciadores ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). De igual manera se visualizó el producto de la reacción por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con GelRed (GenScript®) y el producto del PCR se mandó secuenciar al laboratorio de diagnóstico fitosanitario UA-LAB.
Evaluación de la tasa de crecimiento
Se utilizaron los medios de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), Chícharo-Agar, Centeno-Agar y V8®-Agar. Se seleccionaron tres cepas con crecimiento característico diferente (cameloide, arrosetado y estrellado), posteriormente para cada medio, se sembraron en centro de una caja Petri de 8.5 cm de diámetro explantes de 5 mm de diámetro tomados del margen de un crecimiento vigoroso de una colonia pura de 8 días después de la siembra con cuatro repeticiones, las cajas se sellaron y se incubaron en cámara bioclimática donde crecieron como aislamiento puro a 28 ±2°C en obscuridad total, con ayuda de un vernier digital, se tomaron las lecturas del diámetro se tomaron cada 24 h en cuatro puntos equidistantes hasta que la última repetición llenara la caja.
Análisis estadístico: una vez teniendo las medidas de los diámetros de cada cepa en diferente medio nutritivo, se realizó una regresión lineal mediante modelos lineales generalizados (GLM) para obtener los parámetros de intercepto y pendiente (velocidad de crecimiento), significancia de la regresión y el valor de R2 ajustada. Se efectuó la prueba de homogeneidad de varianza de los errores de los modelos de regresión en cada especie y se contrastaron los coeficientes lineales en función al tiempo, utilizando los valores de la suma de cuadrados de cada regresión mediante una prueba de t (Ott y Longnecker, 2010) empleando las siguientes expresiones:
Donde: b1 y b2 son las pendientes de cada regresión para cada aislamiento; SS1 y SS2 son la suma de cuadrados de cada modelo de regresión de las ecuaciones.
Donde: Sp= es la estimación combinada del error de las dos ecuaciones de regresión con n-2 grados de libertad; SME= cuadrado medio del error experimental.
Los análisis se realizaron utilizando el programa estadístico R 3.4 ®.
Resultados y discusión
Derivado del aislamiento e identificación morfológica y molecular de los fitopatógenos obtenidos de los muestreos realizados en la huerta experimental bajo presión de inóculo, se lograron obtener diferentes cepas de la misma especie coincidiendo con las claves de identificación de Davison y Ribeiro (1996) para P. cinnamomi, confirmando lo antes mencionado al comparar los productos de la secuenciación con los registros de la base de datos del GenBank (Cuadro 1).
Cuadro 1 Caracterización molecular de los aislamientos de las secuencias reportadas en el banco de genes con las secuencias intergénicas (ITS) de los genes rDNA.
| Cepa1 | Núm. de acceso2 | Especie | Similaridad3 | Origen4 |
| Pc-33 | LN846114.1 | Phytophthora cinnamomi | 99% | Islas Canarias |
| Pc-41 | LN846114.1 | Phytophthora cinnamomi | 99% | Islas Canarias |
| Pc-42 | KP183223.1 | Phytophthora cinnamomi | 99% | Australia B |
1= nomenclatura para los diferentes aislamientos; 2= número de acceso en la base de datos del NCBI (National Center of Biotechnology Information); 3= índice de similitud entre las secuencias de las especies aisladas y las especies comparadas. 4= origen geográfico de los aislados.
Respecto a la evaluación temporal del crecimiento de P. cinnamomi en diferentes medios de cultivo (Figura 1), se observó que las cepas en los diferentes medios (Cuadro 2), todas tienden a justarse a una curva de crecimiento lineal, dado a que en las regresiones sus R2 ajustadas son superiores a 0.94, siendo todas altamente significativas (α= 0.05).
Figura 1 Morfología de crecimiento en los diferentes medios de cultivo en donde A= PDA; B= chicharo-Agar; C= V8®-Agar; y D= centeno-Agar.
Cuadro 2 Tasa de crecimiento en cm h de los medios evaluados.
| Medio | Tratamiento | Intercepto | Parámetro | p-valorb | R2 aj. |
| V8 | Pc-33 | 0.952 | 0.041142 | < 2.2e-16 | 0.985 |
| Pc-41 | 0.411 | 0.038884 | < 2.2e-16 | 0.985 | |
| Pc-42 | 0.642 | 0.050434 | < 2.2e-16 | 0.958 | |
| Centeno | Pc-33 | 0.731 | 0.067878 | < 2.2e-16 | 0.976 |
| Pc-41 | 0.27 | 0.070667 | < 2.2e-16 | 0.949 | |
| Pc-42 | 0.585 | 0.069160 | < 2.2e-16 | 0.978 | |
| Chícharo | Pc-33 | 1.02 | 0.067108 | < 2.2e-16 | 0.959 |
| Pc-41 | 1.028 | 0.065788 | < 2.2e-16 | 0.967 | |
| Pc-42 | 1.052 | 0.068528 | < 2.2e-16 | 0.944 | |
| PDA | Pc-33 | 0.04 | 0.039919 | < 2.2e-16 | 0.967 |
| Pc-41 | 0.04 | 0.037524 | < 2.2e-16 | 0.979 | |
| Pc-42 | 0.0519 | 0.038151 | < 2.2e-16 | 0.973 |
b= p valores <0.05 son altamente significativas; aj.= ajustada
El medio nutritivo en donde se registraron las tasas de crecimiento más bajas fue PDA, con una media de 0.0385, siendo Pc-41 la de menor registro respecto a las demás, seguido del medio V8 con una media de 0.0434, por otra parte, los mayores valores se presentaron en centeno y chícharo con medias de 0.0671 y 0.0692 respectivamente, siendo en este último donde se registró el valor máximo en la cepa Pc-41 siendo 0.03314 cm mayor con una razón de 1.8832, reporta un crecimiento de 4.5 cm en 120 h del mismo patógeno, coincidiendo ampliamente con nuestros resultados; sin embargo, estimando el crecimiento de las cepas evaluadas en este estudio la velocidad media fue de 4.5 cm en 85 h.
Al comparar las cepas con los diferentes medios se determinó diferencia estadística entre ellos, para el caso de la cepa Pc-33, las diferencias se encuentran entre los medios chícharo-PDA y centeno-V8, Por otra parte al contrastar Pc-33 con Pc-41 los medios significativos fueron PDA-Chícharo y PDA-Centeno, mismo resultado comparándolo con la cepa Pc-42, esto dado a que PDA presenta las tasas más bajas (Cuadro 3), contrario a lo reportado por Rodríguez et al. (2003) quienes registran valores alto de crecimiento, tomando en cuenta la misma medición de mm d-1 para el oomiceto P. cinnamomi.
Cuadro 3 Valores t student producto de las comparaciones múltiples de la estandarización de las tasas de crecimiento (cm h-1) de diferentes cepas de P. cinnamomi en diferentes medios nutritivos.
| Pc-33 | Pc-41 | Pc-42 | |||||||||||
| M1 | M2 | M3 | M4 | M1 | M2 | M3 | M4 | M1 | M2 | M3 | M4 | ||
| Pc-33 | M1 | - | |||||||||||
| M2 | 0.044 | - | |||||||||||
| M3 | 2.041 | 4.693* | - | ||||||||||
| M4 | 4.249* | 1.803 | -0.118 | - | |||||||||
| Pc-41 | M1 | -0.102 | -0.166 | -1.621 | -1.245 | - | |||||||
| M2 | 0.133 | 0.084 | -12.982** | -1.896 | 0.094 | - | |||||||
| M3 | 4.74* | 2.142 | 0.237 | 1.997 | 1.451 | 1.831 | - | ||||||
| M4 | 4.696* | 1.732 | 0.084 | 0.299 | 1.137 | 1.769 | -0.184 | - | |||||
| Pc-42 | M1 | -0.32 | -0.116 | -2.101 | -3.87* | 0.055 | -0.207 | -4.372* | -6.033* | - | |||
| M2 | -0.026 | -0.081 | -1.79 | -1.29 | 0.172 | -0.143 | -1.516 | 1.346 | 0.0258 | - | |||
| M3 | 3.786* | 2.24 | 0.19 | 0.682 | 1.461 | 2.414 | -0.162 | 0.088 | 3.646* | 1.533 | - | ||
| M4 | 0.963 | 2.817 | -1.157 | -0.617 | 1.194 | 1.343 | -0.9 | -0.717 | 1.025 | 1.408 | -0.899 | - | |
Medios de cultivo: M1= centeno; M2= chícharo; M3= PDA; M4= V8; **, *= valores estadísticamente diferentes con un α= 0.05 y 0.1 respectivamente.
Respecto a la cepa Pc-41, la tasa de crecimiento es indistinto en el medio sembrado dado a que no existe diferencia en función al medio nutritivo, sin embargo, en contraste con Pc-42, el crecimiento es más acelerado en centeno. Es importante destacar, que pese a lo antes mencionado el medio de cultivo si influye en el crecimiento de estructuras reproductivas. Por último, Pc-42 muestra significancia en los medios centeno y PDA siendo el valor en centeno 1.8x más grande respecto a PDA.
Con base a los resultados del Cuadro 2 y las comparaciones del Cuadro 3, los medios centeno y chícharo son medios viables y alternativos para el medio PDA ampliamente utilizado por su mayor tasa de crecimiento y por su parte Cedeño et al. (2008) sugiere determinar medios alternativos para cada patógeno debido a los rangos de crecimiento altamente significativos.
Conclusiones
De acuerdo con los resultados obtenidos, el medio de cultivo Centeno-agar fue el más eficiente para el aislamiento y proliferación de Phytophthora cinnamomi obteniendo un mayor crecimiento de estructuras morfológicas. La información generada ayudará a futuras investigaciones para el rápido aislamiento y formación de estructuras de Phytophthora cinnamomi.
