El nogal negro americano (Juglans nigra L.; Juglandaceae), nativo de Norteamérica (^{Michler et al., 2007}) se cultiva ampliamente en Europa (^{Šálek y Hejcmanová, 2011}), Sudamérica y Asia oriental (^{Fisher et al., 2013}), y es valorado por las características nutritivas y contenido de antioxidantes de su nuez, y por su madera (^{Gilman y Watson, 1993}; ^{Shifley, 2004}). Entre 1990 y 2001 se observó mortalidad del nogal en varias entidades de los Estados Unidos de América (EE. UU.) y la muerte de árboles se asoció a la presencia del escarabajo Pityophthorus juglandis (Coleoptera: Scolitidae) sobre ramas y troncos y el posterior desarrollo de cancros alrededor de las galerías causadas por una asociación entre éste y el hongo Geosmithia morbida Blackman (^{Fisher et al., 2013}). A partir de 2008 la enfermedad obtuvo el nombre común de enfermedad de miles de cancros (TCD por sus siglas en ingles), debido a la enorme cantidad de cancros que se forman en la corteza de los árboles afectados. Para 2013, TCD se encontró ampliamente distribuida en EE. UU. (^{Fisher et al., 2013}; ^{Wiggins et al., 2014}), y llegó a causar con una severidad de hasta 60% del total de la población y una remoción debido a la muerte descendente de 300 ejemplares en los estados de Washington e Idaho (^{Tiserrat et al., 2011}).

En México, J. nigra se cultiva en los estados de Puebla, Tlaxcala, Estado de México, Oaxaca y Querétaro. En el estado de Coahuila de Zaragoza, los municipios productores de este cultivo son Parras, Zaragoza, Múzquiz, Ramos Arizpe y Saltillo, con una superficie de 1 446 hectáreas y rendimiento promedio de 1.9 t ha^-1. Se ha estimado que las pérdidas del fruto en este estado llegan a ser de hasta 60%, en donde incluso la perdida de árboles ocurre debido a la muerte descendente provocada posiblemente a cancros presentes en ramas. El objetivo de esta investigación fue aislar, identificar y determinar la patogenicidad de los hongos presentes en cancros asociados a la muerte descendente de J. nigra en dos municipios de Coahuila de Zaragoza, México.

En abril y agosto de 2015 se colectaron ramas de 16 árboles de J. nigra con síntomas de muerte descendente (Figura 1) en dos huertos de 15 años de edad localizados en los municipios de Arteaga y Saltillo. El aislamiento de hongos se basó en procedimientos previamente descritos (^{Alvidrez-Villarreal et al., 2012}; ^{Fisher et al., 2013}) con algunas modificaciones. Se extrajeron cancros del tejido interno de ramas, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 3% y se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA), colocando cinco trozos por caja. A partir de las 24 h se transfirieron crecimientos fúngicos a nuevas cajas y de las colonias obtenidas se desarrollaron cepas monospóricas o a partir de puntas de hifa. Las cepas se mantuvieron en activo en PDA y fueron conservadas en agua. Cuatro morfotipos fueron obtenidos y una cepa de cada uno fue seleccionada y utilizada en análisis posteriores. Las cepas se identificaron morfológicamente a nivel de género como Trichothecium, Pestalotia y Alternaria y Rhizoctonia utilizando claves para hongos imperfectos (^{Barnett y Hunter, 2006}).

Figura 1 Síntomas de muerte descendente en Juglans nigra; a) árbol con muerte parcial de ramas; b) vista de lesión superficial en rama verde; y c) cancros internos. 

La identidad a nivel de especie se basó en el análisis de la secuencia de la región ITS-1 a ITS-2 del ADN ribosomal utilizando los iniciadores ITS1 e ITS4 (^{White et al., 1990}). Se obtuvo una secuencia consenso de cada hongo para realizar un análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) en la base de datos del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI). La cepa de Pestalotia mostró relación con seis especies y para determinar su identidad se realizó un análisis filogenético con el método Neighbor-Joining basado en el modelo de dos parámetros de Kimura y la prueba Bootstrap con 1 000 repeticiones.

Las pruebas de patogenicidad se realizaron utilizando plántulas sanas de cuatro meses de edad, desarrolladas a partir de semilla sembrada en suelo estéril contenido en vasos de unicel de medio litro. Cada cepa fue inoculada a cinco plántulas a las que previamente se les realizó una herida en el tallo de 3 mm de longitud con una navaja para bisturí estéril. Sobre la herida se inoculó 1 ml de la suspensión de 1×10⁸ esporas de Trichothecium, Pestalotia y Alternaria, mientras que para Rhizoctonia el inoculó consistió de un explante de 5 mm de diámetro colocado directamente sobre la herida en el tallo.

Las plántulas testigo se inocularon con agua destilada estéril sobre la herida. Realizada la inoculación, la herida se cubrió con plástico para evitar el secado rápido del inóculo y el marchitamiento de las plántulas. El plástico se retiró después de una semana. Los tratamientos fueron distribuidos bajo un diseño completamente al azar en un invernader. Cada siete días durante los 45 días después de la inoculación (ddi) las plántulas fueron observadas y se describió los síntomas que mostraron. La incidencia se registró como el porcentaje de plantas (considerando la planta establecida en cada repetición) con algún tipo de síntoma en relación al testigo. La severidad se determinó con base a una escala visual de cinco valores (1= 0-20%; 2= 21-30%; 3= 31-50%; 4= 51-80% y 5= más de 80% del tallo con lesión) y los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis.

También se analizó la altura de la planta a los 28 ddi debido a que en la evaluación de los 35 ddi las plantas de algunos tratamientos inoculados con hongos ya se encontraban muertas. Las plantas fueron extraídas a los 45 días y se les determinó la longitud, peso fresco y peso seco de raíz, además de aislar hongos a partir de tejido alrededor de las heridas inoculadas para confirmar los postulados de Koch. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza completamente al azar y las comparaciones de medias se realizaron mediante la prueba de Tukey (p≤ 0.05). Los análisis se realizaron con el paquete estadístico Rdata, versión 3.2.3 (^{Ihaka y Gentleman, 1996}).

Las cepas de los morfotipos aislados de cancros fueron identificadas morfológicamente como miembros de los géneros Trichothecium, Pestalotia, Alternaria y Rhizoctonia; mientras que con base al análisis BLAST la identidad de las cepas de Trichothecium y Alternaria corresponden a las especies T. roseum y A. alternata, respectivamente. La cepa de Rhizoctonia mostró elevada relación con R. solani; sin embargo, al verificar el número de núcleos en la cepa analizada se determinó que corresponde a una especie binucleada no determinada del género Rhizoctonia (^{Sneh et al., 1991}). El análisis filogenético de la cepa de Pestalotia mostró más relación con Pestalotiopsis steyaertii (=Neopestalotiopsis steyaertii según ^{Maharachchikumbura et al., 2014}).

Los primeros síntomas aparecieron a los 7 ddi en plántulas inoculadas con T. roseum, P. steyaertii y Rhizoctonia sp., y causaron síntomas al 100% de las plantas a los 7, 14 y 21 ddi, respectivamente. Mientras que A. alternata causó los primeros síntomas a los 14 ddi y a los 28 ddi sólo causó síntomas al 60% de plantas. Las plantas inoculadas con agua se mostraron aparentemente sanas (Figura 2A) durante el experimento, mientras que los hongos inoculados causaron clorosis (Figura 2B), achaparramiento (Figura 2C) y defoliación (Figura 2D) en los primeros 35 ddi. Plántulas inoculadas con T. roseum, P. steyaertii y Rhizoctonia sp. mostraron una pigmentación rojiza en el ápice (Figura 2E). A los 45 días todas las plantas inoculadas con hongos murieron (Figura 2F), siendo T. roseum, P. steyaertii y Rhizoctonia sp., los que causaron la muerte de todas las plantas a los 35 ddi y sólo sobrevivieron las del testigo hasta el final del experimento.

Figura 2 Síntomas en plántulas inoculadas con cepas de hongos aislados de cancros de ramas de J. nigra. A) planta sana (testigo) a 45 días de inoculación; B) amarillamiento a 7 ddi en plántula inoculada con T. roseum; C) reducción en el crecimiento de la plántula inoculada; D) defoliación en plántula inoculada; E) parte apical de plántula con coloración rojiza; y F) plántula muerta inoculada. 

En los tratamientos inoculados con hongos la severidad fue mayor mientras que la altura, longitud, peso fresco y peso seco de la raíz fueron menores, respecto al testigo (Cuadro 1). Los hongos aislados de plantas inoculadas con hongos correspondieron a aquellos inoculados, mientras que de las plantas testigo no fue posible aislar a ninguno de éstos.

Se ha reportado que A. alternata es capaz de causar cancros en manzano (^{Abou Al Fadil et al., 2010}), T. roseum en rosal (^{Sweets et al., 1982}), y especies de Pestalotiopsis en diversas especies de plantas (^{Espinoza et al., 2008}; ^{Patel et al., 2013}), pero no se encontró reportes de alguna especie binucleada de Rhizoctonia asociada a cancros en plantas. Los resultados obtenidos sugieren que estas especies son agentes asociados responsables de la muerte descendente de J. nigra, debido a la capacidad patogénica que causó la presencia de diversos síntomas.