Introducción

Pantoea aglomerans es una bacteria en forma de bacilo Gramnegativa, es considera ubicua de plantas y se ha aislado en diversos ambientes (suelo, agua, insectos, animales y muestras clínicas), algunos aislamientos han demostrado la capacidad de control biológico de hongos y bacterias causantes de enfermedades en plantas (Theo H.M. Smits et al., 2010), se han reportado en rizosfera de Hordeum vulgare, Triticum sp. y Gloxinia alba, son capaces de fijar nitrógeno (^{Jimenez et al., 2007}), degradar hidrocarburos y solo algunas cepas son capaces de producir biosurfactante (BS) (^{Vasileva-Tonkova y Gesheva, 2006}; ^{Gopalakrishnan et al., 2006}). Los BS son moléculas activas de superficies producidas por bacterias, hongos, levaduras, actinomicetos y otros. Todos los BS son anfifílicos, es decir, están compuestos de dos partes una polar (hidrofílica) y otra no polar (hidrofóbica), el grupo hidrofílico consiste de mono-, oligo- o polisacáridos, péptidos o proteínas, y la porción hidrofóbica usualmente contiene ácidos grasos saturados, insaturados, hidroxilados o alcoholes grasos (^{Pacwa-Plociniczak et al., 2011}).

La estructura química de los BS les confiere afinidad por las interfaces en las que destacan la: disminución de la tensión superficial del agua de 72 mN/m a cerca de 27 mN/m, reducir la tensión interfacial y aumentar la solubilidad de algunos compuestos (^{Raiger Iustman et al., 2009}). Estos biosurfactantes poseen amplias ventajas en comparación con los surfactantes químicos, como: alta biodegradabilidad, baja toxicidad, y biocompatibilidad, pueden sintetizarse a partir de fuentes de carbono relativamente baratas o a partir de residuos industriales (^{Raiger Iustman et al., 2009}). Existen reportes de bacterias capaces de producirlos, en los que destacan los géneros de Pseudomonas sp, Bacillus sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Pantoea sp., entre otros (^{Makkar, 2011}). Los BS microbianos tienen amplias aplicaciones en la recuperación de petróleo, en la industria farmacéutica, de alimentos y cosméticos, así también tienen usos potenciales en el sector agrícola y pecuario (^{Pérez-Vargas et al., 2010}; ^{Jiménez et al., 2010}).

En la agricultura está documentada su aplicación para el control biológico por su actividad antimicrobiana y antifúngica y la recuperación de suelos contaminados con plaguicidas o fertilizantes químicos (^{Sachdev y Cameotra, 2013}). En México en la región tropical 35% del territorio nacional se explota para la producción ganadera, esto con la finalidad de cubrir la demanda de alimentos (carne, leche, queso entre otros) por los pobladores, esto ha conllevado a los agricultores a explotar diferentes cultivos de forrajes para obtener alimentos de calidad y cantidad y poder cubrir también las necesidades del ganado, aun así con los esfuerzos puestos en este sector, se suman otras necesidades como son la disminución del contenido de proteínas y la falta de forraje por la estacionalidad de las lluvias que ha disminuido su producción (^{Enriquez et al., 1999}).

De las 34 000 especies de plantas en México la mayoría de ellas son usadas para alimentar el ganado, en el estado de Guerrero se cultiva la especie Panicum máximum o pasto “Tanzania” esta es resistente al pastoreo, crece bien en suelos secos que no sean demasiado pobres en nutrientes de cualquier textura incluso en suelos arenosos (Rodillo- ^{Juárez et al., 2009}; ^{Cerdas y Vallejos, 2011}). Asimismo, la especie Andropogon gaynus Kunth o pasto “Llanero”; es de crecimiento postrado e invasor que le permite hacer buena cobertura del suelo adaptándose fácilmente a suelos arcillosos y arenosos (Pérez, 2008). Se han documentado pocos estudios sobre la interacción de bacterias entre ellas destacan las ácido lácticas (^{Pasebani et al. 2010}), no se encontraron estudios sobre las especies productoras de biosurfactantes en rizosfera y raíz de los pastos Tanzania y Llanero, así como también sobre su papel biológico y aplicación biotecnológica en las actividades pecuarias.

El rancho el Tecomate en Tierra Colorada, Guerrero, se dedican al ganado para la obtención de carne y están interesados en incrementar la producción de pastos para cubrir las necesidades del ganado, sus dos tipos de pastos para alimentar al ganado son el Tanzania y Llanero, en base a lo anterior el objetivo centrar fue; cuantificar las unidades Formadoras de Colonias por gramo (UFC/g) de rizosfera o de raíz asociadas a los pastos Tanzania y Llanero, evaluar su capacidad de producir biosurfactantes e identificar a nivel microbiológico las bacterias con la finalidad de aplicación de estas en un futuro en la producción de pastos para fortalecer la Ganadería en el estado de Guerrero.

El Rancho el “Tecomate” en Tierra Colorada, Guerrero, se ubica en las coordenadas geográficas 17° 08 ́ 50.53 de latitud norte y 99° 37 ́ 36.9 de longitud oeste, con una elevación de 241 msnm, con suelos regosoles, textura areno limoso, clima Aw1 (cálido subhúmedo), y con precipitación pluvial de 1300 mm anuales. En ese sitio se recolectaron 15 muestras de rizosfera y raíz al azar de cada especie de pasto (Tanzania y Llanero), estas fueron depositadas en bolsas de polietileno y transportadas al laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología Ambiental de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro. Las raíces se separaron del suelo, y se removió el exceso primero con agua corriente y se depositaron en NaOCl al 2% durante 15 min, finalmente se enjuagaron en agua destilada estéril. Posteriormente se pesó 1 g de raíz y se macero en 5 mL de solución salina isotónica estéril y se incubó a 30 °C con agitación durante 12 h en caldo Luria Bertani (LB; triptona 10g, extracto de levadura 5g, NaCl 10g a pH 7.0).

Al mismo tiempo se pesó 1g de rizosfera y se realizaron diluciones seriadas de las muestras del macerado de la raíz y de la rizosfera en un rango de 10^-1 a 10^-4, se tomó 100 μl de cada dilución y fueron dispersadas por duplicado en placas de Agar LB, estas se incubaron a 30 °C por 48 h. La carga microbiana fue reportada como UFC/g de raíz o rizosfera. Las bacterias aisladas con el mismo morfotipo se resembraron en Agar sangre para observar su capacidad hemolítica a las 24h, aquellas que presentaron una β-hemolisis se consideraron como posibles productoras de BS (^{Rakeshkumar et al., 2012}). Las bacterias hemolíticas fueron se cultivaron en 50 mL de caldo PPGAS (PPGAS; NH₄Cl₂ 1.07g, KCl 1.5g, Tris- HCl 18.91g, MgSO₄ 0.19g, glucosa 5%, y peptona 1% a pH 7.2), a 30 °C por 72 h en agitación constante, para promover la producción de BS (^{Wild et al., 1997}).

La capacidad de producir BS se confirmó mediante la formación y estabilidad de la espuma, el Índice de Emulsificación usando diésel, petróleo, gasolina y aceite vegetal a las 24 h (IE₂₄) (^{Cooper, D. G. and Goldenberg. B. G. 1987}) y por último el tamaño del halo en la dispersión del aceite (Figura 1), en todos los análisis se incluyó como control positivo a P. aeruginosa PAO1. Las bacterias que fueron capaces de producir biosurfactantes se identificaron a nivel de género y especie usando la tinción de Gram, la producción de catalasa, oxidasa, con bioquímicas convencionales para su evaluación metabólica.

Figura 1 Pruebas para la detección de biosurfactantes. A) hemólisis en agar sangre; B) índice de emulsificación; C) producción de espuma en caldo PPGAS; y D) dispersión de aceite. 

De las muestras aisladas, se obtuvo una carga bacteriana en raíz y rizosfera en el pasto Tanzania de 1 x 10³ a 10 x 10⁴ y en Llanero de 5 x 10³ a 21 x 10⁴ UFC/g respectivamente, lo que concuerda en promedio con ^{Pasebani et al. (2010)}, que reportan 8.3 x 10³ UFC/g en suelo de bacterias ácido lácticas de pasto Tanzania en Malaysia., además se observa que la cantidad de UFC/g es igual en las dos especies de pastos esto puede deberse al mismo tipo de suelo y a las condiciones climatológicas del lugar.

En cuanto a la producción de BS solo 28 (13 Tanzania y 15 Llanero) cepas bacterianas fueron capaces de producir hemolisis en agar sangre, de estás todas hicieron espuma en caldo PPGAS y dispersaron el aceite lo que demuestra la capacidad de producción de BS (Figura 1), solo 13 cepas fueron capaces de emulsificar a las 24 h compuestos hidrófobos. Todas las cepas aisladas de la rizosfera de pastos Tanzania fueron capaces de emulsificar gasolina, aceite vegetal y petróleo a diferencia de las aisladas en pastos Llanero, esto es uno de los primeros reportes de bacterias aisladas de pastos con habilidad de emulsificar compuestos hidrófobos y que se pueden emplear para procesos de biorremediación (Cuadro 1). Los datos obtenidos en este trabajo concuerdan con ^{Vasileva- Tonkova y Victoria Gesheva (2006)} donde describen una cepa de Pantoea sp., A-13 aislada de suelos de las islas, Dewart, Antartida, ^{Gopalakrishnan et al. (2006)}, reportan dos cepas de Pantoea sp., 1 y 2 productoras de BS aisladas de la costa de la India capaces de emulsificar compuestos hidrófobos.

Cuadro 1 Índice de emulsificación a las 24 h (IE₂₄) de las cepas aisladas de la rizosfera de los pastos Tanzania y Llanero del Rancho el Tecomate. 

^{Toribio-Jiménez et al. (2014)}, reportan una cepa de Pantoea vagans productora de BS resistente a metales pesados aislada de los jales El Fraile en México, todas estas cepas se han propuestos como alternativas para acelerar procesos de biorremediación, pero no se han evaluado su capacidad de promoción de crecimiento vegetal. Reportamos trece cepas de P. agglomerans con 99% de identidad, como ya se dijo las especies de Pantoea sp., se han reportado como endófitos de diversos cultivos, en los que destaca Pantoea ananatis aislada de hojas y semillas de Panicum virgatum conocido como pasto “Varilla” en Canadá por ^{Gagne-Bourgue et al. (2013)}, confirmando así la transmisión vertical a la siguiente generación de hospederos, lo anterior concuerda con nuestros hallazgos dado que solo se identificó una especie como mejor productora de BS en la rizosfera de los pastos Tanzania y en Llanero.

En cuanto al IE₂₄ todas las cepas fueron capaces de emulsificar prioritariamente el aceite vegetal, diésel, gasolina y petróleo respectivamente, destacando entre ellas las cepas M1C6 y la M3C1 aislada de los pastos Tanzania, estos datos son concordantes con los descritos en Pseudomonas aeruginosa aisladas de superficies hospitalarias (^{Toribio-Jiménez et al., 2015}). ^{Jacobucci et al. (2009)} describen una cepa de P. agglomeras aislada de suelos contaminado con aceite capaz de crecer y producir BS empleando keroseno como única fuente de carbono, lo que la proponen como candidata para biorremediar sitios contaminados con hidrocarburos, es posible que las cepas aisladas en este estudio sean capaces de crecer en hidrocarburos como única fuente de carbono también por su habilidad mostrada en la emulsificación. Se ha descrito que el BS producido por Pantoea sp., es de tipo glicolipido (Dewart et al., 2006; ^{Gomes de Almeida et al., 2015}), por lo que presumiblemente el BS producido por las cepas nativa sean del tipo glicolipidos. Aunado a la producción de BS por cepas de Pantoea sp., es importante destacar el ahondar en su estudio como potencial en la promoción de crecimiento vegetal ya que muchas son capaces de solubilizar fosfatos, fijar nitrógeno y producir fitohormonas con la finalidad de favorecer la producción y control biológico de forrajes para la industria pecuaria en México.

Conclusión

Se reporta por primera vez trece cepas Pantoea agglomerans capaz de producir biosurfactante asociada a la rizosfera de los pastos Tanzania y Llanero en el rancho “Tecomate” dedicado principalmente a los sistemas de producción de animales en pastoreo en el estado de Guerrero, entre las cepas se destacan a la M1C6 y la M3C1, estos datos reflejan el pobre estudio que hay de la búsqueda de bacterias productoras de BS en pastos, y sobre la ecología microbiana de la rizosfera en los pastos, por lo que es importante aislar e identificar en las bacterias el biosurfactante y su papel biológico sobre la producción de pastos o forrajes como una alternativa en el sector pecuario en el estado de Guerrero.