Producción de planta madre

El trabajo se realizó en el vivero del Postgrado en Ciencias Forestales, Campus Montecillo, del Colegio de Postgraduados (Colpos), ubicado en las coordenadas 19°27’38.25” N y 98°54’23.91” O, a 2240 m s.n.m., en el municipio de Texcoco, Estado de México, México. En el ensayo se utilizó germoplasma del huerto semillero de primera generación de Pinus patula establecido en la reserva forestal multifuncional “El Manantial” (19°43’11.9” N y 97°59’21.3” O, a 2930 m s.n.m.) en el municipio de Aquixtla, Puebla, México (^{Castaños-Martínez y Castro-Zavala, 2014}).

Todas las plantas madre se produjeron en macetas individuales de 4 L de capacidad, en un sustrato con 40% de mezcla base (15% turba, 15% vermiculita y 10% perlita) y 60% de corteza de pino composteada. A los seis meses de edad se realizó una poda apical, con el fin de estimular la formación de brotes laterales y convertir las plantas en setos, de acuerdo con los procedimientos descritos en estudios previos (^{Mitchell et al., 2004a}; ^{Rivera-Rodríguez et al., 2016}). El corte se hizo a una altura de 15 cm de la base del tallo.

Se utilizaron cinco lotes de 30 plantas madre cada uno, con diferentes condiciones de manejo y crecimiento (Tabla 1). Tres de esos lotes corresponden a plantas madre de 18 meses que crecieron en condiciones de invernadero (20.7 °C ± 2.9 °C de temperatura; 72.7% ± 8.1% HR), se regaron con agua destilada a saturación dos veces por semana, y se les aplicó fertilizante Osmocote (15-9-12 de N-P-K y ocho meses de liberación) en dosis de 3 g L^-1 (M₁), 5 g L^-1 (M₂), y 7 g L^-1 (M₃) (Tabla 1). Los otros dos lotes corresponden a plantas de 18 meses (M₄) y 15 meses (M₅) de edad que se mantuvieron en invernadero los primeros 12 meses y posteriormente en un ambiente de crecimiento con malla sombra a 50% (16.2 °C ± 2.7 °C; 67.9% ± 10.7% HR), se fertilizaron con 7 g L^-1 de fertilizante Osmocote y se regaron con agua destilada a saturación dos veces por semana, excepto durante la época de lluvias, en la que solo se regó cuando hubo periodos de más de tres días sin lluvia (Tabla 1). Los lotes de plantas tenían una altura promedio de 23 cm y un diámetro medio de 19 mm en la base del tallo.

Producción de brotes

Después de la poda apical realizada a los seis meses de edad, las plantas de los lotes M₁-M₄ recibieron dos podas adicionales, la primera a los 10 meses y la segunda a los 14 meses de edad, mientras que las plantas del lote M₅ recibieron una poda adicional a los 11 meses (Tabla 1). Con el fin de favorecer la homogeneidad en el desarrollo de los brotes, en la segunda poda se dejaron solo cuatro ramas laterales en todas las plantas y en la poda siguiente (lotes M₁-M₄) se eliminaron los rebrotes débiles, dejando máximo cuatro por rama. Las estacas utilizadas para el ensayo de enraizado se cosecharon cuatro meses después de la última poda, aplicada a los 14 meses de edad en los lotes M₁-M₄ y a los 11 meses en el grupo M₅.

Establecimiento del ensayo de enraizado

Las estacas para enraizar se seleccionaron considerando solo rebrotes del tallo principal y ramas primarias de los setos, con una longitud de 7 cm a 9 cm al momento del corte, con presencia de hojas primarias y en menor cantidad hojas secundarias. Además, se buscó que tuvieran una coloración verde claro y yema terminal inmadura. El día previo a la cosecha y al momento del corte se aplicó fungicida (Tecto 60, 1.5 g L^-1) por aspersión a los brotes, para prevenir riesgos de contaminación e infección por hongos, con base en las recomendaciones de ^{Zabala-Sánchez et al. (2008)}. Además, cada estaca cosechada se remojó durante 15 minutos en una solución de agua destilada y fungicida (Captán 1.5 g L^-1) y se eliminaron las acículas de los primeros 3 cm de la parte basal del tallo. En esta zona del tallo se aplicaron los tratamientos correspondientes de ácido indol-3-butírico (AIB) que se describen en la siguiente sección.

En el ensayo se utilizaron contenedores individuales de plástico con capacidad de 220 ml, con una mezcla de aserrín-corteza (90:10, vol.). El día previo a la colocación de las estacas, el sustrato se regó con agua destilada a saturación y después de drenar el exceso de agua se aplicaron 50 mL de fungicida (Tecto 60, 1.5 g L^-1) e insecticida (Confidor 1.5 g L^-1) por aspersión en cada contenedor, para asegurar la mayor asepsia posible.

Las estacas, con su respectivo tratamiento de AIB, se introdujeron 3 cm en el sustrato; para reducir la transpiración y evitar la pérdida de agua de las estacas (^{Hartmann et al. 2002}), los contenedores se colocaron en rejillas de plástico (25 contenedores en cada una), dentro de una bolsa de plástico transparente, formando microinvernaderos con humedad relativa cercana a saturación. Durante el periodo de enraizado los contenedores se regaron con 40 mL de agua destilada cada 15 días. Al momento del riego se lavó la bolsa y se aplicó nuevamente fungicida e insecticida por aspersión, con el fin de evitar la presencia de plagas y enfermedades.

Tratamientos evaluados y diseño experimental

Se usó un ensayo factorial 5 × 5 (25 tratamientos) en un diseño de parcelas divididas en bloques al azar. El factor A (“manejo de planta madre”) estuvo constituido por los cinco lotes de planta madre descritos en la sección previa (Tabla 1) y el factor B (“aplicación de AIB”), por cinco tratamientos de 5000 mg L^-1 de AIB, que difieren en el tipo de producto y el tiempo de inmersión de la estaca. En dos de ellos (T1 y T4) se utilizó el producto comercial Radix® (Intercontinental Import Export) en polvo para preparar una pasta, disolviendo 5 g de Radix® 10000 en 10 mL de etanol al 50%; T1 con 10 s de inmersión y T4 con 10 s de inmersión + lavado con agua destilada. En otros dos tratamientos (T2 y T3) se usó una solución líquida de AIB grado reactivo (Sigma®), con 10 s y 20 s de inmersión, respectivamente; además, se incluyó un testigo (T0) sin AIB. El factor “manejo de planta madre” se asignó a las parcelas grandes y el factor “aplicación de AIB” a las parcelas pequeñas.

Debido a limitaciones en la disponibilidad de estacas en las plantas madre al momento de la cosecha (30 plantas madre por lote, con una producción de 2 a 3 estacas útiles por planta), de los lotes M₁, M₃ y M₅ se utilizaron 50 estacas (suficientes para establecer dos repeticiones por tratamiento de AIB) y de los lotes M₂ y M₄ se utilizaron 75 estacas (suficientes para tres repeticiones por tratamiento de AIB), con un total de 300 estacas en el ensayo. La unidad experimental estuvo integrada por cinco estacas, con los bloques anidados dentro del factor “manejo de planta madre”.

Variables respuesta

La evaluación se realizó a las 14 semanas de establecido el ensayo, extrayendo del sustrato cada una de las estacas vivas y verificando la existencia de callo y/o raíces adventicias; debido a que la formación de raíces es una etapa más avanzada que la presencia de callo (^{Guan et al., 2015}), las estacas que presentaron raíces no se incluyeron en las que formaron callo. La estaca se consideró muerta cuando más de 50% de su tallo estaba necrosado. A partir de esta evaluación se obtuvo, para cada unidad experimental, el porcentaje de estacas vivas, con presencia de callo y con raíces adventicias. Se consideró como estaca enraizada cuando esta tenía una o más raíces con al menos 1 mm de largo, criterio que se ha utilizado en otros estudios similares (^{Rivera-Rodríguez et al., 2016}) cuando el propósito fundamental es evaluar la capacidad de formación de raíces adventicias en un tiempo determinado. En las estacas que formaron raíces se contó el número de raíces primarias (RP), la longitud de la raíz más larga (LRL), la longitud promedio de raíces primarias (LPR) y el porcentaje de estacas enraizadas con presencia de raíces secundarias (RS).

Análisis de datos

Con los valores promedio por unidad experimental de las variables respuesta se realizó el análisis estadístico utilizando el procedimiento Mixed en el paquete estadístico SAS (Statistical Analysis System) © versión 9.4. (^{SAS, 2013}). Para ello, las variables expresadas en porcentaje fueron transformadas con la función arcoseno de la raíz cuadrada del valor original expresado en fracción decimal, debido a que los datos en la escala original no cumplían con la normalidad y homogeneidad de varianza. En las variables RP, LRL y LPR se usó la raíz cuadrada del valor original. Después del análisis, los valores promedio por tratamiento fueron retransformados a las unidades originales. El modelo de análisis de varianza utilizado fue el siguiente:

Donde:

Y_ijk= valor de la variable observada en la ijk -ésima unidad experimental

µ = media general

M_i = efecto fijo del i-ésimo manejo de planta madre

B_j(M_i) = efecto aleatorio del j-ésimo bloque anidado dentro del i-ésimo manejo (error de parcela grande)

T_k = efecto fijo del k-ésimo tratamiento de AIB

M_iT_j =efecto fijo de la interacción del i-ésimo manejo de planta madre con el k-ésimo tratamiento de AIB

ɛ_ijk = error experimental

En las variables donde existieron diferencias significativas se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey (P = 0.05) para determinar diferencias estadísticas entre los niveles de los factores en estudio

Efecto del manejo de planta

Aunque el manejo de la planta madre no afectó el porcentaje de estacas que formaron callo, sí influyó en la capacidad de enraizado. El mayor porcentaje de enraizado se presentó en las estacas de las plantas madre producidas en invernadero, con valores promedio de 24.8% (M₃) a 37.5% (M₁); mientras que el enraizado en las estacas de las plantas madre bajo malla sombra fue igual o menor a 10% (Tabla 3). El mismo patrón se observa en relación con la supervivencia. Las estacas de las plantas madre producidas en invernadero (M₁, M₂ y M₃) presentaron mayor porcentaje de supervivencia (> 92%) que las obtenidas de las plantas bajo malla sombra (M₄ y M₅), con una supervivencia cercana a 65% (Tabla 3).

^{Nelson (2003)} señala que los setos de plantas madre pueden ser cultivados en contenedores dentro de invernadero o bajo malla sombra, dependiendo de las condiciones ambientales locales. Sin embargo, en el caso de Pinus patula, las plantas madre mantenidas bajo malla sombra (M₄ y M₅) obtuvieron valores inferiores a los de las plantas madre mantenidas en invernadero. Por otro lado, ^{Hernández y Rubilar (2012)} indican que la fertilización en la planta madre tiene un efecto positivo en la inducción de raíces adventicias en estacas de Pinus radiata D. Don. ^{Kanmegne et al., (2017)}, ^{Martínez-Alonso et al. (2012)}, y ^{Rowe et al., (2002)} mencionan que la fertilización en la planta madre se correlaciona con el porcentaje de enraizamiento. Dosis de 1 g de nitrógeno por planta, aplicada cada dos meses, favorece más el enraizamiento en Cola anomala K. Schum, que una fertilización con 5 g por planta (^{Kanmegne et al., 2017}). En Pinus taeda L. se encontró que el número de raíces por estaca aumenta conforme se incrementa la cantidad de nitrógeno aplicada diariamente en el sistema de riego, hasta una concentración máxima de 70 mg L^-1 (^{Rowe et al., 2002}). Sin embargo, en este estudio el porcentaje de enraizado más alto (> 35.0%) se obtuvo con una dosis baja y media de fertilización nitrogenada (3 g L^-1 y 5 g L^-1 de Osmocote 15-9-12 de N-P-K).

Diversos estudios (^{Pierik et al., 1997}; ^{Mitchell et al., 2004a}; ^{Amri 2010}; ^{Rivera-Rodríguez et al., 2016}) muestran que la capacidad de enraizado de las estacas disminuye a medida que la madurez ontogénica de la planta aumenta, como consecuencia de la menor división celular en tejidos maduros. En Pinus patula se menciona que la fase óptima para el enraizado son los dos primeros años de edad (^{Mitchell et al., 2004b}). En este estudio se utilizaron plantas madre de 15 meses y 18 meses de edad, pero las diferencias encontradas en la capacidad de enraizado entre ellas se deben más bien a las diferencias en el manejo de las plantas (estado fisiológico asociado a la dosis de fertilización y condiciones de crecimiento), que a la edad de la planta madre (^{Mitchell et al., 2004a}; ^{Rivera-Rodríguez et al., 2016}). ^{Nelson (2003)} indica que realizar podas continuas y mantener la planta madre a menos de 30 cm de altura aumenta la capacidad de enraizado de estacas; esto se puede atribuir a efectos de topófisis, ya que se ha demostrado que las partes basales e internas de la planta son menos maduras que partes externas y altas (^{Osterc et al., 2009}; ^{Osterc y Stampar, 2011}).

Efecto del ácido indol-3-butírico (AIB)

La inmersión de la base de la estaca en una solución de 5000 mg L^-1 de AIB por 10 s o por 20 s (T₂ y T₃) ocasionó un mayor porcentaje de enraizado (> 25%), dos a tres veces más que el tratamiento sin aplicación de AIB (T₀) (Tabla 4). El uso de AIB en forma de pasta, a partir del producto comercial Radix® 10000, fue menos efectivo para promover la formación de raíces (Tabla 4). Además, la aplicación de AIB en forma de pasta y sin lavado posterior (T₁) aumentó la mortalidad de las estacas e inhibió la formación de callo, mientras que el lavado de la pasta (T₄) y el uso de AIB en solución líquida favorecieron la supervivencia y la formación de callo en las estacas (Tabla 4). Estos resultados coinciden con lo señalado por ^{Rivera-Rodríguez et al. (2016)}, quienes mencionan que la aplicación de 5000 mg L-¹ de AIB en estacas de planta de 24 meses de edad de Pinus patula favorece el enraizamiento. Sin embargo, en ese trabajo no se comparó la fuente de AIB ni la forma de aplicación. Los resultados de este trabajo muestran que la aplicación de AIB puro en solución líquida y por un tiempo breve de inmersión es más efectiva que la aplicación en forma de pasta.

La aplicación de AIB en solución líquida también ocasionó el mayor número promedio de raíces primarias por estaca con diferencias significativas con respecto al testigo (Tabla 4). Estos resultados muestran que la aplicación de AIB en la dosis adecuada y tiempo óptimo de aplicación tiene un efecto importante en estacas de especies que enraízan con dificultad, como las coníferas (^{Cuevas-Cruz et al., 2015}; ^{Hartmann et al., 2002}; ^{Pop et al., 2011}). Los resultados muestran que una inmersión de la estaca por 10 s a 20 s en la solución de AIB es favorable para el desarrollo de raíces en Pinus patula, pero se requiere evaluar el efecto de una inmersión más prolongada. Sin embargo, ^{Pop et al. (2011)} indican que la presencia de auxinas en la estaca después de 96 h generalmente inhibe la formación de meristemos, los cuales se convierten en primordios de raíz y posteriormente, durante la fase de desdiferenciación, en raíces.

^{Hunt et al. (2011)} indican que la aplicación de AIB en forma de solución con etanol a 95% al momento del corte de la estaca favorece la formación de raíces. ^{Mori et al. (2011)} mencionan que la aplicación de AIB en forma del producto comercial Oxyberon® durante 10 minutos favorece la capacidad de enraizado en Pinus thunbergii Parl.; sin embargo, la aplicación por una hora del producto produce la muerte de la estaca. En Pinus patula la capacidad de enraizado se redujo ligeramente al pasar de 10 s a 20 s de inmersión, aunque las diferencias no fueron significativas. Es importante evaluar un mayor intervalo de tiempo de inmersión a los utilizados en este estudio, para establecer la duración óptima de inmersión.

Efecto de la interacción de factores

La interacción del manejo de la planta madre con aplicación de AIB presentó un efecto significativo en el porcentaje de enraizado y supervivencia de estacas, así como en el número de raíces primarias (RP) (Tabla 2). La mayor respuesta de enraizado de estacas se obtuvo con el tratamiento de 5000 ppm de AIB en solución por 20 segundos (T3) combinado con planta madre de 18 meses de edad con 5 g L^-1 de fertilización en invernadero (M₂), con un 73.8% de estacas enraizadas (Tabla 5). Esta misma combinación de factores mostró el mayor número de raíces primarias (RP), aunque muchas de las combinaciones quedaron en el mismo grupo estadístico.

Algunos autores proponen protocolos de enraizado de estacas con menos de 20 s de inmersión en solución de AIB para especies leñosas, obteniendo valores de entre 68% y 100% de enraizado, que son aceptables para un programa operativo de clonación (^{Araújo-Vieira de Souza et al., 2014}; ^{Hunt et al., 2011}; ^{Rosier et al., 2004}; ^{Wendling et al., 2010}). En tanto, ^{Dumroese et al. (2009)} recomiendan tiempos de inmersión de 3 s a 10 s en soluciones concentradas para especies nativas de Montana, EUA. Sin embargo, los resultados obtenidos en Pinus patula muestran que la efectividad del tiempo de inmersión puede modificarse por el efecto de otros factores, como el manejo de la planta madre.

Las plantas que estuvieron dentro del invernadero (M₁, M₂ y M₃) presentaron los valores más altos en la mayoría de las variables; la poca respuesta de enraizado en las plantas fuera del invernadero (M₄ y M₅) posiblemente es consecuencia de las condiciones variantes en el exterior y por la malla sombra, que ocasionaron diferencias en el estado fisiológico y/o en la fenología y desarrollo de los rebrotes usados como estacas. ^{Hartmann et al. (2002)} enfatizan que la capacidad de enraizado de las estacas depende en gran medida de las condiciones de humedad, luz y temperatura en las que se encuentre la planta madre.

Durante el ensayo se obtuvieron porcentajes relativamente bajos de enraizado cuando se consideró el efecto promedio de los tratamientos en cada factor por separado. Sin embargo, la combinación de los diferentes factores evaluados permitió detectar al menos un tratamiento con más de 70% de enraizado después de 14 semanas. Estos resultados se encuentran por arriba del valor obtenido para esta especie por ^{Rivera-Rodríguez et al. (2016)}, quienes muestran que en Pinus patula de más de 12 meses de edad la aplicación de auxinas en forma de AIB estimuló la formación de raíces, logrando valores máximos de 30%.