Conteo directo de embriones en semillas maduras

Los días 08 de noviembre de 2020 y 21 de abril de 2021 se colectaron frutos de polinización libre, bien desarrollados y con cáscara de color verde. En el caso de las variedades ‘Colimex’ y ‘Lise’, los frutos tuvieron entre 90 a 100 días de desarrollo a partir de la antesis, mientras que los frutos de la variedad ‘Rosenberger’ tuvieron entre 120 y 130 días. Todas las frutas se cortaron entre 5 y 8 mm de profundidad en la zona ecuatorial, y mediante un giro en sentido opuesto de las mitades se partieron en dos y se extrajeron las semillas. Bajo el lente de un microscopio estereoscópico (BA200, Motic®, China), y con ayuda de pinzas de disección y bisturí, se hizo un corte longitudinal en las cubiertas de las semillas y se extrajeron las masas embriogénicas. Los embriones se separaron y se clasificaron arbitrariamente en tres categorías: grandes (más de 5.0 mm), medianos (3.0 a 5.0 mm) y pequeños (menos de 3.0 mm). Para cada semilla, se registró el número y tamaño de los embriones de manera individual. Se analizaron 346 semillas de ‘Colimex’, 276 de ‘Lise’ y 168 de ‘Rosenberger’.

Conteo directo de embriones en semillas inmaduras

Los días 09 y 19 de julio de 2019 y 06 de abril de 2021 se colectaron frutos tiernos, de polinización libre, de aproximadamente 60 días desde la antesis y con 1.6 a 2.4 cm de diámetro ecuatorial para las variedades ‘Colimex’ y ‘Lise’, y el 20 mayo de 2019 y 12 de mayo de 2021, con 70 a 75 días desde la antesis y 2.9 a 3.7 cm de diámetro ecuatorial se colectaron los frutos de la variedad ‘Rosenberger’. Las frutas se partieron en dos, como se mencionó anteriormente, y se extrajeron las semillas inmaduras. Bajo el lente de un microscopio estereoscópico (BA200, Motic®, China), y con ayuda de pinzas de disección y bisturí, se hizo un corte longitudinal en las cubiertas de las semillas y se extrajeron los embriones. Se registró el número de embriones por semilla, así como su estadio de desarrollo morfológico, el cual varió desde globular, corazón, torpedo hasta cotiledonar (^{Andrade-Rodríguez et al., 2004}). Se analizaron de 273 semillas de ‘Colimex’, 190 de ‘Lise’ y 229 de ‘Rosenberger’.

Conteo de plántulas originadas de semillas maduras germinadas in vitro

Los días 27 de agosto de 2019 y 23 de septiembre de 2020 se colectaron frutos de polinización libre, totalmente desarrollados, con color de cáscara verde y de 90 a 110 días de edad contados a partir de la antesis de las variedades ‘Colimex’ y ‘Lise’, y de 120 a 130 días en el caso de la variedad ‘Rosenberger’. Los frutos se desinfectaron superficialmente en laboratorio mediante inmersión durante 15 min en una solución de hipoclorito de sodio al 2.0 %, más 0.5 % de Tween 20. Posteriormente, y en condiciones asépticas, se realizaron tres enjuagues con agua estéril, luego se partieron en dos (como se mencionó anteriormente) y se extrajeron las semillas. Bajo el lente de un microscopio estereoscópico (BA200, Motic®, China), y con ayuda de pinzas de disección y bisturí, se hizo un corte longitudinal en las cubiertas de la semilla y se extrajeron los embriones o masas embriogénicas. Inmediatamente, se sembraron dos semillas por cada tubo de ensaye de 25 × 150 mm. Se usó el medio de cultivo de ^{Murashige y Skoog (1962)}, adicionado con 75 g·L^-1 de sacarosa, pH de 5.7, solidificado con 8.0 g·L^-1 de agar y esterilizado en autoclave a 120 °C y 1.05 kg·cm^-2. Los cultivos se llevaron a un ambiente oscuro a 27 ± 2 °C durante los primeros 12 días y, posteriormente, se expusieron a luz natural (1,000 Lux, medida con un luxómetro 840006, Sper Scientific, Taiwán). A los 24 días se registró el número de plántulas emergidas de cada semilla. Se analizaron 172 semillas de ‘Colimex’, 172 de ‘Lise’ y 148 de ‘Rosenberger’.

Conteo de plántulas originadas de semillas maduras germinadas en sustrato

Para esta metodología, se utilizó parte de las frutas colectadas en el experimento anterior. En rejas de plástico de 60 × 30 cm en la base y 40 cm de altura, se colocó una mezcla preparada con suelo de textura limosa y polvillo de coco. Se trazaron pequeños surcos de 0.5 cm de profundidad y 4.0 cm de separación. Las semillas extraídas el día anterior, se colocaron horizontalmente a 3.0 cm de distancia dentro de los surcos y se cubrieron con una capa de arena. Se aplicó riego suficiente para humedecer el sustrato y se colocó una sombra, construida con palapas de cocotero a 20 cm de altura. Se aplicaron riegos tres veces por semana. A los 35 días, las semillas se extrajeron del sustrato y se les contabilizó el número total de plántulas emergidas, incluidas las plántulas malformadas. Se analizaron 220 semillas de ‘Colimex’, 184 de ‘Lise’ y 224 de ‘Rosenberger’.

Análisis estadístico

De los datos registrados para cada variedad y cada método, se hicieron cuatro grupos o repeticiones. Para calcular los promedios de embriones por semilla se dividió el total de embriones detectados entre el total de semillas observadas o, en su caso, se dividió el número de plántulas emergidas de semillas germinadas entre el total de semillas sembradas in vitro o en sustrato. Para calcular los porcentajes de semillas poliembriónicas se dividió el número de semillas que presentaron dos o más embriones, o dos o más plántulas, entre el total de semillas observadas y se multiplicó por 100. Los valores en porcentaje se transformaron a valores de arco seno mediante la ecuación: y = (arc sen (√(x/100) × 57.3). Se determinaron las frecuencias de semillas que presentaron los distintos números de embriones detectados. El análisis estadístico se hizo mediante un arreglo factorial 4 × 3 con cuatro repeticiones y un mínimo de 43 semillas como unidad experimental. Las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Se usó el paquete estadístico Statistix ver. 9 (2008).

Conteo directo de embriones en semillas maduras

En los tres genotipos estudiados, se detectaron semillas monoembriónicas y poliembriónicas en un mismo fruto. En el interior de las semillas poliembriónicas se encontraron masas de embriones compactados y, en ocasiones, entrelazados (Figura 1a), aunque su separación fue relativamente sencilla, lo cual facilitó su conteo.

Figura 1 a) Masa embriogénica extraída de semilla madura, b) embriones en estado cotiledonar observados en semilla inmadura, c) plántulas originadas de semillas maduras germinadas en sustrato y d) plántulas originadas de semillas maduras germinadas in vitro. 

En las semillas poliembriónicas de las variedades ‘Colimex’ y ‘Lise’ se encontraron embriones de distinto tamaño en la misma semilla. Generalmente, los embriones más pequeños se observaron en la punta micropilar, aunque también se detectaron embriones pequeños encerrados entre los cotiledones de un embrión de mayor tamaño, o entre otros embriones más grandes. Las semillas poliembriónicas de ‘Lise’ y ‘Colimex’ tuvieron uno o dos embriones grandes, en proporciones de 44.12 y 45.16 %, respectivamente, con respecto al total de embriones registrados; de estas semillas, 26.17 y 25.53 %, respectivamente, fueron de tamaño medio, y 29.70 y 29.30 %, respectivamente, de tamaño pequeño. Lo anterior indica que los embriones nucelares tienen desarrollo asincrónico dentro de las semillas, lo cual coincide con lo reportado por ^{Sánchez-Damas et al. (2006)}, quienes observaron lo mismo en tres portainjertos de cítricos, y ^{Kashyap et al. (2018)} lo detectaron en mandarina ‘Khasi’ (C. reticulata).

El número de embriones fue variable aun entre las semillas del mismo fruto. Se obtuvieron rangos de 1 a 10 embriones por semilla en ‘Lise’, y de 1 a 13 en ‘Colimex’, lo cual guarda cierta coincidencia con lo señalado por ^{Kashyap et al. (2018)} en mandarina ‘Khasi’. En el limón ‘Rosenberger’, la mayoría de las semillas tuvieron solo un embrión, aunque se detectaron algunas semillas con dos o hasta tres embriones. En las semillas poliembriónicas de esta variedad, los embriones grandes correspondieron al 60.46 %, los medianos al 11.63 % y los pequeños al 27.90 % del total de embriones observados.

Conteo directo de embriones en semillas inmaduras

Las semillas inmaduras en las tres variedades presentaron consistencia blanda, color blanco verdoso y testa ligeramente translúcida sin lignificar. En su interior, las semillas presentaron un tejido de consistencia variable según su estado de desarrollo, donde se encontraban los pequeños embriones (Figura 1b). En un mismo fruto, se pudieron identificar semillas con distintos estados de madurez, lo cual sugiere que las semillas también tienen asincronía en su desarrollo.

Se pudieron observar embriones en estado globular, corazón, torpedo y cotiledonar en una misma semilla. Esto confirma el desarrollo asincrónico de los embriones, mencionado arriba en semillas maduras, y coincide con lo señalado por ^{Kashyap et al. (2018)} en mandarina ‘Khasi’. Con este método se pudieron detectar desde uno hasta seis embriones por semilla en ‘Colimex’, de uno a siete en ‘Lise’ y de uno a cuatro en ‘Rosenberger’.

Conteo de plántulas originadas de semillas germinadas in vitro

En las tres variedades se alcanzó el 100 % de germinación, ya que las semillas fueron favorecidas por el ambiente in vitro. Durante la germinación, las masas embriogénicas se desgranaron, se separaron los embriones y se desarrollaron las plántulas de manera independiente (Figura 1d), lo cual facilitó su conteo. La mayoría de los embriones germinaron y desarrollaron plántulas completas. Visualmente, el tamaño de las plántulas varió en función del tamaño del embrión. Algunos embriones muy pequeños generaron plántulas pequeñas y, en algunos casos, aberrantes. El número de plántulas por semilla varió de uno a diez en ‘Colimex’, de uno a ocho en ‘Lise’ y de uno a tres en ‘Rosenberger’.

Conteo de plántulas originadas de semillas maduras germinadas en sustrato

Con este método se registraron porcentajes de germinación de 90 y 93 % para ‘Colimex’ y ‘Lise’, respectivamente, y de 75 % para ‘Rosenberger’. La mayoría de las semillas que germinaron generaron plántulas completas, con raíz, hipocótilo, epicótilo y dos hojas embrionales o cotiledonales (Figura 1c). El número de plántulas por semilla varió de uno a tres en ‘Colimex’ y ‘Lise’, y de uno a dos en ‘Rosenberger’. Estos valores resultan ser muy bajos si se comparan con los obtenidos con el método CDESM.

Promedio de embriones por semilla

En el Cuadro 1 se presentan los datos del promedio de embriones por semilla de las tres variedades y los cuatro métodos de muestreo. El análisis estadístico detectó efectos significativos (P ≤ 0.01) para métodos de muestreo, variedades y la interacción entre ambos factores. Los métodos CDESM y CPSMGV permitieron obtener los mayores promedios de embriones por semilla, mientras que CPSMGS presentó el promedio más bajo. Las diferencias observadas entre CPSMGV y CPSMGS se pueden deber a que muchos embriones pequeños no pudieron germinar en las condiciones que les proporcionó el sustrato y el ambiente, mientras que en el cultivo in vitro, con medio aséptico y rico en nutrientes, se propició la germinación de más embriones. Por lo tanto, el método CPSMGS puede subestimar el promedio de embriones por semillas, principalmente en las variedades de lima mexicana; por ello, es el menos recomendable para estimar el valor de esta variable.

Otro aspecto interesante es que con el método CDESM se obtuvieron más embriones por semilla que con CDESI. Esto debido a que con CDESI los muestreos se hicieron en semillas en estado temprano de desarrollo, donde el número potencial de embriones en las semillas aún no se ha alcanzado y, en consecuencia, solo se detectaron los que tenían un tamaño visible con el estereoscopio. Por lo tanto, los métodos CDESM y CPSMGV resultaron ser los más adecuados para estimar el promedio de embriones por semilla en las variedades estudiadas.

Las variedades también resultaron diferentes entre sí. ‘Lise’ alcanzó los valores estadísticamente más altos para promedio de embriones por semilla. Esta es una más de las diferencias entre ‘Lise’ y ‘Colimex’, además de otras reportadas por ^{Robles-González et al. (2014)} y ^{Robles-González y Manzanilla-Ramírez (2012)}. Por su parte, ‘Rosenberger’ presentó estadísticamente el menor promedio.

Se detectó interacción de los métodos de muestreo con las variedades (Figura 2a). Aunque las variedades de lima mexicana tuvieron un comportamiento similar en tres métodos estudiados, con CPSMGV se registraron promedios de embriones por semilla estadísticos diferentes. Además, se observó que el promedio de embriones por semilla más alto en ‘Colimex’ se alcanzó con CDESM, seguido de CPSMGV, mientras que ‘Lise’ tuvo una relación invertida entre estos mismos métodos, aunque estadísticamente las dos variedades no fueron diferentes. En ambas variedades, los promedios más bajos se obtuvieron con el método CPSMGS. La variedad ‘Rosenberger’ presentó un comportamiento similar con los cuatro métodos de muestreo evaluados.

Figura 2 Gráficas de interacción entre variedades y métodos de muestreo: a) promedio de embriones por semilla y b) porcentaje de semillas poliembriónicas. CDESI = conteo directo de embriones en semillas inmaduras; CDESM = conteo directo de embriones en semillas maduras; CPSMGV = conteo de plántulas originadas de semillas maduras germinadas in vitro; CPSMGS = conteo de plántulas originadas de semillas maduras germinadas en sustrato 

Porcentaje de semillas poliembriónicas

El análisis estadístico detecto efectos significativos (P ≤ 0.01) en los métodos de muestreo, las variedades y la interacción entre ambos factores para el porcentaje de semillas poliembriónicas. Los métodos CDESM y CPSMGV alcanzaron los valores más altos en esta variable y fueron estadísticamente diferentes a CDESI y CPSMGS (Cuadro 1). Este último método presentó los porcentajes de semillas poliembriónicas más bajos. Como ya se mencionó, la diferencia entre CPSMGV y CPSMGS se puedo deber a que los embriones muy pequeños no tuvieron la capacidad de germinar en el ambiente natural que le proporcionó el método CPSMGS, mientras que con CPSMGV, las semillas lograron germinar y desarrollar plántulas debido a las condiciones óptimas de temperaturas, humedad y medio nutritivo. En el caso del método CDESI, el menor porcentaje de semillas poliembriónicas, comparado con CDESM y CPSMGV, se pudo deber a que en las semillas inmaduras el proceso de formación y desarrollo de embriones nucelares no había terminado.

Es importante señalar que un método para determinar el nivel de poliembrionía no debe subestimar el promedio de embriones por semilla ni el porcentaje de semillas poliembriónicas. De acuerdo con los resultados, CDESM y CPSMGV registraron los mayores promedios para estas variables, y, por lo tanto, se pueden considerar adecuados para determinar los niveles de poliembrionía en las variedades estudiadas.

Las variedades ‘Lise’ y ‘Colimex’ presentaron altos porcentajes de semillas poliembriónicas y resultaron estadísticamente semejantes entre sí. Esto sugiere que, aunque se han señalado diferencias morfológicas y fisiológicas en los árboles de estas variedades (^{Robles-González et al.,2014}; ^{Robles-González & Manzanilla-Ramírez, 2012}), mantienen un mismo nivel de poliembrionía. Por su parte, la variedad ‘Rosenberger’ promedió el porcentaje más bajo de semillas poliembriónicas. Asimismo, en esta variable se detectó interacción entre los factores métodos de muestreo y variedades (Figura 2b). Las variedades de lima mexicana tuvieron comportamiento similar en tres métodos, aunque fueron estadísticamente diferentes con CPSMGV. En ‘Lise’, el porcentaje más alto de semillas poliembriónicas se alcanzó con CPSMGV, mientras que en ‘Colimex’ el valor más alto se obtuvo con CDESM. La variedad ‘Rosenberger’ tuvo un comportamiento similar en los cuatro métodos de muestreo estudiados.

Nivel de poliembrionía

Para analizar el nivel de poliembrionía, se utilizaron solo los datos obtenidos con el método CDESM, ya que fue el que mejor estimó el número de embriones por semilla. Como se puede apreciar en el Cuadro 2, ‘Colimex’ y ‘Lise’, que pertenecen a la especie C. aurantifolia, alcanzaron promedios de embriones por semilla semejantes y relativamente altos. Por su parte, ‘Rosenberger’, de la especie C. limon, promedió valores bajos y resultó estadísticamente diferente (P ≤ 0.01) a las variedades de lima mexicana. Para la variable porcentaje de semillas poliembriónicas, ‘Colimex’ y ‘Lise’ presentaron valores altos y resultaron estadísticamente semejantes entre sí, mientras que ‘Rosenberger’ tuvo el promedio más bajo y resultó estadísticamente diferente (P ≤ 0.01) a las limas mexicanas. El porcentaje registrado para ‘Rosenberger’ coincide con lo observado por ^{Pérez-Tornero y Porras (2008)} en limones tipo italiano.

De acuerdo con ^{Kishore (2014)}, y considerando el nivel de poliembrionía, las especies y variedades se pueden agrupar en tres categorías: 1) ligeramente poliembriónico (≤ 25 %), 2) moderadamente poliembriónico (25-50 %) y 3) altamente poliembriónico (> 50 %). Por lo tanto, si se toman en cuenta los resultados de este estudio, ‘Colimex’ y ‘Lise’ resultaron altamente poliembriónicas (con valores de 80.65 y 78.27 %, respectivamente,), mientas que ‘Rosenberger’ fue ligeramente poliembriónica (18.37 %).

Variación en el número de embriones por semilla

Para esta variable, también se utilizaron los datos obtenidos con el método CDESM. Se encontró que el número de embriones fue muy variable entre las semillas de ‘Colimex’ y ‘Lise’. Esto coincide con ^{Kishore (2014)}, quien señala que el número de embriones nucelares varía entre semillas y entre especies.

Las semillas se agruparon en función de su número de embriones (Cuadro 3), y se generaron los siguientes morfotipos como lo describe ^{Kishore (2014)}: uno (simple), dos (mellizos), tres (trillizos), cuatro (cuatrillizos), cinco (quintillizos), seis (sextillizos), siete (septillizos) y ocho (octillizos) embriones por semilla. Esporádicamente, se observaron semillas con 13 embriones en ‘Colimex’ y 10 embriones en ‘Lise’. Las semillas con dos y tres embriones alcanzaron las frecuencias más altas, pero conforme aumentó el número de embriones por semilla las frecuencias decrecieron. ^{Andrade-Rodríguez et al. (2004)} encontraron una tendencia similar en C. volcameriana. Por su parte, ^{Kishore et al. (2012)} señalan que las semillas con cuatro y tres embriones son las más frecuentes en cítricos apomícticos, independientemente de los genotipos que ellos estudiaron. En el limón ‘Rosenberger’, la diversidad fue mínima, ya que la mayoría de las semillas (81.63 %) tuvieron un solo embrión, una proporción baja de semillas contenía dos embriones y, esporádicamente, se encontraron semillas con tres o cinco embriones.