Artículos científicos

 

Estudio comparativo de tres pruebas para evaluar el comportamiento higiénico en colonias de abejas (Apis mellifera L.)*

 

Comparative study of three assays to evaluate hygienic behavior in honey bee (Apis mellifera L.) colonies

 

Laura G. Espinosa–Montaño** Ernesto Guzmán–Novoa*** Alejandro Sánchez–Albarrán Hugo H. Montaldo Adriana Correa–Benítez**

 

* Este trabajo forma parte de la tesis doctoral del primer autor.

** Departamento de Producción Animal: Abejas, Conejos y Organismos Acuáticos, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

*** Department of Enviromental Biology, University of Guelph, Guelph, ON N1G2W1, Canadá.

Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Carretera Federal Cuernavaca–Cuautla 8534, Jiutepec, 62550, Morelos, México.

Departamento de Genética y Bioestadística, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, 04510, México, D. F.

 

Recibido el 3 de mayo de 2006
Aceptado el 21 de noviembre de 2007.

 

Correspondencia:
Laura G. Espinosa Montaño,
teléfono: 5622–5929,
correo electronico: laugespi@servidor.unam.mx

 

Abstract

The discriminatory capacity, cost and practicality of three assays to measure hygienic behavior in 60 honey bee colonies were compared in a first experiment. Capped worker brood of these colonies were killed with an insect pin (P), frozen in a freezer at –18°C (CC) and with liquid nitrogen at –195°C (CN2). The percentage of brood removed by the bees was recorded 24 h after being killed. Since the P assay showed a low discriminatory capacity, an additional experiment with 50 colonies was performed, reducing the evaluation time to 8 h and verifying the influence of body fluids and odors released by the pin–killed brood. Colonies were significantly more hygienic (P < 0.01) with the P assay (88%) than with the CC (69%) and CN2 (65%) assays. There were significant correlations among assays (r > 0.54, P < 0.01) and between replicates within assays (r > 0.37, P < 0.01). Variation among colonies was greater with the CN2 and CC assays than with the P assay. The P assay was the least expensive and easiest to apply (6.59 pesos, 0.58 dollars per colony), but showed the lowest discriminatory capacity, that could not be enhanced even though the time of evaluation was reduced. This could have been caused by the strong stimulus from odors and haemolymph released from the pinkilled brood. The CN2 and the CC assays showed a high discriminatory capacity, but the former was more expensive (14.80 pesos, 1.31 dollars) and the least practical. The CC assay was the second least expensive (10.15 pesos, 0.90 dollars) and practical. The application of either freeze assays is recommended for screening hygienic behavior in honey bees because of their reliability.

Key words: Apis mellifera L., Hygienic Behavior, Assays, Discriminatory Capacity, Costs, Mexico.

 

Resumen

Se comparó la capacidad discriminatoria, costo y facilidad de aplicación de tres pruebas para medir el comportamiento higiénico en 60 colonias de abejas melíferas en un primer experimento. Las crías operculadas de estas colonias fueron sacrificadas al puncionarlas con un alfiler entomológico (P), y congelarlas en congelador a –18°C (CC) con nitrógeno líquido a –195° C (CN2). Se determinó el porcentaje de crías removidas por las abejas 24 h después de que fueron sacrificadas. Como consecuencia de la poca discriminación entre colonias inicialmente encontrada con la prueba P, se realizó un experimento adicional con 50 colonias, reduciendo el tiempo de lectura a 8 h y se verificó el efecto producido por la emanación de olores y fluidos de las crías sacrificadas. Las colonias fueron significativamente más higiénicas (P < 0.01) con la prueba P (88%), en comparación con la de CC (69%) y CN2 (65%). Se encontraron correlaciones significativas entre pruebas (r > 0.54, P < 0.01) y entre repeticiones dentro de pruebas (r > 0.37, P < 0.01). La variación entre colonias fue mayor con las pruebas CN2 y CC que con la P. La prueba P fue la más económica y práctica de aplicar (6.59 pesos, 0.58 dólares, por colonia), pero mostró menor capacidad discriminatoria, que no se incrementó aun cuando se redujo el tiempo de lectura. Este resultado pudo deberse al fuerte estímulo provocado por olores y hemolinfa emanados de las crías sacrificadas. Las pruebas CN2 y CC mostraron alta capacidad discriminatoria, pero la primera fue más cara (14.80 pesos, 1.31 dólares) y la menos práctica. La prueba CC fue la segunda más económica (10.15 pesos, 0.90 dólares) y práctica. Se recomienda aplicar cualquiera de las pruebas de congelación para medir el comportamiento higiénico de colonias de abejas melíferas por su confiabilidad.

Palabras clave: Apis mellifera L., Comportamiento higiénico, Pruebas, Capacidad discriminatoria–México.

 

Introducción

El comportamiento higiénico se refiere a la capacidad de algunas abejas adultas para detectar, desopercular y remover de las celdas, larvas o pupas enfermas o muertas;¹ por ello, este comportamiento ha sido identificado como uno de los principales mecanismos que confieren resistencia a las abejas melíferas contra parásitos y patógenos.^2,3 Rothenbuhler¹ y Park⁴ demostraron que las abejas retiran crías muertas por Paenibacillus larvae (loque americana), mientras que otros investigadores encontraron que algunas abejas remueven las crías afectadas por Ascosphaera apis (cría de cal),^5–7 y las crías infestadas con el ácaro Varroa destructor,^8–10 lo cual restringe su reproducción y limita su crecimiento poblacional.

Se sabe que la expresión del comportamiento higiénico es variable, lo que se debe, en parte, a la influencia de factores ambientales, entre éstos destacan: edad de las crías removidas,¹¹ abundancia de abejas adultas y crías en las colonias, así como incremento en la cantidad de néctar recolectado por las abejas.^12–14 Otra fuente de variación que influye en la expresión del comportamiento higiénico corresponde a efectos genéticos. La base genética de este comportamiento fue estudiada por Rothenbuhler,¹⁵ quien propuso como explicación la influencia de dos loci diferentes, uno relacionado con la desoperculación y otro con la remoción de las crías afectadas. Posteriormente, Moritz¹⁶ indicó que la herencia de este carácter sigue un modelo más complejo, y Lapidge et al.¹⁷ detectaron siete loci que influyen en su expresión. Otros estudios han demostrado que el comportamiento higiénico es heredable, lo cual permitiría desarrollar abejas higiénicas en programas de mejoramiento genético.^13,18,19

Una necesidad básica para emprender programas de selección y mejoramiento genético consiste en aplicar técnicas de medición confiables, económicas y prácticas que identifiquen la variación genética en las características a estudiar. Los métodos que en la actualidad se utilizan para evaluar el comportamiento higiénico consisten en sacrificar determinado número de pupas (crías cerradas u operculadas), con la finalidad de estimar la proporción o porcentaje de ellas, que es removida por las abejas obreras de una colonia. Los procedimientos utilizados para sacrificar a las crías operculadas incluyen la punción por medio de un alfiler entomológico con el que se perfora tanto el opérculo como la pupa en desarrollo,²⁰ y dos tipos de congelación: uno consiste en introducir una sección de panal con crías operculadas en un congelador a –18°C o –20°C por un mínimo de 24 h,^3,21 y otro mediante la aplicación de nitrógeno líquido (N2) sobre el panal, lo que produce muerte instantánea de las crías.²²

Investigadores de Estados Unidos de América han comparado algunas técnicas para medir el comportamiento higiénico en colonias de abejas melíferas. Newton y Ostasiewski²⁰ compararon la técnica de punción con la de congelación a –18°C, y estimaron una correlación entre éstas de 0.956 a partir de cinco colonias evaluadas, y aunque no estimaron sus costos, argumentaron que implicaba poco trabajo para aplicarla, por ello no dudaron en recomendarla en sustitución de la prueba de congelación. Spivak y Downey³ también compararon las técnicas de punción y de congelación. En su estudio obtuvieron una correlación de 0.8905 (P < 0.01, n = 11 colonias) para el tiempo que las abejas tardaron en remover las pupas congeladas y puncionadas; además clasificaron sus colonias en tres categorías: higiénicas, intermedias y no higiénicas. Consideraron colonias higiénicas a las que en el transcurso de 48 h y en dos pruebas consecutivas, removieron más de 95% de las crías muertas, y no higiénicas a las que removieron < 5% de las crías. Con base en estas categorías compararon las respuestas higiénicas de las colonias entre los métodos ensayados, de tal forma que observaron que al aplicar la técnica de punción, las abejas detectaron rápidamente la hemolinfa liberada de las crías sacrificadas, ello propició una respuesta intensa de limpieza, y por consiguiente, contrario a lo que ocurre al aplicar la técnica de congelación, se incrementó el número de colonias que al parecer expresaron de manera falsa la característica higiénica. Por ello, estos investigadores consideraron que la técnica de punción no resultaba confiable.

En México ya se han aplicado las tres técnicas mencionadas;^23–25 sin embargo, ningún estudio las ha evaluado de manera comparativa en cuanto a su capacidad para diferenciar colonias altamente higiénicas de las poco higiénicas (capacidad discriminatoria). Tampoco se han estimado sus costos y facilidad de aplicación. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad discriminatoria y estimar el costo y facilidad de aplicación de tres pruebas para medir el comportamiento higiénico (punción, congelación en congelador a –18°C y congelación con N2) en colonias de abejas Apis mellifera L.

 

Material y métodos

La investigación se realizó entre octubre y noviembre de 2003 en el Centro de Mejoramiento Genético, Generación y Transferencia de Tecnología Apícola, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), que se ubica en el km 29 de la carretera estatal Tenango del Valle–Ixtapan de la Sal, municipio de Villa Guerrero, Estado de México, México. El municipio se encuentra al suroeste del estado a 99° 38' 00^'' de longitud Oeste y 18° 58' 36^'' de latitud Norte, a 2 160 msnm. El clima es templado–subhúmedo (C(w)), con lluvias en verano. Este municipio presenta temperatura promedio anual de 17°C con precipitación de 1 242.53 mm.²⁶

 

Establecimiento de las colonias experimentales

Para el desarrollo de los experimentos se utilizaron 110 colonias de abejas que fueron alojadas en colmenas tipo Jumbo, constituidas inicialmente por tres bastidores con crías y alrededor de 2 kg de abejas obreras. Para homologar las condiciones de las colonias se procedió así: a cada colmena se le introdujo una reina (asignada en forma aleatoria), identificada con una placa de plástico numerada y pegada sobre su tórax; asimismo, se administró tratamiento preventivo contra loque europea (Melissococcus pluton) y loque americana (Paenibacillus larvae): sobre los bastidores de la cámara de cría se esparcieron 25 g de una mezcla de 400 g de azúcar pulverizada con 5.5 g de oxitetraciclina HC1.* Además se les aplicó tratamiento contra Varroa destructor mediante introducción de dos tiras plásticas impregnadas con flumetrina.** Las tiras permanecieron en las colonias durante nueve semanas, con la finalidad de que quedaran libres o con muy bajos niveles del ácaro. A todas las colonias se les dio manejo uniforme al alimentarlas cada 15 días con 2 L de jarabe de azúcar al 50% (sacarosa/agua a partes iguales por peso). Este trabajo implicó la realización de dos experimentos que se iniciaron ocho semanas después de retirar las tiras de flumetrina, tiempo suficiente para que las obreras hijas de las reinas introducidas reemplazaran a la población inicial.

 

Experimento 1

Este experimento se realizó para evaluar la capacidad discriminatoria, estimar los costos y analizar la facilidad de aplicación de tres pruebas para medir el comportamiento higiénico en 60 colonias de abejas. Las tres pruebas se aplicaron el mismo día en un mismo panal obtenido de cada colonia experimental y se repitieron a los 15 días. Para todas las pruebas se seleccionaron áreas del panal que tuvieran la mayor cantidad de pupas en etapa de ojos color rosado.²

 

Prueba de congelación en congelador (CC)

Un día antes de aplicar las tres pruebas se escogió un bastidor de cada colonia experimental, del cual se cortó una sección de panal de 6 x 5 cm, que tuviera al menos 100 celdas con crías operculadas. Las secciones se colocaron individualmente dentro de bolsas de polietileno debidamente identificadas, y se transportaron al laboratorio en una hielera de poliestireno con refrigerantes, para después introducirlas en un congelador (–18°C) durante 24 h. Finalizado este tiempo, las secciones se sacaron del congelador y en cada una de ellas se contó el número de celdas operculadas en ambos lados del panal. Luego se llevaron al apiario y se reinsertaron en los bastidores correspondientes en cada colonia experimental.

 

Prueba de congelación con nitrógeno líquido (CN₂)

Se escogió otra área del mismo panal (del que se cortó la sección para la prueba anterior), con al menos 100 celdas de crías operculadas. Sobre esta área se encajó un cilindro metálico de 7 cm de diámetro x 11 cm de altura, sin tapa en los dos extremos, ejerciendo ligera presión con movimientos giratorios. Enseguida se vertió lentamente en el interior del cilindro 250 mL de nitrógeno líquido (a –195°C) para sacrificar a las crías. Al derretirse el hielo formado sobre el panal, se retiró el cilindro para contar las celdas íntegramente operculadas en el área congelada.

 

Prueba de punción (P)

Se utilizó un alfiler entomológico para puncionar y sacrificar 100 pupas en celdas alineadas horizontalmente sobre el panal seleccionado. El alfiler se introdujo en el centro de cada celda hasta tocar el fondo de ésta, para asegurar la muerte de las crías. Con el propósito de facilitar la identificación de las celdas perforadas se insertaron alfileres cortos*** en los extremos de cada fila, uno al inicio y el otro al final de cada hilera.

 

Medición del grado de comportamiento higiénico

Después de aplicar los tres métodos, el panal seleccionado de cada colmena se identificó con una tachuela clavada sobre el cabezal superior de su bastidor y se reintrodujo al centro de la cámara de cría de su colmena. La lectura de resultados del comportamiento higiénico se realizó a las 24 h de aplicadas las pruebas y consistió en determinar el porcentaje de crías sacrificadas que fueron removidas por las abejas, utilizando la fórmula:

[Número de pupas removidas/total de celdas tratadas (puncionadas o congeladas)] x 100

 

Clasificación del grado de higiene

Luego de ser evaluadas con cada una de las pruebas, las colonias experimentales se clasificaron según su grado de limpieza, en colonias de bajo, intermedio o alto comportamiento higiénico. Las colonias de alto comportamiento higiénico fueron aquellas con lecturas superiores a 95% de remoción de crías sacrificadas, las de comportamiento intermedio tuvieron lecturas entre 50% y 95%, y las de bajo grado de higiene retiraron menos de 50% de las crías.

 

Costos

La estimación del costo de la aplicación (repetición) de cada prueba por colonia se realizó considerando las siguientes variables: a) el equipo, que incluyó gastos de inversión y depreciación de un congelador horizontal de 7" y termo para almacenar 20.5 L de nitrógeno líquido, b) la mano de obra, ésta se estimó considerando la participación de cuatro personas. A cada una se le asignaron tres salarios mínimos para 2003,²⁷ al considerar el número de días que requirió la ejecución de cada prueba, c) el transporte, en este rubro se incluyeron los gastos de combustible y mantenimiento de una camioneta que rindió un desplazamiento de 8 km/L de gasolina. No se incluyó la depreciación del vehículo en virtud de que su antigüedad superaba los diez años, d) los insumos, dentro de éstos se consideró el precio del nitrógeno líquido, materiales como alfileres entomológicos, cilindros metálicos, cuchillos, etc., e) los gastos imprevistos, como las erogaciones emergentes, que representaron 10% de dichos conceptos.

 

Facilidad de aplicación

La facilidad de aplicación de las pruebas se determinó en función del número de viajes (días) que se utilizaron para su realización; esto es, se consideraron los traslados destinados a la selección del panal, la ejecución de las técnicas y la lectura de resultados. También se midió el tiempo empleado para usar cada prueba en cada colonia.

 

Experimento 2

Este experimento se realizó debido a que los resultados del experimento 1 mostraron que la prueba de punción tenía baja capacidad discriminatoria, pero dado que resultó ser la más práctica y económica de aplicar en campo, se realizó este experimento adicional con el propósito de comprobar si se podía aumentar su capacidad discriminatoria mediante la reducción del tiempo de lectura de 24 a 8 h, así como para verificar si los olores y fluidos emanados como resultado de la perforación de las crías sacrificadas, estimulaba artificialmente una rápida respuesta higiénica (ambientalmente inducida) de las abejas. La prueba de punción se usó para comparar tres tratamientos que se aplicaron al mismo tiempo en un panal obtenido de cada una de 50 colonias. El primer tratamiento se realizó tal como se describió antes, el segundo se llevó a cabo seleccionando otra área del panal, donde se retiró parcialmente el opérculo de las 100 celdas, cuidando no dañar a la pupa. El tercer tratamiento (testigo) consistió en seleccionar otra área del mismo panal, en la que se delimitaron 100 celdas de cría operculada. En estas celdas no se dañó ni a los opérculos ni a las pupas (sólo se tocaron los opérculos con el alfiler).

 

Análisis estadísticos

Para determinar la capacidad discriminatoria y confiabilidad de las pruebas del primer experimento y así diferenciar con la mayor precisión posible, colonias con alto y bajo comportamiento higiénico, se obtuvieron medidas de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson^28,29 entre las dos repeticiones (mediciones) y entre las pruebas. Se asume que entre más variación se encuentre en la expresión del comportamiento higiénico entre colonias, y entre mayor grado de correlación o menor variación exista entre las repeticiones, la prueba resulta mejor en términos de capacidad discriminatoria y confiabilidad.^30,31 Por lo anterior, se realizó una prueba de razón de varianzas, tanto para comparar las varianzas obtenidas de las tres técnicas aplicadas como para comparar las varianzas obtenidas de las dos mediciones realizadas en cada técnica.

Para determinar diferencias entre las tres categorías, los promedios de respuesta de las colonias (de las dos repeticiones) se sometieron a un análisis de varianza con un modelo de efectos fijos, con excepción de la prueba de punción, en la cual mediante una prueba "t" de Student, se compararon las respuestas de las colonias clasificadas como de alto e intermedio comportamiento higiénico. Adicionalmente, se realizó un análisis de varianza bajo un modelo de efectos fijos para verificar diferencias entre las tres técnicas aplicadas del primer experimento.^28,29 Previo a estos análisis, los datos se transformaron mediante la función arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción, para ajustarlos a una distribución normal. El modelo general utilizado fue:

Yij = u + Ti + Eij

donde:

Yij = j–ésima proporción de comportamiento higiénico (transformada) de la i–ésima categoría o técnica aplicada

µ = media general

Ti = efecto de la i–ésima categoría o técnica aplicada

Eij= error experimental NID (0, σ²)

Los datos obtenidos del segundo experimento también se transformaron con la función arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Se realizó un análisis de "t" de Student y una prueba de comparación de varianzas para comparar las respuestas obtenidas entre la prueba de punción leída a las 24 h y a las 8 h (experimentos 1 y 2, respectivamente). Asimismo, los tratamientos de punción, retiro parcial del opérculo y testigo se compararon mediante análisis de varianza bajo el modelo de efectos fijos anteriormente señalado. Finalmente, para todos los análisis de varianza se utilizó la prueba de comparación múltiple de Tukey.^28,29

 

Resultados

Experimento 1

Relación entre pruebas

Se encontraron correlaciones positivas y significativas para las respuestas de comportamiento higiénico obtenidas de las tres pruebas (P < 0.01, Cuadro 1). Se detectaron diferencias significativas entre las pruebas para el porcentaje de crías removidas por las abejas (F = 30.122; gl = 2,177; P < 0.01). Las colonias expresaron mayor comportamiento higiénico para las crías sacrificadas con la prueba de punción (88%), en comparación con la de congelación en congelador (69%) y con la de congelación con nitrógeno líquido (65%). Entre estas dos últimas pruebas no hubo diferencia (P > 0.05, Cuadro 2).

 

Capacidad discriminatoria y confiabilidad

Se observó mayor variación entre colonias con las dos pruebas de congelación, en comparación con la de punción (P < 0.05, Cuadro 2). No se halló diferencia entre las varianzas de las pruebas de congelación en congelador y congelación con nitrógeno líquido (P > 0.05). La correlación entre repeticiones fue de r = 0.56, 0.45 y 0.37 (n = 60, P < 0.01 en todos los casos) para las pruebas de congelación en congelador, congelación con nitrógeno líquido y punción, respectivamente. No se encontró diferencia entre las varianzas de las repeticiones de cada prueba (P > 0.05).

El número y porcentaje de colonias clasificadas como de bajo, intermedio y alto comportamiento higiénico se muestra en el Cuadro 3. De cinco a seis colonias (< 10%) fueron clasificadas de alto comportamiento higiénico con las pruebas de congelación, pero 25 se clasificaron altamente higiénicas usando la prueba de punción (41.7%); asimismo, ninguna colonia entró en la categoría de bajo comportamiento higiénico con esta última prueba. Se encontraron diferencias significativas entre las colonias que expresaron bajo, intermedio y alto comportamiento higiénico con las pruebas de congelación en congelador y con nitrógeno líquido (F = 88.31; gl = 2,57; P < 0.01 y F = 46.14; gl = 2,57; P < 0.01, respectivamente) y entre las colonias que expresaron intermedio y alto comportamiento higiénico con la prueba de punción (t = 8.27, gl = 58, P < 0.01) (Cuadro 3). En la Figura 1 se muestra la distribución de colonias que expresaron diferentes grados de respuesta higiénica con las tres pruebas aplicadas.

 

Costos y facilidad de aplicación

En cuanto a los costos de aplicación de cada prueba por colmena, la más cara fue la de congelación con nitrógeno líquido, 14.80 pesos (1.31 dólares), seguida de la prueba de congelación en congelador, cuyo costo fue de 10.15 pesos (0.90 dólares), mientras que la más económica fue la de punción, 6.59 pesos (0.58 dólares). El método de punción también fue el más práctico, por requerir de 17 min en promedio, para su aplicación, en sólo dos viajes realizados al apiario. En contraparte, las pruebas menos prácticas fueron las de congelación con nitrógeno líquido y en congelador, ya que para su aplicación se invirtieron 23 y 18 min por colmena, así como dos y tres viajes al apiario, respectivamente (Cuadro 4).

 

Experimento 2

No se encontraron diferencias significativas entre las respuestas higiénicas de las colonias a las 8 y 24 h de lectura con la prueba de punción (t = 0.72, gl = 108, P > 0.05); tampoco se halló diferencia entre las varianzas de los dos tiempos de lectura (F = 1.54; gl = 59, 49; P > 0.05), pero sí se encontraron diferencias significativas entre los tres tratamientos de este experimento (F = 609.63; gl = 2, 147; P < 0.01). La media registrada (% ± DE) para la limpieza de las celdas puncionadas fue de 85.5 ± 15.44, mientras que la media de remoción del tratamiento donde sólo se abrieron los opérculos sin puncionar las crías fue de 14.3 ± 10.76, y la del tratamiento testigo, de 2.1 ± 3.98 (Figura 2).

 

Discusión

Experimento 1

Los resultados revelaron que las tres pruebas midieron de manera relacionada el comportamiento higiénico en las abejas, ya que se encontraron correlaciones significativas entre ellas (Cuadro 1). Spivak y Downey,³ así como Newton y Ostasiewski²⁰ encontraron correlación entre la proporción de cría removida por punción y por congelación en congelador, pero no compararon estas pruebas con la de congelación con nitrógeno líquido. Las correlaciones entre pruebas quizá obedecen al hecho de que en los tres casos se sacrifican crías y las abejas tienen la capacidad de detectar y remover crías muertas.^1,7

Los resultados obtenidos con la prueba de punción mostraron menor variabilidad entre colonias, y de acuerdo con los criterios establecidos que se sustentaron con su distribución y sus valores mínimo y máximo, únicamente se pudieron detectar colonias con capacidad de limpieza intermedia o alta (Cuadros 2 y 3, Figura 1); en este contexto, su capacidad discriminatoria y confiabilidad fueron menores. A pesar de su menor capacidad discriminatoria, la prueba de punción fue la más económica y práctica para medir el comportamiento higiénico de las abejas (Cuadro 4). Otros investigadores también han llegado a dicha conclusión.^20,33

La prueba de congelación con nitrógeno líquido mostró mayor variabilidad entre colonias en comparación con la prueba de punción (Cuadro 2), por lo que se pudieron distinguir colonias de alto y bajo nivel de comportamiento higiénico (Cuadro 3, Figura 1). La correlación entre repeticiones de esa prueba fue significativa (r = 0.45, P < 0.01) y no se halló diferencia entre las varianzas de las dos mediciones (P > 0.05). Estas evidencias respaldan su capacidad discriminatoria y confiabilidad. Otras cualidades de la prueba de congelación con nitrógeno líquido radican en que provoca muerte instantánea de las crías y en que sólo requiere hacer dos viajes al apiario para su instrumentación. Sin embargo, se observaron desventajas, entre ellas: el nitrógeno líquido es difícil de conseguir, es costoso, se necesita un termo especial para almacenarlo, así como un vehículo para transportarlo. El peso del termo dificultó su movilización en condiciones de campo, por lo que para agilizar los experimentos se incrementó el número de personas para su aplicación. Además, fue el método de aplicación más lento (23 min) y se tomaron medidas de seguridad adicionales para evitar accidentes que provocaran quemaduras en el personal que lo aplicó. En conjunto, estas circunstancias contribuyeron a elevar sus costos y a catalogarlo como impráctico, y, por tanto, inaccesible para la mayoría de los apicultores.

La prueba de congelación en congelador tuvo correlación significativa entre repeticiones (r = 0.56, P < 0.01) y variabilidad mayor en comparación con la prueba de punción. La variabilidad no fue diferente a la de la prueba de congelación con nitrógeno líquido, e igualmente se identificaron colonias con alto y bajo comportamiento higiénico con esta prueba (Cuadro 3, Figura 1), lo que acredita su capacidad discriminatoria y confiabilidad. Spivak y Downey³ señalaron que la técnica de congelación en congelador constituye el procedimiento más conservador y confiable para medir el comportamiento higiénico. Asimismo, encontraron que para este método la edad de las pupas sacrificadas y la procedencia de la sección de panal utilizada no influyen en el grado de respuesta higiénica de las colonias, por lo que podrían probarse más colonias en menos tiempo. Sin embargo, en el presente trabajo se detectaron ligeras desventajas del método, entre ellas, la necesidad de tener un congelador y que el proceso de medición implicó la realización de tres viajes al apiario. Ambas circunstancias provocaron ligero incremento en sus costos debido al tiempo, mano de obra y transporte empleados (Cuadro 4).

Las abejas removieron 23% y 19% más pupas con la prueba de punción que las congeladas con nitrógeno líquido y en congelador, respectivamente (Cuadro 2). De hecho, 25 colonias (41.7%) expresaron un comportamiento higiénico superior a 95% con esta técnica (Cuadro 3, Figura 1). Estos resultados concuerdan con los de Spivak y Downey,³ quienes observaron 40% de mayor remoción de las crías sacrificadas mediante el método de punción cuando lo compararon con el de congelación en congelador. De cinco a seis colonias (< 10%) evaluadas con los dos métodos de congelación removieron más de 95% de las crías sacrificadas, ello concuerda con el estudio de Spivak y Reuter,²² quienes señalaron que la característica de alta higiene se ha identificado en casi 10% de las colonias de cualquier raza o estirpe de abejas en Estados Unidos de América, y con 12% registrado en un estudio en colonias de abejas en Yucatán, México.²⁵

Los niveles bajo, intermedio y alto comportamiento higiénico de las colonias fueron significativamente diferentes (P < 0.01). Spivak y Downey,³ aunque también clasificaron sus colonias en estas tres categorías, no las compararon estadísticamente. Sin embargo, sugirieron que las colonias con niveles extremos de comportamiento higiénico pueden ser sometidas a pruebas para evaluar la respuesta higiénica como mecanismo de resistencia a enfermedades. Esta evaluación podría realizarse a partir de un programa de selección divergente, en el cual adicionalmente, se analicen y valoren aspectos de índole productiva y económica. Spivak y Reuter¹⁰ encontraron que las colonias con un comportamiento higiénico superior a 95%, removieron significativamente más crías congeladas, produjeron más miel y tuvieron menor incidencia de cría de cal, loque americana y menor número de ácaros de V. destructor, a diferencia de colonias no seleccionadas de apiarios comerciales. Inclusive, algunas reinas procedentes de la estirpe altamente higiénica, que se aparearon libremente con zánganos de genotipo desconocido, produjeron abejas más higiénicas que las comerciales.

 

Experimento 2

Los resultados de este experimento demostraron que a pesar de que se redujo el tiempo de lectura del tratamiento de punción, la prueba no mejoró su capacidad discriminatoria, ya que no hubo diferencia entre los porcentajes de respuesta higiénica ni entre las varianzas obtenidas a las 8 y 24 h de lectura, por lo que se refuerza la aseveración de que la prueba de punción es menos confiable que las pruebas que involucran el congelamiento de las crías. Con base en el análisis de varianza, se encontró que cuando se puncionaron las crías en el tratamiento a 8 h, las abejas retiraron alrededor de 41 veces más pupas dañadas que las inalteradas del tratamiento testigo, y seis veces más que cuando las celdas se desopercularon parcialmente. Las crías de este último tratamiento fueron removidas en un número significativamente mayor al del tratamiento testigo, a pesar de que no fueron dañadas (Figura 2). Aunado a esto, si se toma en cuenta que en el primer experimento las abejas removieron cerca de 1.3 veces más crías puncionadas que las sacrificadas con las dos pruebas de congelación, entonces se puede sugerir que con la prueba de punción se genera un mayor estímulo, que desencadena una alta y rápida respuesta higiénica de las abejas, lo que puede ser ocasionado por la liberación de olores y hemolinfa a través del opérculo perforado. Este argumento se contrapone con lo referido por Newton y Ostasiewski,²⁰ quienes señalaron que ni la perforación del opérculo ni la pérdida de hemolinfa de la pupa provocan rápida desoperculación de las crías sacrificadas. No obstante, los resultados de estos investigadores son contradictorios, ya que cuando depositaron hemolinfa sobre pupas vivas, las abejas removieron 81% de éstas. Spivak y Downey³ y Gramacho et al.³³ evaluaron las claves que estimulan el comportamiento de remoción de las crías sacrificadas por punción. En esos estudios se encontró que mayor número de pupas fueron removidas cuando se puncionaron o fueron tratadas con hemolinfa, en comparación con pupas que no se habían dañado, por lo que se concluyó que el factor desencadenante de la remoción fue la hemolinfa que fue percibida por las abejas.

En el segundo experimento de este estudio se observó que cuando se alteró la estructura del opérculo sin dañar a las crías, las abejas removieron un bajo porcentaje de pupas (14%, Figura 2); esta situación quizá se debió a olores liberados a través del opérculo perforado, aunque el presente estudio no lo demuestra. Es importante considerar que aun cuando no se dañó a las crías ni al opérculo de las celdas con el tratamiento testigo, las abejas removieron una pequeña proporción de las pupas (2.1%, Figura 2). Este resultado podría indicar que el ambiente interno de la colonia influye en el comportamiento higiénico, como lo refieren diversos investigadores.^11,14,23 En este sentido, Gramacho et al.³⁴ sugieren descontar este porcentaje (que expresa el efecto ambiental) del porcentaje total de remoción expresado cuando se aplica el método de punción, lo cual permitiría tener una medición más precisa del comportamiento higiénico de las colonias.

Con base en los resultados de este trabajo, se concluye que las técnicas de congelación fueron más confiables que la de punción, para medir el comportamiento higiénico de las abejas, quedando a decisión de los investigadores o apicultores interesados, la elección de la prueba que reúna las condiciones requeridas para el cumplimiento de los objetivos que se planteen.

 

Agradecimientos

Se agradece al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (Proyecto 22329) y al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la UNAM (Proyecto IN222203) el financiamiento otorgado, así como al Dr. Carlos Vásquez Peláez por su asistencia estadística, al Dr. Rafael Meléndez Guzmán y a la CP Nora N. Rodríguez Muñoz por su orientación en el cálculo de costos; al M en C José Luis Uribe Rubio, por su apoyo en el establecimiento de algunas colonias utilizadas en este estudio; a la MVZ Adriana Ramos Sánchez, al MVZ Carlos A. Robles Ríos y al técnico Eusebio Sánchez Castañeda, por su participación en las mediciones de campo.

 

Referencias

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NOTAS

* Terramicina polvo soluble fórmula animal®, Pfizer, México.

** Bayvarol®, Bayer, México.

*** Alfileres para marcar sitios en mapas®, México.