Linearidade (faixa de trabalho e faixa linear de trabalho)

Linearidade é a capacidade do método em produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito de interesse (^{ANVISA, 2003}). A linearidade de um método pode ser observada pelo coeficiente de correlação (r) apresentado pelo gráfico da relação existente entre a resposta do equipamento utilizado e a concentração do analito de interesse, denominada de curva de regressão linear de calibração (curva analítica). O r quanto mais próximo de um melhor a linearidade do método (^{Pimentel e Neto, 1996}; ^{Neto, Pimentel e Araújo, 2002}).

Como há uma relação entre a concentração de sulfato e o sinal/resposta (no turbidímetro), para o experimento da avaliação da linearidade, foi elaborada uma curva de regressão linear. Através da diluição de uma solução de trabalho de sulfato com concentração de 5,000 mg.L⁻¹ , foram preparadas soluções de 10, 25, 50, 100, 500 e 1,000 mg.L⁻¹ em balões volumétricos de 100 mL. Para o preparo das soluções referentes aos pontos da curva, foram usados pipeta com pera de laboratório e balões graduados. Cada solução era homogeneizada por 5 minutos em agitador.

A determinação de sulfato nas soluções ocorreu em triplicata para garantir a qualidade dos dados. A linearidade foi calculada a partir da equação da regressão linear (Eq. 1), determinada pelo método dos mínimos quadrados (^{INMETRO, 2003}). Segundo a equação da reta:

Onde: y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.); x = concentração; a = coeficiente linear (interseção com o eixo y, quando x = 0); b = coeficiente angular (inclinação da curva analítica = sensibilidade).

Sensibilidade

A sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da resposta em função da concentração do analito. Pode ser expressa pela inclinação da curva de regressão linear. Geralmente, é determinada simultaneamente aos experimentos de linearidade (^{INMETRO, 2003}).

Limite de detecção e limite de quantificação

O LD é o menor valor de concentração do analito de interesse que pode ser detectado pelo método. Para a validação de um método analítico, é normalmente suficiente fornecer uma indicação do nível em que a detecção do analito pode ser distinguida do sinal do branco/ruído (^{INMETRO, 2003}). O LD foi encontrado a partir da equação abaixo:

Onde: dP = desvio padrão das medidas dos brancos (água ultrapura, Milli-Q da Millipore); b = coeficiente angular da equação da reta.

O LQ é a menor quantidade de um analito que pode ser determinada em uma amostra, com um grau de confiabilidade aceitável (^{INMETRO, 2003}). O LQ foi encontrado a partir da equação abaixo:

Onde: dP = desvio padrão das medidas dos brancos (água ultrapura, Milli-Q da Millipore); b = coeficiente angular da equação da reta.

Para o experimento de LD e LQ, o sinal do branco (água ultrapura, Milli-Q da Millipore) foi determinado 10 vezes e o desvio padrão encontrado foi aplicado nas equações 2 e 3.

Precisão

A precisão avalia a proximidade dos resultados obtidos pelo método e é expressa pelo desvio padrão e coeficiente de variação (CV). A repetitividade da medida de um mesmo método, uma mesma amostra, em um mesmo local e por um mesmo observador, em um curto intervalo de tempo, expressa a precisão dos dados (^{INMETRO, 2003}). Para avaliação desse parâmetro, 10 réplicas das soluções com ausência do analito de interesse (água ultrapura, Milli-Q da Millipore) e concentrações de 10, 100 e 1,000 mg.L⁻¹ de amostras padrões, perfazendo níveis baixo, intermediário e alto, foram determinadas conforme preconizado pelas resoluções normativas (^{ANVISA, 2003}; ^{INMETRO, 2003}). A precisão foi estimada a partir do CV, segundo a equação abaixo:

Onde: CV = coeficiente de variação; DP = desvio padrão das medidas; Med = média das concentrações.

Especificidade e seletividade

É a capacidade de um método em medir de forma exata o analito de interesse, mesmo na presença de interferentes ou componentes da matriz (^{ANVISA, 2003}). Existem diversas maneiras de avaliar a especificidade e seletividade de um método, entretanto uma das maneiras mais utilizadas é através do experimento de recuperação do analito de interesse (^{Brito et al., 2003}; ^{Ribani et al., 2004}), o qual pode ser estimada pela análise de amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo (p. ex:. dopagem) (^{INMETRO, 2003}; ^{Cavalcante et al., 2007}; ^{Cavalcante et al., 2008}; ²⁰¹⁰). A partir da dopagem de amostras (concentração de 50 mg.L⁻¹ ) de águas de lagoa, de estuário e água potável, as quais apresentam naturezas diferentes, foi realizada determinação em triplicata e a recuperação foi avaliada, conforme equação abaixo (^{INMETRO, 2003}):

Onde: C1 = concentração determinada na amostra adicionada; C2 = concentração determinada na amostra não adicionada; C3 = concentração adicionada.

Controle de qualidade analítico

Representa procedimentos globais para assegurar a qualidade nas operações laboratoriais, visando alta eficiência no processo de análise química (^{CITAC and EURACHEM, 2002}). Vários guias são produzidos por agências governamentais e, na maioria das vezes, um programa de QA inclui vários parâmetros, os quais orientam para os cuidados nos procedimentos, desde a amostragem até aos resultados finais, levando a uma alta qualidade da medida produzida (^{USEPA, 2011}).

A calibração do equipamento ocorreu com uma solução padrão de 100 NTU, a qual era determinada 3 vezes antes e após todas as etapas experimentais. Outra forma de controle analítico foi a partir do uso de brancos de soluções (água ultrapura, Milli-Q da Millipore) e determinações realizadas em triplicata de ambas as soluções padrões e amostras.

Linearidade (faixa de trabalho e faixa linear de trabalho)

Para qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito ou valores da propriedade, na qual o método pode ser aplicado. Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear e, dentro desta, a resposta do sinal terá uma relação linear com o analito ou valor da propriedade. A extensão dessa faixa deve ser conhecida, no intuito de garantir dados confiáveis (^{INMETRO, 2003}).

A curva analítica foi construída usando o software Excel (Microsoft, 2007). Os critérios de linearidade para aceitação da curva foram os r e a equação da reta (y = bx + a). O r permite uma estimativa da qualidade da curva construída, em virtude de quanto mais próximo de 1.0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. A linearidade da técnica foi satisfatória até 500 mg.L⁻¹, uma vez que acima dessa concentração, p. ex.: 1,000 ppm, a linearidade começa a ser comprometida, como pode ser verificado pelos r menores que 0.90 (Fig. 1). Segundo a resolução ^{ANVISA (2003)}, o critério mínimo aceitável de r para métodos de determinação é r > 0.99; em casos muito especiais é aceitável a diminuição desse critério. De contrapartida, a portaria do ^{INMETRO (2003)} recomenda um r menos rígido (r > 0.90). Assim, foi estabelecido a faixa linear de trabalho de 10-100 mg.L⁻¹ para a determinação de sulfato nas amostras de águas ambientais e potável, entretanto poderia usar também a faixa de trabalho de 10-500 mg.L⁻¹, a qual está dentro da faixa recomentada pela portaria ^{INMETRO (2003)}.

Figura 1 Curva analítica (10-100 mg.L⁻¹; 10-500 mg.L⁻¹ e 10-1,000 mg.L⁻¹). 

Ambas as faixas lineares de trabalho são satisfatórias para a determinação de sulfato nas matrizes aquosas estudadas, não sendo necessários grandes processos de diluições, conforme sugerido por ^{Cabrera, Baumgarten e Niencheski, 2006}, o que poderia alterar a matriz e, consequentemente, causar erros analíticos (^{Cavalcante, Andrade e Oliveira, 2010}.

Sensibilidade

Sob o ponto de vista prático, a sensibilidade constitui o coeficiente angular do gráfico analítico (b), ou seja, a inclinação da curva analítica (^{INMETRO, 2003}). Quanto maior a inclinação da curva analítica, mais sensível será o método e, consequentemente, melhor será o LD (^{Leite, 2002}). Conforme podem ser verificadas nas curvas analíticas (Fig. 1), ambas as faixas lineares de trabalho apresentam consideráveis sensibilidades, baseadas nas respectivas inclinações.

Limite de detecção e quantificação

O LD e LQ são os menores níveis de concentração em que se conhecem a exatidão e a precisão sob as condições experimentais estabelecidas. O LD representa a menor concentração da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada (^{IUPAC, 2002}). Os valores de LD (0.86 mg.L⁻¹) e LQ (2.9 mg.L⁻¹) estimados são considerados satisfatórios, principalmente para o propósito do método, uma vez que estão muito abaixo do VMP de 250 mg.L⁻¹ das únicas portarias que regulamentam a concentração do sulfato em água (portaria n.^◦ 518, Ministério da Saúde e resolução CONAMA n.^◦ 357).

Precisão

De acordo com os dados apresentados na Tabela 1, é verificado que a maior precisão (CV = 1.45%), é em torno da concentração de 100 mg.L⁻¹ de sulfato. Quando as concentrações de sulfato começam a ser reduzidas, ocorre uma diminuição da precisão. Esse comportamento é esperado, uma vez que concentrações muito próximas dos limites mínimos de detecção do equipamento contribuem para a dificuldade no equilíbrio químico e na detecção, aumentando assim a imprecisão do processo (^{Hinchee, Alleman, Hoeppel e Miller, 1994}). Próximo da concentração de 1,000 mg.L⁻¹ , a linearidade também começa a ser comprometida, diminuindo assim a precisão na medida.

São aceitas precisões para métodos fotométricos de CV = 10% (^{Hinchee et al., 1994}), e, em alguns casos mais rígidos, CV = 5% (^{ANVISA, 2003}). Desta forma, o método é considerado preciso nas concentrações de 10-1,000 mg.L⁻¹ de sulfato, uma vez que o CV não ultrapassou os 10%. Em concentrações abaixo de 10 mg.L⁻¹, é recomentado a determinação em triplicata, o que contribui para a melhoria na precisão e, consequentemente, no dado produzido (^{Hinchee et al., 1994}).

Especificidade e seletividade

A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção (^{INMETRO, 2003}) e, desta forma, quando ausente, coloca em risco a exatidão do processo analítico (^{Ribani et al., 2004}). Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado específico, enquanto um que produz respostas para vários analitos, mas que pode distinguir a resposta de um analito da de outros, é chamado seletivo (^{Brito et al., 2003}; ^{Ribani et al., 2004}). Conforme os dados da Figura 2, a especificidade e seletividade, baseadas na recuperação, foram maiores para matrizes aquosas menos complexas como água potável. Os resultados das matrizes aquosas de lagoa e estuário apresentaram as menores recuperações. O efeito matriz é um dos mais fáceis de detectar, usando o parâmetro de especificidade e seletividade em um programa de validação (^{ANVISA, 2003}). Esse efeito é promovido pelos constituintes da matriz aquosa em questão. Matrizes aquosas ambientais, como as águas de rios e, especialmente, as de estuário e oceânica, apresentam uma constituição muito complexa (p. ex.: diversos íons, ácidos húmicos e fúlvicos, entre outros), promovendo com isso um efeito matriz considerado, o qual pode ser positivo ou negativo (^{Cavalcante, Lima, Fernandes e Duaví, 2012}, ^{Sousa e Cavalcante, 2016}). O efeito da matriz pode se manifestar em várias etapas da análise, como: através de alguns constituintes da amostra no momento do preparo de amostra (p. ex.: evitando a formação do precipitado) ou na etapa de quantificação do analito de interesse (p. ex.: interferência na detecção) (^{INMETRO, 2003}). Devido às salinidades das amostras serem inversamente proporcionais às recuperações, nós acreditamos que a força iônica nas amostras seja o parâmetro governante no efeito matriz. Isso é plausível, pois, na adição de BaCl₂, o mesmo pode reagir com outros ânions prioritários comparados ao sulfato da amostra e, assim, formar pouco precipitado (BaSO₄), ocasionando uma diminuição na eficiência de determinação do analito de interesse.

Figura 2 Resultados do experimento de especificidade e seletividade. 

O resultado dessa figura de mérito é bastante importante, principalmente para determinações de sulfato em matrizes aquosas ambientais complexas, pois mostra que o método apresenta baixa exatidão para esse tipo de matriz, somente podendo ser usado utilizando quantificação através de adição-padrão ou como método qualitativo. Outra forma de utilização do mesmo seria a partir da criação de um fator de correção.

Considerações a respeito do experimento didático

Foi realizada uma aula prática na disciplina semestral de Oceanografia Química I do curso de Oceanografia, com o objetivo de apresentar aos alunos os fundamentos teóricos da validação e fundamentos estatísticos aplicados à análise química para assegurar a confiabilidades dos dados (Fig. 3). A turma era composta por 20 alunos, a qual foi dividida em grupos de 5 alunos, onde tinham 4 horas para validar o método e, depois, determinar o sulfato em matrizes aquosas ambientais e potável. O rendimento dos estudantes foi avaliado por meio de relatórios e provas. Foi possível observar a compreensão dos alunos através dos dados gerados, bem como pelas respostas nas provas e por alguns trechos dos relatórios:

Figura 3 a) Turma do curso de oceanografia (laboratório de aula prática); b) aula prática (Beira Mar, Fortaleza-Ce) e c) aula prática, embarcado com estudantes, professores, técnico e monitor (Delta do Parnaíba-Pi). 

«Validação é o processo pelo qual figuras de mérito são determinadas e avaliadas, sendo estas importantes partes de um programa de garantia de qualidade, tendo como objetivo principal assegurar que determinado procedimento analítico selecionado dê resultados reprodutíveis e confiáveis, e que estes sejam adequados aos fins para os quais tenham sido planejados.»

Os alunos chegaram a conclusões bastante similares, como mostra parte de uma conclusão:

«Durante o processo de validação foi possível produzir uma curva com r satisfatório, indicando que o equipamento tem uma boa resposta para as concentrações em estudo. Embora a precisão do equipamento tenha apresentado coeficiente de variância (CV) com valor aceitável pelas normas nacionais e internacionais (3.19%), a exatidão do equipamento (90.01%), apesar de satisfatória para a determinação de constituintes traços em água, não satisfaz o nível exigido para normas mais rígidas.»

Portanto, os objetivos do experimento didático foram alcançados e os estudantes absorveram os conceitos de validação usando protocolos nacionais e internacionais. Outro fundamento importante observado no experimento foi que, em análise química, primeiro deve-se certificar quanto à adequação do método utilizado, na garantia da qualidade dos resultados e, consequentemente, a fidelidade nas conclusões. A aplicação de software e, especialmente, a aplicação dos fundamentos da estatística no tratamento dos dados na análise química foram outras novidades recebidas muito bem pelos estudantes, uma vez que foram capazes de aliar a informática, a teoria e a prática, facilitando a fixação do conhecimento, conforme preconizado por ^{Romero e Blanco (2001)} e ^{James-Molina et al. (2002)}.