Material vegetal y desinfección

Se emplearon cápsulas cerradas de cinco a siete meses de edad obtenidas por polinización manual de las orquídeas S. maculosa, S. martiana y S. tigrina cultivadas en el Estado de México. Las cápsulas se lavaron con detergente comercial durante 5 min y se enjuagaron con agua de la llave. Después se introdujeron en una mezcla de hipoclorito de sodio comercial Cloralex^® (NaOCl 30 % v/v), Microdyn^® (1 % v/v) y Tween 20^® (4 % v/v) en agitación constante por 15 min seguido de cinco enjuagues con agua destilada esterilizada. Finalmente, se sumergieron en Captán^® (N-triclorometiltio4-ciclohexeno-1,2 dicarboximida, 4 g L^-1) en agitación constante durante 15 min y se colocaron sin enjuagar en una placa Petri donde se les hizo un corte y se sembraron las semillas en frascos de cultivo.

Medio y condiciones de cultivo

En todas las etapas del proceso de organogénesis directa se empleó el medio básico de ^{Murashige y Skoog (MS, 1962)} suplementado con sacarosa (30 g L^-1), myo-inositol (1.0 mg L^-1), tiamina (0.4 mg L^-1) y agar Sigma-Aldrich^® (7 g L^-1). El pH del medio se ajustó a 5.7 con NaOH o HCl 1N y se esterilizó en autoclave vertical (AESA^® 300, México) a 121 °C y 1.5 kg cm^-2 de presión durante 20 min. El material vegetal in vitro se mantuvo en un cuarto de incubación a 25 ± 2 °C, 16 h de luz y 8 h de oscuridad con intensidad luminosa de 45 μmol m^-2 s^-1 y humedad relativa de 40 %.

Germinación in vitro

Las semillas se depositaron en medio de cultivo básico MS a la mitad de concentración de sales inorgánicas en frascos de vidrio de 100 mL de capacidad con 40 mL de medio. Se observaron los cambios morfológicos de las semillas y se contabilizó el porcentaje de los frascos donde se estableció el cultivo axénico y ocurrió la germinación.

Inducción de brotes

Se usaron como explantes plántulas in vitro de 15 a 20 semanas de edad, longitud promedio de 2 cm, con tres o cuatro hojas formadas y sin raíz. Se estableció un explante en cada frasco de vidrio de 45 mL de capacidad con 10 mL de medio. Se evaluaron 20 tratamientos constituidos por medio de cultivo MS al 50 y 100 % adicionados con los reguladores de crecimiento BA, ANA y 2,4-D (Cuadro 1). Se hizo un subcultivo a los mismos tratamientos a las cuatro semanas. Después de 7-9 semanas se cuantificó el número de explantes que generaron brotes (B, %), el número de brotes por explante (BE) y la longitud de brotes (LB, cm). Se usó un diseño completamente al azar con 12 repeticiones y la unidad experimental fue un frasco con un explante.

Multiplicación de brotes

Se utilizaron como explantes grupos de dos a tres brotes de 3 cm de longitud resultantes de la etapa de inducción, se sembraron en frascos de vidrio de 100 mL de capacidad con 30 mL de medio de cultivo MS 50 % adicionado con reguladores de crecimiento de cinco tratamientos del Cuadro 1 (1, 6, 7, 9 y 10 ) y dos nuevos tratamientos en los que se adicionó BA (28.40 µM) + ANA (1.36 µM) y BA (28.40 µM) + 2,4-D (1.36 µM). Al término de cuatro semanas se cuantificó BE. Se usó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad experimental fue un explante por cada frasco.

Alargamiento de brotes

Se emplearon como explantes grupos de dos a tres brotes de 2 cm de longitud producidos en la etapa de multiplicación. Se colocaron en frascos de vidrio de 100 mL de capacidad con 30 mL de medio de cultivo MS, carbón activado y ácido giberélico (Cuadro 2). Después de cuatro semanas se midió la longitud de los brotes (LB, cm). El diseño experimental fue completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad experimental fue un frasco con un explante.

Enraizamiento in vitro de brotes

Se utilizaron brotes de 3.5 cm sin raíz como explantes generados en la etapa de alargamiento. Se colocaron en frascos de vidrio de 250 mL con 40 mL de medio MS 50 % adicionado con ácido indol-3-butírico (AIB, 2.46, 4.96, 7.44 y 10.0 µM), ácido indol-3-acético (AIA, 2.46, 4.96, 7.44 y 10.0 µM) y ácido 1-naftalenacético (ANA, 2.46, 4.96, 7.44 y 10.0 µM) y un testigo sin reguladores de crecimiento. En las especies S. martiana y S. tigrina se hizo un segundo subcultivo a los mismos tratamientos a las cinco semanas. A partir del establecimiento, al término de cinco semanas en S. maculosa y 11 semanas en S. martiana y S. tigrina se cuantificaron la cantidad de raíces producidas por brote (RB) y la longitud de raíces (LR, cm). Se usó un diseño completamente al azar con 10 repeticiones y la unidad experimental fue un frasco con dos brotes.

Análisis estadístico

A partir de la etapa de inducción de brotes hasta enraizamiento in vitro se hizo análisis de varianza en las variables evaluadas de cada especie con el sistema de análisis estadístico SAS versión 9.1 ^{(SAS Institute, 2003)}, se usó la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) para la comparación de medias entre tratamientos.

Germinación in vitro

La germinación ocurrió en el 100 % de los frascos cultivados con semillas en las tres especies. Stanhopea maculosa germinó en promedio a los 51 días después de la siembra (dds), iniciando a los 35 dds (Figura 2A) y terminando a los 67 dds (Figura 2B); en S. martiana el tiempo promedio de germinación fue de 32 dds, iniciando a los 17 dds (Figura 3A) y terminando a los 48 dds (Figura 3B), mientras que en S. tigrina ocurrió en promedio a los 42 dds, con inicio a los 17 dds (Figura 4A) y terminó a los 60 dds (Figura 4B). En las tres especies ocurrió el aumento de tamaño de las semillas con un incremento en su verdor y terminó con la emisión del brote apical y la formación de rizomas en los protocormos, mostrando los cambios morfológicos típicos en la germinación y crecimiento de plántulas de orquídeas ^{(Seaton y Ramsay, 2005)}. El intervalo en que ocurrió la germinación de estas especies es semejante al reportado por ^{Castillo-Pérez et al. (2021)} en S. tigrina, donde se observó el rompimiento de la testa a partir de los 30 dds, seguido de la formación de protocormos y culminando con la emisión de primordios foliares a los 65 dds, en tanto que en S. hernandezii se observaron respuestas desde la imbibición hasta el rompimiento de la testa en un periodo de 21 dds ^{(Arellano-García et al., 2020)}; no obstante, en la actualidad son escasos los trabajos de cultivo in vitro para determinar contrastes con otras especies cercanas de la subtribu Stanhopeinae.

Figura 1 Comparación de medias en número de brotes por explante (BE) por el efecto de siete tratamientos en la multiplicación de brotes de tres especies del género Stanhopea. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). Error estándar: S. maculosa = 0.80, S. martiana = 2.62, S. tigrina = 2.45. 

Figura 2 Etapas del proceso morfogénico in vitro para Stanhopea maculosa por organogénesis directa. A) Inicio de la germinación in vitro a los 35 días después de siembra (dds), B) término de la germinación in vitro después de 67 días, C) inducción de brotes en MS 100 % con 11.36 μM de BA y 1.36 μM de 2,4-D después de siete semanas, D) multiplicación de brotes en MS 50 % con 22.72 μM de BA y 1.36 μM de ANA después de cuatro semanas, E) alargamiento de brotes en MS 50 % con 4.2 μM de AG3 después de cuatro semanas, F) enraizamiento in vitro en MS 50 % con 10.0 μM de AIB después de cinco semanas. 

Figura 3 Etapas del proceso morfogénico in vitro para Stanhopea martiana por organogénesis directa. A) Inicio de la germinación in vitro a los 32 días después de siembra (dds), B) término de la germinación in vitro a los 48 dds, C) inducción de brotes en MS 50 % con 22.72 μM de BA y 1.36 μM de 2,4-D después de nueve semanas, D) multiplicación de brotes en MS 50 % con 22.72 μM de BA y 1.36 μM de 2,4-D después de cuatro semanas, E) alargamiento de brotes en MS 50 % después de cuatro semanas, F) enraizamiento in vitro en MS 50 % con 2.46 μM de AIB después de 11 semanas. 

Figura 4 Etapas del proceso morfogénico in vitro para Stanhopea tigrina por organogénesis directa. A) Inicio de la germinación in vitro a los 42 días después de siembra (dds), B) término de la germinación in vitro a los 60 dds, C) inducción de brotes en MS 50 % con 22.72 μM de BA y 1.36 μM de ANA después de nueve semanas, D) multiplicación de brotes en MS 50 % con 11.36 μM de BA después de cuatro semanas, E) alargamiento de brotes en MS 50 % después de cuatro semanas, F) enraizamiento in vitro en MS 50 % con 10.0 μM de AIA después de 11 semanas. 

Inducción de brotes

Se observó la emisión de brotes normales a partir de la base de los explantes en cada especie (Figuras 2C, 3C, 4C); sin embargo, los reguladores de crecimiento y el medio de cultivo no produjeron un efecto significativo en B (%) para ninguna de las tres especies, lo que sugiere que la sola exposición de los explantes al MS determina la aparición de brotes adventicios. En las variables BE y LB no todos los tratamientos produjeron el mismo efecto en cada especie (Cuadro 3); sin embargo, no se presentaron semejanzas en los tratamientos que produjeron los valores más altos, lo que refleja que el genotipo de cada orquídea determinó el potencial de respuesta morfogénica en las técnicas del cultivo in vitro, por lo que la presencia del BA y las auxinas en las concentraciones propuestas funcionaron efectivamente como parte del proceso organogénico, permitiendo un desarrollo normal de tallos y hojas en cada brote.

Por otro lado, ^{Cruz-Cruz et al. (2022)} registraron en S. tigrina 4.5 brotes en MS completo después de 24 semanas, mientras que ^{Castillo-Pérez et al. (2021)} reportaron un promedio de 1.25 brotes en medio MS 100 % con 22.72 µM de BA en S. tigrina después de cuatro semanas de cultivo. Las diferencias encontradas en las respuestas al cultivo in vitro entre algunas especies de orquídeas ha conducido a establecer protocolos individualizados para su propagación.

Multiplicación de brotes

Los explantes emitieron brotes normales en las tres especies (Figuras 2D, 3D, 4D), BE se vio afectada significativamente sólo en S. maculosa produciendo un máximo de 2.6 brotes en MS 50 % con 22.72 µM de BA y 1.36 µM de 2,4-D (Figura 1). La BA es una de las citocininas más utilizadas para inducir división celular y estimular la proliferación de brotes en combinación con auxinas u otras citocininas durante el proceso de morfogénesis ^{(Castillo-Pérez et al. 2021)}, con ella se observó un incremento en el número de brotes respecto de los obtenidos en la etapa de inducción, el efecto fue más evidente en S. martiana y S. tigrina en cualquiera de los tratamientos.

Alargamiento de brotes

La concentración de sales inorgánicas del medio MS, y el uso de CA y de AG₃(Cuadro 2) afectó significativamente la longitud de brotes en S. martiana y S. tigrina después de cuatro semanas (Cuadro 4), en ambas especies el subcultivo efectuado en medio MS 50 % fue el más propicio para incrementar su crecimiento; no obstante, en el estudio de ^{Chávez y Castro (2021)}S. tigrina emitió brotes que alcanzaron hasta 22.22 cm de longitud en un medio MS 100 % a las 16 semanas; mientra que ^{Cruz-Cruz et al. (2022)} obtuvieron en S. tigrina 7.20 cm en MS 100 % después de 16 semanas. Por otro lado, en S. hernandezii se obtuvieron 5.73 cm de longitud en plántulas in vitro subcultivadas en medio MS 100 % con 22.72 µM de BA después de 16 semanas ^{(Arellano-García et al., 2020)}.

Enraizamiento in vitro de brotes

Finalmente, en el enraizamiento in vitro en medio MS 50 % los brotes produjeron raíces adventicias normales en cada una de las especies (Figuras 2F, 3F, 4F), el uso de las diferentes auxinas afectó significativamente el comportamiento de las tres especies. Los valores de RB en S. maculosa alcanzaron hasta 3.95 raíces con 10.0 µM de AIB a las cinco semanas, en S. martiana se obtuvieron hasta 5.25 raíces con 2.46 µM de AIB, y en S. tigrina un máximo de 8.75 raíces con 4.96 µM de AIB, ambas después de 11 semanas (Figura 5), mientras que en la variable LR S. maculosa obtuvo una logitud máxima de 1.57 cm y S. tigrina de 2.96 cm, ambas con 10 µM de AIB, mientras que S. martiana logró desarrollar raíces de hasta 3.31 cm de longitud con 4.96 µM de AIA (Figura 6).

Figura 5 Comparación de medias del número de raíces por brote (RB) producidas por el efecto de AIA, AIB y ANA en el enraizamiento in vitro de tres especies del género Stanhopea. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). Error estándar: S. maculosa = 2.68, S. martiana = 2.42, S. tigrina = 2.83. 

Figura 6 Comparación de medias de la longitud de raíces (LR) producidas por el efecto de AIA, AIB y ANA en el enraizamiento in vitro de tres especies del género Stanhopea. Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05). Error estándar: S. maculosa = 0.34, S. martiana = 1.66, S. tigrina = 0.80. 

Por otra parte, la formación de raíces in vitro se estudió en S. tigrina donde ^{Chávez y Castro (2021)} obtuvieron 5.63 raíces de 0.79 cm en MS 100 % con 10 % de pulpa de plátano después de 16 semanas, en tanto que ^{Castillo-Pérez et al. (2021)} suministraron 28.27 μM de AIA y 10 % de agua de coco en MS 100 % obteniendo hasta nueve raíces después de 12 semanas. En comparación, las especies evaluadas en la presente investigación presentaron un menor tiempo de exposición a los tratamientos, superando algunos de los valores reportados, por lo que se recomienda el uso de auxinas en un medio MS 50 %.