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INTRODUCCIÓN
La familia Orchidaceae comprende más de 900 géneros y es una de las familias más grandes y diversas dentro de las plantas con flores. Las orquídeas habitan en un amplio espectro de condiciones ambientales, se pueden encontrar en todas partes del mundo y en la mayoría de los nichos ecológicos. Las flores son variables en tamaño, forma y color, con estructuras y características fisiológicas especializadas (Goh y Arditti, 2018). Soto et al. (2015) reportaron la existencia de 30,000 especies de orquídeas en el mundo, de las cuales México alberga más de 1260, que representan 4.2 % del total de especies. Téllez (2011) mencionó que el porcentaje de endemismo en las orquídeas es del 8 % en géneros y 40 % en especies.
En el estado de Oaxaca habitan aproximadamente 700 especies, distribuidas en 144 géneros y cuatro subespecies (Cox, 2013; Soto y Salazar, 2004). Prosthechea vitellina es una especie de orquídea sujeta a protección especial por la NOM-059-SEMARNAT (SEMARNAT, 2010). Un factor determinante que ha contribuido a la pérdida de la orquideoflora mexicana es el comercio ilegal. Se ha estimado la pérdida de entre 9 y 12 millones de ejemplares en tres años (Téllez, 2011). A pesar de las leyes vigentes que prohíben estas prácticas, las plantas continúan colectándose y exportándose. Es complicado contrarrestar o eliminar la comercialización ilegal porque en muchas ocasiones es una fuente de ingreso para muchas familias y comunidades (Emeterio-Lara et al., 2016). Prosthechea vitellina no ha escapado de esta problemática generalizada para las orquídeas, por lo que también enfrenta la sobrecolecta de ejemplares silvestres.
La condición de especie amenazada de P. vitellina conduce a la búsqueda de estrategias que resuelvan los problemas de reproducción en su ambiente natural, una opción es el uso de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro. La propagación in vitro de orquídeas amenazadas o sujetas a protección especial representa una forma viable para obtener gran cantidad de plantas con fines de rescate, conservación, reintroducción y aprovechamiento comercial sostenible. La germinación asimbiótica in vitro ha sido exitosa en especies de orquídeas silvestres y se ha convertido en una técnica frecuente para la obtención de nuevos híbridos comerciales (Arditti y Ghani, 2000). Con la finalidad contribuir a la conservación y aprovechamiento de esta orquídea, el presente estudio tuvo como objetivo determinar las condiciones óptimas para regenerar in vitro plantas de P. vitellina por organogénesis directa a partir de plántulas germinadas in vitro y su aclimatación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y desinfección
Se utilizaron cápsulas maduras cerradas colectadas de plantas silvestres. La desinfección superficial se basó en el método reportado por Mayo et al. (2010). Se lavaron con agua y jabón comercial (Roma®) en agitación continua por 5 min seguido de enjuagues con agua del grifo. En una cabina de flujo laminar se sumergieron en alcohol etílico 70 % en agitación continua por 1 min, se enjuagaron con agua destilada y enseguida se sumergieron en hipoclorito de sodio comercial (NaClO, Cloralex®, 30 % v/v), plata coloidal estable (Microdyn®, 1 % v/v) y Tween® 20 (4 % v/v) por 15 min en agitación continua; después, se sumergieron en Captan® (2 g L-1) por 5 min en agitación.
Medio de cultivo y condiciones de incubación
El medio de cultivo utilizado en las etapas de la organogénesis fue el MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con sacarosa (30 g L-1) y solidificado con agaragar (Merck®, 7 g L-1). El pH se ajustó a 5.7 con NaOH o HCl 1N en un potenciómetro (Thermo Scientific® Modelo Orion 3 Star, Waltham, Massachusetts, EUA). La esterilización se hizo en autoclave vertical (AESA® 300, México) a 121 °C y 1.5 kg cm-2 de presión por 20 min. Los cultivos se incubaron a 26 ± 2 °C en fotoperiodo de 16 horas e intensidad lumínica de 45 μmol m-2 s-1.
Regeneración de plantas por organogénesis directa Inducción de brotes
Plántulas germinadas in vitro de 18 semanas de edad, de 1 a 2 cm de altura y sin raíces se establecieron en medio MS con BA (1.1-2.2 mg L-1) combinado con ANA (0.0, 0.19 y 0.38 mg L-1) y AIA (0.0, 0.18 y 0.36 mg L-1). Se usaron frascos de vidrio de 45 mL de capacidad con 15 mL de medio de cultivo y se hizo un subcultivo a las cuatro semanas. A las ocho semanas se cuantificó el número de brotes por explante (BE) y longitud de los brotes (LB, cm). El experimento tuvo 10 repeticiones por tratamiento, donde la unidad experimental fue un frasco de cultivo con cuatro plántulas.
Crecimiento de brotes
Grupos de brotes de 1 cm se colocaron en medio MS completo y a la mitad de la concentración de sales (MS 50 %), con y sin carbón activado (0.5 g L-1). Se usaron frascos de vidrio de 90 mL de capacidad que contenían 30 mL de medio y a las cuatro semanas se hizo un subcultivo. Después de ocho semanas se cuantificó la longitud de brotes (cm). El experimento tuvo 10 repeticiones por tratamiento y la unidad experimental fue el grupo de brotes por frasco.
Multiplicación de brotes
Brotes de 1.8 cm de longitud se cultivaron en medio MS con BA (1.0, 2.0 y 3.0 mg L-1) combinadas con ANA o AIA (0.25 mg L-1). Se usaron frascos de vidrio de 45 mL de capacidad con 15 mL de medio y se hizo un subcultivo a las cuatro semanas. Después de ocho semanas se evaluó el número de brotes (NB), la longitud de brote (LB, cm) y el porcentaje de brotación (B, %). El experimento tuvo 10 repeticiones por tratamiento y la unidad experimental fueron dos brotes por frasco.
Enraizamiento de plantas
Brotes de 3.5 cm se cultivaron en 50 % de las sales del medio MS con 0.0, 0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1 de AIB, AIA y ANA. Se usaron frascos de vidrio de 90 mL de capacidad con 30 mL de medio y se hizo un subcultivo a las cuatro semanas. A las cuatro y ocho semanas se cuantificó el porcentaje de enraizamiento y el número de raíces por brote (RB). Cada tratamiento tuvo 10 repeticiones y la unidad experimental fueron tres brotes por frasco.
Aclimatación de plantas
Plantas enraizadas in vitro de 5 y 7 cm se plantaron en corteza de pino y una mezcla de turba + perlita (1:1). Se usaron vasos de poliestireno expandido de 118 mL de capacidad cubiertos con un domo del mismo material. Se fertilizaron con solución 50 % de la concentración de sales del medio MS y a las dos semanas se hicieron tres perforaciones en el domo del vaso para favorecer la aireación. A las cuatro y ocho semanas se cuantificó la supervivencia (%). Los tratamientos tuvieron 20 repeticiones por tratamiento y la unidad experimental fue una planta por vaso.
Análisis estadístico
Los experimentos se establecieron en diseño completamente al azar y los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (ANDEVA) con el software SAS ver. 9.4 (SAS Institute, 2013) con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05) para comparar las medias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la desinfección superficial de cápsulas cerradas de P. vitellina no se presentaron problemas de contaminación. A partir de la germinación de semillas se obtuvieron plántulas para utilizarlas como explantes en la organogénesis (Figura 1).
Figura 1 Regeneración in vitro de Prosthechea vitellina por organogénesis directa. A) germinación después de ocho semanas, B) plántulas in vitro utilizadas como explantes para la organogénesis, C) brotes inducidos con 2.2 mg L-1 de BA y 0.19 mg L-1 de ANA después de ocho semanas, D) multiplicación de brotes con 1.0 mg L-1 de BA y 0.25 mg L-1 de AIA en medio MS con la mitad de concentración de sales después de ocho semanas, E) alargamiento de brotes en medio MS a la mitad de la concentración de las sales y 0.5 g L-1 de carbón activado a las ocho semanas, F) enraizamiento in vitro con 2.0 mg L-1 de AIB a las 8 semanas, G) aclimatación de plantas después de ocho semanas.
En todos los tratamientos se presentó brotación. La mayor cantidad de brotes por explante (2.03) se obtuvo en medio MS completo con 2.2 mg L-1 BA y 0.19 mg L-1 ANA después de ocho semanas de cultivo; en contraste, el medio MS con 50 % de concentración de sales, 1.1 mg L-1 de BA y 0.36 mg L-1 de AIA produjo 1.23 brotes. La mayor longitud de los brotes (1.2 cm) se obtuvo con 2.2 mg L-1 BA + 0.38 mg L-1 ANA en una concentración del 100 % del medio MS a las ocho semanas (Figura 1C), a diferencia de la menor longitud (0.86 cm) obtenida con 1.1 mg L-1 y 0.38 mg L-1 ANA con 50 % de las sales del medio MS (Cuadro 1).
Cuadro 1 Número de brotes por explante (BE) y longitud de brotes (LB) inducidos en plántulas in vitro de Prosthechea vitellina con 6-benciladenina (BA), ácido naftalenacético (ANA) y ácido indolacético (AIA) a las ocho semanas de cultivo.
| MS (%) | BA (mg L-1) | ANA (mg L-1 ) | AIA (mg L-1) | BE | LB (cm) |
|---|---|---|---|---|---|
| 50 | 1.1 | 0.19 | - | 1.78 abc | 0.94 abc |
| 50 | 1.1 | 0.38 | - | 1.58 abc | 0.86 c |
| 50 | 1.1 | - | 0.18 | 1.55 abc | 0.90 bc |
| 50 | 1.1 | - | 0.36 | 1.23 c | 0.89 bc |
| 50 | 2.2 | 0.19 | - | 1.60 abc | 1.09 abc |
| 50 | 2.2 | 0.38 | - | 1.58 abc | 1.01 abc |
| 50 | 2.2 | - | 0.18 | 1.53 abc | 1.01 abc |
| 50 | 2.2 | - | 0.36 | 1.85 ab | 0.86 c |
| 100 | 1.1 | 0.19 | - | 1.75 abc | 1.12 abc |
| 100 | 1.1 | 0.38 | - | 1.80 abc | 1.01 abc |
| 100 | 1.1 | - | 0.18 | 1.60 abc | 1.02 abc |
| 100 | 1.1 | - | 0.36 | 1.73 abc | 1.07 abc |
| 100 | 2.2 | 0.19 | - | 2.03 a | 1.13 abc |
| 100 | 2.2 | 0.38 | - | 1.43 bc | 1.20 a |
| 100 | 2.2 | - | 0.18 | 1.30 bc | 1.10 abc |
| 100 | 2.2 | - | 0.36 | 1.63 abc | 1.16 ab |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P < 0.05).
Los brotes se observaron en la base de los explantes, inicialmente de color amarillo claro y después verde. A las cuatro semanas se contaron de uno a dos brotes de 0.5 cm y con las hojas formadas semidesplegadas. A la octava semana los brotes presentaron de dos a tres hojas formadas de color verde intenso y longitud de 1 cm.
En orquídeas, el proceso de organogénesis es inducido por reguladores de crecimiento, principalmente BA y ANA. En Cattleya trianae se obtuvo 47.2 % de brotes con 0. 05 mg L-1 de BA (Gil et al., 2019). En Phalaenopsis spp. (Blume) el medio MS con 50 % de concentración de sales adicionado con 4.4 mg L-1 de BA y 1.02 mg L-1 de ANA favorecieron la inducción de brotes en explantes de yemas florales (Frausto et al., 2019).
Crecimientos de brotes
La mejor respuesta en el alargamiento de los brotes (2.16 cm) se obtuvo en medio MS a la mitad de la concentración de las sales y 0.5 g L-1 de carbón activado después de ocho semanas (Figura 1E). El mayor número de brotes fue de 3.38 en el medio MS completo y 0.5 g L-1 de carbón activado (Cuadro 2).
Cuadro 2 Número de brotes (BE) y longitud de brote (BE) en Prosthechea vitellina a las ocho semanas de cultivo.
| MS (%) + CA (g L-1) | Número de brotes | Longitud de brote (cm) |
|---|---|---|
| 100 + 0.5 | 3.38 a | 2.04 a |
| 50 + 0.5 | 2.72 b | 2.16 a |
| 100 + 0.0 | 2.22 b | 1.55 b |
| 50 + 0.0 | 2.20 b | 1.71 b |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P < 0.05).
El carbón activado en la micropropagación de orquídeas mejora el crecimiento y la supervivencia de las plantas in vitro debido a que disminuye los compuestos fenólicos, además de que posee una alta afinidad de adsorción a los compuestos inhibidores y sustancias morfogenéticamente activas o tóxicas no identificadas (Kant et al., 2016; Park et al., 2006).
En Laelia flava, Miltonia flavescens y Oncidium trulliferum 2 g L-1 de carbón activado en medio MS a la mitad de la concentración de las sales mejoró la calidad de la planta in vitro y favoreció la supervivencia (Moraes et al., 2005). En Cattleya labiata 1.5 g L-1 de carbón activado incrementó el crecimiento de las plántulas in vitro después de ocho meses de cultivo (Sipayung et al., 2018). En Pecteilis radiata la inclusión de carbón activado en el medio de cultivo redujo el oscurecimiento de los protocormos (Kim et al., 2019).
Multiplicación de brotes
Todos los tratamientos promovieron la brotación en diferentes porcentajes. La mayor cantidad de brotes por explante fue de 2.5 con 1.0 mg L-1 de BA y 0.25 mg L-1 de AIA en medio MS 50 % después de ocho semanas (Figura 1D). La mayor longitud de brote fue de 1.63 cm con 1.0 mg L-1 de BA + 0.25 mg L-1 de ANA en medio MS con 50 % de concentración de sales (Cuadro 3). Los brotes se observaron a partir de la segunda semana en la base del explante.
Cuadro 3 Número de brotes por explante (BE), longitud de brote (LB) y brotación (B, %) en Prosthechea vitellina con 6-benciladenina (BA), ácido naftalenacético (ANA) y ácido indolacético (AIA) a las ocho semanas de cultivo.
| MS (%) | BA (mg L-1) | ANA (mg L-1) | AIA (mg L-1) | BE | LB (cm) | B (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 50 | 1.0 | 0.25 | - | 2.25 a | 1.63 a | 95 a |
| 50 | 1.0 | - | 0.25 | 2.50 a | 1.33 ab | 100 a |
| 50 | 2.0 | 0.25 | - | 1.75 ab | 1.16 ab | 95 a |
| 50 | 2.0 | - | 0.25 | 2.00 ab | 1.04 b | 95 a |
| 50 | 3.0 | 0.25 | - | 1.85 ab | 1.31 ab | 100 a |
| 50 | 3.0 | - | 0.25 | 1.90 ab | 1.19 ab | 95 a |
| 100 | 1.0 | 0.25 | - | 2.05 ab | 1.11 b | 95 a |
| 100 | 1.0 | - | 0.25 | 1.65 ab | 1.13 b | 95 a |
| 100 | 2.0 | 0.25 | - | 1.60 ab | 1.01 b | 75 a |
| 100 | 2.0 | - | 0.25 | 1.65 ab | 1.14 ab | 90 a |
| 100 | 3.0 | 0.25 | - | 1.35 ab | 0.84 b | 85 a |
| 100 | 3.0 | - | 0.25 | 1.60 ab | 0.89 b | 85 a |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).
En la organogénesis de orquídeas se han reportado resultados variables. Pant y Thapa (2012) lograron 4.5 brotes por explante en la micropropagación de Dendrobium primulinum con 1.5 mg L-1 de BA y 0.5 mg L-1 de ANA utilizando brotes de 0.3 a 0.5 mm. En Cymbidium aloifolium, Kumar et al. (2021) obtuvieron un máximo de 39 brotes en medio MS con 1.0 mg L-1 de BA. En Smithsonia maculata, Decruse y Gangaprasad (2018) obtuvieron 11.25 brotes por explante con 10 mg L-1 de BA y 1.0 mg L-1 de AIA a las 12 semanas de cultivo. En Vainilla tahitensis la dosis de 2 mg L-1 de BA promovió 5 y 6 brotes a los 60 y 90 días después de la siembra (Barcia, 2020; Com. Pers,) 1.
En el género Prosthechea son limitados los estudios sobre la multiplicación in vitro; dentro de la escasa literatura disponible, se ha encontrado que en P. citrina 1.5 mg L-1 de BA y 0.15 mg L-1 de ANA favorecieron la producción de 6.75 brotes por explante (Cazarez et al., 2016). La BA en el cultivo in vitro promueve la proliferación de orquídeas, debido a que interviene principalmente en la división celular (Raven et al., 1992). A medida que se producen más células en un tejido, es mayor el potencial de regeneración (Veltcheva y Svetleva, 2005); este efecto es variable por el estado de diferenciación de las células (Gil et al., 2019).
Enraizamiento de plantas
Todos los tratamientos promovieron el enraizamiento, aunque las diferencias significativas sólo se presentaron en el número de raíces a las cuatro semanas. El 90 % se obtuvo en los tratamientos con 1.0 mg L-1 de ANA y con 0.5 mg L-1 de AIB a las ocho semanas de cultivo, sin encontrar diferencias entre tratamientos para el número de raíces a las ocho semanas (Figura 1F, Cuadro 4).
Cuadro 4 Enraizamiento in vitro de plántulas de Prosthechea vitellina con ácido indol-3-butírico (AIB), ácido indolacético (AIA) y ácido naftalenacético (ANA) a las cuatro y ocho semanas de cultivo.
| Regulador de crecimiento (mg L-1) |
4 semanas | 8 semanas | ||
|---|---|---|---|---|
| Número de raíces | Enraizamiento (%) | Número de raíces | Enraizamiento (%) | |
| 0 .0 | 2.37 ab | 73.33 | 3.97 a | 83.33 |
| 0.5 AIB | 2.93 a | 83.33 | 4.47 a | 90.00 |
| 1.0 AIB | 1.57 ab | 63.33 | 4.23 a | 80.00 |
| 2.0 AIB | 1.57 ab | 53.33 | 5.27 a | 80.00 |
| 0.5 AIA | 2.57 ab | 73.33 | 4.30 a | 86.67 |
| 1.0 AIA | 2.27 ab | 66.67 | 4.47 a | 76.67 |
| 2.0 AIA | 1.50 ab | 53.33 | 3.30 a | 73.33 |
| 0.5 ANA | 2.00 ab | 60.00 | 3.53 a | 73.33 |
| 1.0 ANA | 2.53 ab | 80.00 | 4.50 a | 90.00 |
| 2.0 ANA | 1.17 b | 63.33 | 3.97 a | 86.67 |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).
La presencia de raíces se observó a partir de la segunda semana en todos los tratamientos; al inicio fueron casi transparentes y después verdes. A la octava semana las raíces aumentaron en número y tamaño, tomando la característica forma de las raíces de orquídeas, con coloración verde más oscuro y protegidas por el velamen.
En orquídeas se han usado las auxinas para promover el enraizamiento, solas o combinadas con otras auxinas o citocininas (Mirani et al., 2017). Las auxinas estimulan la iniciación y el desarrollo de la raíz lateral activando las células del periciclo (Fukaki y Tasaka, 2009). El enraizamiento in vitro es la etapa más importante del trasplante exitoso de las plántulas. En Dendrobium nobileMirani et al. (2017) obtuvieron la mejor respuesta con 3 mg L-1 de ANA. En P. citrina las raíces alcanzaron la mayor longitud de 3.2 cm con 3 mg L-1 de ANA y 0.3 mg L-1 de BA (Cazarez et al., 2016). En Vanilla planifolia el tratamiento de 0.5 mg L-1 de AIA promovió el enraizamiento (Carranza-Álvarez et al., 2021), mientras que en Ansellia africana el porcentaje de enraizamiento más alto se logró con 3.0 mg L-1 de AIB y 30 µM de floroglucinol (Bhattacharyya et al., 2018).
También se han utilizado auxinas en combinación con compuestos orgánicos, como en el caso de Stanhopea tigrina, donde 100 mL L-1 de agua de coco, sola o en combinación con AIA, promovieron la producción de raíces (Castillo-Pérez et al., 2021).
Aclimatación de plantas
En la cuarta y octava semana se obtuvo 100 % de supervivencia con plantas de 7 cm en corteza de pino (Figura 1G, Cuadro 5). Existen diferentes sustratos para aclimatar plantas de orquídeas (Vera, 2020; Com. Pers.) 2. La supervivencia de las plantas aclimatadas depende mucho de los sustratos; en P. citrina a los 30 días la mejor mezcla fue corteza de encino, tezontle y carbón 1:1:1, donde hubo 85 % de supervivencia (Cazares et al., 2016). Domínguez y Hernández (2006) reportaron 100 % de supervivencia en Encyclia phoenicia en una combinación de turba, carbón vegetal y grava (1:1:1).
Cuadro 5 Aclimatación de plántulas de Prosthechea vitellina con tamaño de 5 y 7 cm en sustrato de corteza de pino (CP) y turba + perlita (T + P) después de cuatro y ocho semanas.
| Sustrato + Tamaño de plántula (cm) | Supervivencia 4 sem (%) | Supervivencia 8 sem (%) |
|---|---|---|
| CP + 5 | 90.0 a | 90.0 a |
| CP + 7 | 100.0 a | 100.0 a |
| T + P + 5 | 50.0 b | 30.0 b |
| T + P + 7 | 100.0 a | 80.0 a |
Medias con letras iguales en las columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).
CONCLUSIONES
Se estableció un protocolo que determinó las condiciones óptimas para regenerar plantas de Prosthechea vitellina por organogénesis directa a partir de plántulas germinadas in vitro, expuestas a diferentes concentraciones de hormonas vegetales. Este protocolo representa una opción importante para la propagación in vitro de la especie, donde, además de la reproducción, puede utilizarse con fines de rescate, conservación, reintroducción y aprovechamiento comercial.
