Material vegetal

Se utilizaron 57 accesiones de garbanzo (Cicer arietinum L.) y dos especies silvestres de referencia, C. reticulatum y C. cunneatum provenientes del Banco de Germoplasma del Centro Internacional para Investigaciones Agrícolas en Zonas Áridas (ICARDA, Aleppo, Siria), del Instituto Internacional de Investigación de Cultivos para los Trópicos Semiáridos (ICRISAT, Patancheru, Andhra Pradesh, India) y del Campo Experimental del Valle de Culiacán (CEVACU) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).

Desarrollo de plántulas en invernadero y variables evaluadas

Debido a que los materiales utilizados en el presente estudio ya fueron ampliamente caracterizados, sobre todo desde el punto de vista morfológico (Gómez-Garza R. M., Com. Pers.¹), en este trabajo se utilizaron 10 plantas de cada genotipo para revalorar algunos descriptores contrastantes recomendados por ^{IBPGR, ICRISAT e ICARDA (1993)}, y contrastar el agrupamiento resultante con el obtenido con marcadores moleculares. Las plantas se cultivaron en invernadero (28 ± 3 ºC, 13 horas de luz y 40 % de humedad relativa) y se consideraron seis caracteres con diferentes variantes: 1) hábito de crecimiento o porte de la planta (erecto, formando un ángulo con el suelo de 0 hasta 15º; semi-erecto, con un ángulo de 16 hasta 25º; extenso, con un ángulo de 61 hasta 80º); 2) tipo de hoja: simple y compuesta; 3) color de flor, usando los criterios de la carta de colores de la Royal Horticultural Society (RHS); 4) color de semilla: con base en los criterios de la RHS; 5) forma y tamaño de semilla: angular, redondo irregular y forma de chícharo; y tamaño: grande, mediano y chico; y 6) textura de la testa de la semilla: ásperas, lisas y tuberculosas.

Extracción de ADN y desarrollo de marcadores

El ADN se obtuvo a partir de 2.5 g de hojas jóvenes mezcladas de las 10 plantas de cada accesión siguiendo la metodología propuesta por ^{Dellaporta et al. (1983)}. Se utilizaron iniciadores tipo RAPD (G-02, G-03, G-09 y G-10) (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) y para ISSR (GACA)₄, (GATA)_4, (GGAT)_4, (CA)₈ y (CT)₈ (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) para el desarrollo de los marcadores moleculares en todos los genotipos. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Perking Elmer 480® (Perking Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) en un volumen de reacción total de 25 mL que contenía 50 ng de ADN genómico, 200 mM de dNTPs, 3 mM de MgCl₂, buffer PCR 1X, 20 pM de primer y 1U de Taq polimerasa (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA). Las condiciones de termociclaje fueron: desnaturalización inicial de 93 ºC por 1 min, seguido de 40 ciclos a 93 ºC por 20 s, 40 ºC para los iniciadores RAPD, 40 ºC para (GATA)₄ (GGAT)₄ y 48 ºC para (GACA)₄, (CT)₈ y (CA)₈ por 1 min, 72 ºC por 20 s y un ciclo de extensión final de 72 ºC por 10 min.

Detección y análisis de productos amplificados

Los productos amplificados fueron separados en geles de agarosa 1.4 % (Separide® Gel Matrix, Gibco-BRL) en buffer TAE (Tris-HCl 40 mM, pH 8.0; acetato de sodio 20 mM y EDTA 2 mM). Para referencia, se incluyeron marcadores de peso molecular de 100 pb (MBI, Fermentas, St-Leon, Alemania) y 1 kb (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA). La electroforesis se corrió a 80 V durante 2.5 h y los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 mg mL^-1) en buffer TAE. Todos los geles se registraron y analizaron digitalmente con el sistema Kodak Digital Science® DC 120 (Eastman Kodak, Co., Rochester, NY, USA).

Análisis de datos

Con los datos de caracterización morfológica se realizó un análisis de correspondencia múltiple (ACM) con el propósito de seleccionar los descriptores más informativos dentro del conjunto original de datos. Para corroborar la pertinencia del agrupamiento obtenido con el ACM, se efectuó un análisis de coordenadas principales (ACoP) y posteriormente se generó un dendrograma mediante el método del promedio aritmético de pares no ponderados (UPGMA) usando el coeficiente de Dice (^{Dice, 1945}). Con los datos ISSR se generó una matriz binaria de 1 y 0 (presencia y ausencia) que fue utilizada para el análisis de conglomerados mediante el método UPGMA y obtener el dendrograma por medio del coeficiente de Dice para establecer la similitud genética.

Se evaluó la habilidad de los marcadores para diferenciar entre las accesiones estimando el contenido de información polimórfica (PIC), índice del marcador (MI) y poder de resolución (Rp) de acuerdo con la metodología propuesta por ^{Valadez-Moctezuma et al. (2014)}. El porcentaje de bandas polimórficas (PBP) también fue determinado. Todos los análisis se realizaron con el programa NTSySpc. 2.21o de Applied Biostatistics Inc. Los marcadores RAPD no fueron analizados debido a que fueron escasos (2 a 4 fragmentos), definidos, reproducibles, pero prácticamente sin polimorfismo.

Análisis de caracteres morfológicos

El Análisis de Correspondencia Múltiple (ACM) permitió explicar la variabilidad total en función de la contribución de cada factor respecto a la variabilidad. Cuatro factores explicaron el 52 % de la variabilidad total, lo que mostró que el color de corola azul y semillas grandes de forma redondeada fueron los caracteres con el mayor valor discriminante (58.0 cada uno).

Los resultados concuerdan en parte con lo reportado por ^{Narayan y Macefield (1976)} quienes evaluaron una colección mundial de germoplasma de garbanzo con ocho caracteres relacionados a la aptitud física y rendimiento, incluidas 16 variedades mexicanas. En general, ACM detectó poca variabilidad en los genotipos estudiados, como resultado de la alta homocigosis presente entre las accesiones, tal como lo reportaron ^{Saeed et al. (2011)}. Las plantas derivadas de semillas tipo Kabuli y Desi fueron agrupadas de manera indistinta e independiente de su origen geográfico. La accesión 35D resultó la más diferente porque presenta corola azul que comparte con las accesiones 16D y 43D y semilla redondeada pequeña, que solamente comparte con la accesión 20K tipo Kabuli.

Con el análisis de coordenadas principales (ACoP) mediante los datos morfológicos basados en la matriz de similitud obtenida con NTSyS pc.2.2 (Figura 1) se separaron las accesiones en dos grupos; el primero incluyó 41 accesiones principalmente del tipo Kabuli a una distancia aproximada de 0.62; el segundo grupo, representado por 18 accesiones tipo Desi, incluyó a las dos especies silvestres (C. reticulatum y C. cuneatum). En el primer grupo se encontraron las accesiones 17D, 27D, 41D y 50D que corresponden a genotipos tipo Desi, lo que indica que estas comparten ciertas características morfológicas con los de tipo Kabuli. Dentro del primer grupo hubo pequeños subgrupos con características particulares; por ejemplo, las accesiones 1K, 2K, 4K, 7K, 38K, 56K, 55K, 54K, 49K, 53K, 46K, 40K y 42K (Kabuli) presentan porte erecto, hoja compuesta, flores blancas, semillas angulares grandes de color crema y superficie rugosa; mientras que los genotipos 3K, 12K y 14K difieren en algunas características, ya que tienen porte extenso y semillas angulares medianas.

Figura 1 Panel A) Agrupamiento morfológico UPGMA de la colección de germoplasma de garbanzo (Cicer arietinum L.) y panel B) Análisis de coordenadas principales, 1S: C. reticulatum, 2S: C. cuneatum, K: semilla tipo Kabuli, D: semilla tipo Desi. 

Los materiales del segundo grupo presentaron características más comunes entre sí, en su mayoría fueron de porte extenso, hoja compuesta, flores rosas, semillas angulares y medianas de color marrón oscuras y con superficie tuberculada. C. reticulatum en este análisis no fue separada de los genotipos de C. arietinum ya que compartieron varias de las características morfológicas evaluadas, principalmente con los de tipo Desi, lo que en parte se explica por los bajos niveles de variabilidad dentro de C. arietinum (^{Aggarwal et al., 2015}). Ambos grupos incluyeron accesiones de las diferentes áreas geográficas y no se observó relación entre la divergencia morfológica y el origen geográfico; esto indica que la variación morfológica no está determinada solamente por diferencias ambientales sino también por factores genéticos (^{Ghaffari et al., 2014}).

Análisis RAPD e ISSR

Debido a que los perfiles RAPD resultaron monomórficos y poco informativos, no se consideraron para los análisis estadísticos propuestos; sin embargo, este resultado era de esperarse (^{Ahmad et al., 2010}; ^{Rao et al., 2007}) y fueron de interés para el desarrollo y aplicación de otro sistema de marcadores más eficientes para este tipo de plantas, conjuntamente con los escasos resultados obtenidos con los iniciadores de ISSR (^{Valadez-Moctezuma y Cabrera-Hidalgo, 2018}). Los marcadores ISSR (GACA)₄, (GATA)₄ y (GGAT)₄ resultaron con pocas bandas definidas y reproducibles en todos los genotipos. Los iniciadores (CA)₈ y (CT)₈ produjeron fragmentos de pesos moleculares muy cercanos entre sí, difícil de ser interpretados, por lo que no fueron considerados. El oligonucleótido (GATA)₄ sólo detectó una banda aparentemente monomórfica con las condiciones utilizadas, mientras que los iniciadores (GGAT)₄ y (GACA)₄ amplificaron un total de cinco y 10 fragmentos, de los cuales tres y cuatro fueron polimórficos, respectivamente.

Un total de 16 amplicones fueron registrados con los tres iniciadores con pesos moleculares aproximados de 600 a 2036 pb (Cuadro 1), de los cuales 43.7 % fueron polimórficos, con un promedio de 5.3 bandas por iniciador, similar a lo reportado por ^{Aggarwal et al. (2015)} y ^{Yadav et al. (2015)} en garbanzo. Los valores de Rp oscilaron entre 0.0 para (GATA)₄ y 1.51 para (GACA)₄, con un promedio de 0.75. El iniciador (GACA)₄ fue el más eficiente para evaluar la variabilidad genética de los genotipos de garbanzo, presentando los valores Rp mayores (Cuadro 2). El contenido de información polimórfica fluctuó de 0.0 (GATA)₄ a 0.13 (GGAT)₄, con un promedio de 0.08 y el índice de marcador osciló entre 0.0 para el iniciador (GATA)₄ y 0.74 para (GGAT)₄ y un promedio de 0.27; por lo que (GGAT)₄ proporcionó la mayor información sobre la variación genética de las accesiones en estudio.

Aun cuando el análisis ISSR de este estudio no separó a los genotipos de C. arietinum acorde al menos por las formas de la semilla, sí los separó interespecíficamente de C. reticulatum, aun con la cantidad de iniciadores utilizados, lo que significa que ISSR representa un sistema de marcadores más eficiente en comparación con RAPD para este caso, aun cuando el número de marcadores fue escaso. Este resultado concuerda con lo reportado por ^{Rao et al. (2007)} y ^{Aggarwal et al. (2015)} quienes encontraron entre 60 y 90 % de polimorfismo mediante RAPD e ISSR respectivamente, también en garbanzo. Los marcadores ISSR obtenidos al ser reproducibles y proporcionar más información polimórfica, sustentan el amplio uso que han tenido para estudios de diversidad y relaciones filogenéticas en variadas especies y cultivos, sobre todo con alto nivel de endogamia (^{Valadez-Moctezuma et al., 2014}).

Todas las investigaciones realizadas en C. arietinum han reportado bajos niveles de variabilidad genética en comparación con las especies silvestres (^{Choudhary et al., 2012}), y de acuerdo con ^{Ghaffari et al. (2014)} esto se debe a que el garbanzo tiene una estrecha base genética, y a pesar de los grandes esfuerzos de mejoramiento, las variedades actualmente disponibles están cercanamente relacionadas entre sí (^{Jannatabadi et al., 2014}; ^{Singh et al., 2008}). Se concluye que el análisis UPGMA derivado del análisis morfológico logró una mejor separación de los tipos de garbanzo con respecto al análisis ACM. Morfológicamente las especies silvestres C. reticulatum y C. cunneatum compartieron mayor similitud con garbanzo tipo Desi. Los marcadores tipo ISSR diferenciaron claramente a las 57 accesiones de C. arietinum de las de la especie C. reticulatum; también separaron los grupos de garbanzo tipo Kabuli y tipo Desi, aunque se apreciaron algunos grupos que compartieron ambos tipos de garbanzo (Figura 2).

Figura 2 Dendrograma UPGMA de genotipos de garbanzo basados en sus valores de similitud Nei y Li/Dice usando iniciadores tipo ISSR. El agrupamiento UPGMA se construyó con el programa NTSySpc 2.2. C. rec: C. reticulatum. Las etiquetas 1-57 corresponden a C. arietinum. K: semilla tipo Kabuli, D: semilla tipo Desi.