Área de estudio

El estudio se realizó durante los años 2013 a 2016 en las principales zonas productoras del cultivo de chile en Sinaloa, México. Se recolectaron 121 muestras foliares de plantas sintomáticas con características descritas para Begomovirus, especialmente tejido joven obtenido de brotes nuevos de las plantas, dado que en éstos se han reportado mayores tasas de multiplicación de los Geminivirus, ya que es donde más células se encuentran en la fase S del ciclo celular (^{Laufs et al., 1995}). Las localidades de colecta (Cuadro 1) fueron georeferenciadas mediante un equipo GPS (Garmin Etrex®, Taipei, Taiwán). Las muestras fueron recolectadas en bolsas de plástico estériles y transportadas a temperatura ambiente; posteriormente, éstas se almacenaron hasta su análisis a -20 ºC, en el Laboratorio de Patología y Biología Celular y Molecular de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de Ciudad Universitaria, Culiacán, Sinaloa.

Extracción de ADN

A partir del tejido foliar joven recolectado se realizó la extracción de ADN genómico con la metodología descrita por ^{Doyle y Doyle (1990)}. La integridad del ADN se observó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5 % teñidos con Gel Red. La concentración y calidad de ADN se determinó con un espectrofotómetro (Lambda Bio 10, Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA) a 260 nm y con la relación de absorbancia a 260/280 nm, respectivamente; finalmente, se almacenó a -20 ºC.

Amplificación de ADN viral por PCR

Para la detección del PHYVV se diseñó el oligonucleótido específico directo HRRF (5’-AAGATAGCTTCTTCGATGG-3’) y se empleó el oligonucleótido reverso 241 (5’- GAATTAAAGGTACATGGAC-3’) reportado por ^{Torres-Pacheco et al. (1996)}, que amplifican un fragmento del gen Rep y la región intergénica de 1365 pb; para la detección del PepGMV se diseñó el oligonucleótido directo GMRRF (5’-CTCCACATCGTTTGAATAGAC-3’) y se utilizó el oligonucleótido reverso JM24 (5’-TAGGCCCACACCTTGGTCACCAAG-3’) reportado por ^{Méndez-Lozano et al. (2003)}, que amplifican un fragmento del gen Rep y la región intergénica de 1063 pb; TYLCV se detectó con los oligonucleótidos TYC1F 5’-GGGCCTAGAGACCTGGCCCAC-3’ y TYC1R 5’-CCG GTAATATTATACGGATGGC-3’, los cuales amplifican un fragmento del gen Rep y la región intergénica de 856 pb (^{Lapidot, 2002}).

El volumen de reacción final fue de 25 μL, que contenía Buffer Taq ADN polimerasa 1X, MgCl₂ 1.5 mM, 0.2 mM de cada dNTP, oligonucleótidos 0.25 μM, Taq ADN polimerasa 1.0 U, ADN 120 ng. La amplificación se realizó en un termociclador C1000TM (Thermal Cycler BIO-RAD, Hercules, California, USA) y las condiciones fueron las siguientes: 94 ºC 5 min, 35 ciclos (94 ºC 45 s, 58 ºC 30 s y 72 ºC 1 min) y una extensión final de 72 ºC por 10 min.

Finalmente, para la amplificación de especies de Begomovirus se utilizaron los iniciadores universales MotCP2118 (5’-CCGAATTCGACTGGACCTTACATGGNCCTTCAC-3’) y MotCP2123 (5’-GAGTCTAGAGGSTANGTGAAGGAAATAA/GTTCTTGGC-3’) que amplifican un fragmento de 650 pb del componente A de Geminivirus, y que incluye la región común y parte del gen de la proteína de la cápside (^{Ascencio-Ibáñez et al., 2002}).

La mezcla de reacción final para la PCR fue en un volumen de 25 μL que contenía 120 ng del ADN molde, Buffer Taq ADN polimerasa 1X, MgCl₂ 1.5 mM, 0.2 mM de cada dNTP, oligonucleótidos 0.25 μM y Taq ADN polimerasa 1.0 U. Las condiciones de amplificación (termociclador C1000TM Thermal Cycler BIO-RAD, Hercules, California, USA) fueron: precalentamiento por 5 min a 94 ºC, seguido de 32 ciclos a tres temperaturas (desnaturalización a 94 ºC por 30 s, alineamiento a 60 ºC por 30 s y extensión a 72 ºC por 1 min) y una extensión final por 10 min a 72 ºC. Como testigo negativo se utilizó ADN de plantas de chile asintomáticas y crecidas en jaulas entomológicas libres de mosca blanca; como testigo positivo se utilizó ADN amplificado de planta de chile sintomática, confirmada por secuenciación y comparada con lo reportado en el GenBank. Los productos de PCR (10 μL) fueron separados y analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5 %.

Secuenciación y análisis

Los fragmentos se purificaron (UltraClean 15ADN Purif MO BIO LAB, Hercules, California, USA) y fueron enviados para su secuenciación en la Unidad de Síntesis y Secuenciación de ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM. El análisis in silico de las secuencias nucleotídicas obtenidas se realizó mediante comparaciones con las secuencias disponibles en la base de datos del NCBI, (National Center for Biotechnology Information), mediante el programa BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool) y el análisis de filogenia se realizó mediante el método Clustal W de MegAling. El árbol filogenético se construyó por el método del vecino más cercano, y se realizó un análisis de robustez del árbol filogenético mediante la obtención del coeficiente de confianza de Felsenstein para cada agrupamiento, en el cual se realizaron 1000 réplicas de muestras aleatorias con remplazo o “bootstrap” (^{Felsenstein, 1985}). Los análisis se realizaron con el programa MEGA6 (versión 6.0) (^{Tamura et al., 2013}).

Detección de Geminivirus

En todas las muestras de ADN analizadas se detectaron Begomovirus bipartitas: virus huasteco vena amarilla del chile, virus del mosaico dorado del chile, y otro Begomovirus no identificado, en los municipios de Escuinapa, Rosario, Concordia, Mazatlán, Elota, Culiacán, Guasave y Ahome; así mismo, se identificó al Begomovirus monopartita, virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate, en los municipios de Rosario, Culiacán y Ahome (Cuadro 2).

Detección de Begomovirus bipartitas

Los virus PHYVV y PepGMV se detectaron en los genotipos Serrano, Jalapeño, Ancho (Poblano), Anaheim, Morrón y Cayenne. De las 121 muestras analizadas, 74.4 % amplificaron con iniciadores específicos para el PHYVV, lo que representó la presencia del Geminivirus con mayor frecuencia en el estado y se confirman los resultados previamente descritos por ^{Garzón-Tiznado et al. (2002)}. PHYVV se ha reportado desde 1993 en México (^{Torres-Pacheco et al., 1993}) y en la actualidad se encuentra distribuido ampliamente en diferentes estados del país (^{Guevara-González et al., 1999}; ^{Torres-Pacheco et al., 1996}). Un segundo Geminivirus amplificó en el 53.7 % de las 121 muestras analizadas descrito como PepGMV; este Begomovirus fue detectado por primera vez en 1987 en Texas y nombrado Texas Pepper Geminivirus-TPGV (^{Stenger et al., 1990}), se encuentra entre los Begomovirus de mayor distribución en México, por lo que no es raro que se detecte en la mayoría de las enfermedades inducidas por estos patógenos en el país (^{Holguín-Peña et al., 2004a}; ^{Torres-Pacheco et al., 1996}).

De las muestras positivas para PHYVV y PepGMV, el 31.4 % (38 muestras) y 12.4 % (15 muestras), respectivamente, fueron infecciones simples. El 36.4 % de las muestras analizadas presentaron infecciones mixtas con la combinación de PHYVV y PepGMV. En México la infección mixta producida por los virus PHYVV y PepGMV se ha reportado en varios cultivos agrícolas y ambos virus se encuentran distribuidos en la mayor parte del país (^{Méndez-Lozano et al., 2001}; ²⁰⁰³; ^{Torres-Pacheco et al., 1996}). Esta infección mixta es importante, puesto que los síntomas que se producen son más severos, fenómeno que se conoce como sinergismo. El fenómeno de sinergismo podría ser una fuente potencial de variabilidad de Begomovirus, lo que facilita eventos de recombinación (^{García-Andrés et al., 2007}). Debido a su importancia se han realizado estudios más detallados para entender los aspectos básicos de sinergismo entre PHYVV y PepGMV, los cuales producen serios daños a los cultivos de chile cuando se encuentran infectando juntos una misma planta (^{Méndez-Lozano et al., 2003}; ^{Rentería-Canett et al., 2011}).

Detección de Begomovirus monopartitas

El virus TYLCV es común en infecciones virales de tomate; sin embargo, sólo se identificó en el 5.8 % de un total de 121 muestras analizadas en diferentes genotipos del cultivo de chile como el Serrano, Jalapeño, Morrón y Ancho (Poblano) en los municipios del Rosario, Culiacán y Ahome, lo cual indica un amplio rango de hospedantes, aunque la incidencia de este Begomovirus fue baja comparada con el PHYVV (74.4 %) y PepGMV (53.7 %), en estos momentos se le considera con riesgo potencial para el cultivo de chile en el estado de Sinaloa, lo que no coincide con lo descrito por otros autores, que han reportado a C. annuum como un hospedante alterno de Tomato yellow leaf curl (^{Cárdenas-Conejo et al., 2010}; ^{Morilla et al., 2005}; Orduño-Vega, 2009 Com. Pers.²). El TYLCV, descrito originalmente en plantas de tomate, se reportó entre 1930 y 1940 en Israel, donde se describió por primera vez (^{Varma y Malathi, 2003}).

En México, fue detectado por primera vez en Yucatán en 1996 (^{Ascencio-Ibáñez et al., 1999}), y en Sinaloa fue observado en 2005 (Gámez-Jiménez et al., 2006 Com. Pers.¹). En el presente estudio, este Begomovirus se detectó solamente en infecciones mixtas (5.8 %) con el PHYVV y PepGMV. Un comportamiento similar fue descrito por ^{Cárdenas-Conejo y colaboradores (2010)}, quienes reportaron en el cultivo del chile una infección mixta entre un Begomovirus monopartita (TYLCV) y un bipartita, Virus chino del tomate de La Paz (ToChLPV). En el cultivo del tomate se han reportado infecciones mixtas, que son comunes en regiones tropicales y subtropicales (^{Lugo et al., 2011}; ^{Reddy et al., 2005}; ^{Torres-Pacheco et al., 1996}); este complejo de virus en infecciones mixtas se ha descrito en maleza y cultivos de interés económico, constituye un alto riesgo en la aparición de nuevas cepas y variantes de Begomovirus por la posible recombinación entre éstos, lo que puede dar origen a cambios a nivel de nucleótidos en genes clave que pudieran producir la aparición de nuevos síntomas cada vez más severos, e inclusive ampliar su rango de hospedantes naturales (^{Brown et al., 2000}).

Secuenciación y análisis genético

Las secuencias nucleotídicas y su comparación en la base de datos del GenBank (NCBI) confirmaron la identidad de los tres Geminivirus detectados en campo: Virus huasteco vena amarilla del chile (PHYVV) (Cuadro 3); Virus del mosaico dorado del chile (PepGMV) y Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV), así como su distribución en los sitios de muestreo en los ocho principales municipios donde se cultiva chile en Sinaloa (Escuinapa, Rosario, Concordia, Mazatlán, Elota, Culiacán, Guasave y Ahome) (Figura 1).

Análisis genético y secuenciación

Se seleccionaron y secuenciaron 15 muestras que amplificaron el gen de la replicasa (Rep) y región común (RC) para PHYVV, PepGMV o región intergénica (RI) para virus monopartita como el TYLCV: 12, dos y una muestra, respectivamente; éstas fueron comparadas mediante BLAST para determinar el porcentaje de identidad entre éstas y accesiones de Begomovirus reportadas en el GenBank del NCBI.

Las secuencias que corresponden a PHYVV fueron registradas en la base de datos del GenBank, con los números de accesión: KY366177, KY006848, KY499895, KY499897, KY006849, KY366176, KY288518, KY288517, KY366179, KY366180, KY499896 y KY366178. Estas secuencias se compararon con dos accesiones de Sinaloa registradas previamente en la base de datos del GenBank. La accesión AYO44162.1 descrita para Sinaloa (Hou et al., 1996 Com. Pers.³) presentó una identidad de 95.25 % con respecto a las accesiones obtenidas en este estudio; al comparar éstas con la accesión LN848878.1, también descrita para Sinaloa (^{Rodelo-Urrego et al., 2015}), se observó una identidad promedio de 96.75 %, similar con el porcentaje promedio obtenido con la accesión AYO44162.1.

Por otro lado, al comparar los aislados del presente estudio con la primera secuencia reportada del PHYVV en México con número de accesión X70418.1 (^{Torres-Pacheco et al., 1993}) se registra el valor menor de identidad promedio con 94.91 %, a diferencia de la secuencia reportada por Hou et al. (1996 Com. Pers.³) (AYO44162.1) que fue la que presentó mayor similitud con la secuencia reportada por ^{Torres-Pacheco et al. en 1993} (Cuadro 3).

En lo que corresponde a PepGMV y TYLCV, los aislados KY006850 y KY006851 tuvieron una identidad de 99 % con la accesión LN848784 del PepGMV (^{Rodelo-Urrego et al., 2015}) y la secuencia del aislamiento KY006852 presentó una identidad de 99 % con la accesión del TYLCV, descrita como DQ631892 en el GenBank (^{Brown e Idris, 2006}).

En general, los resultados mostraron una alta similitud entre las secuencias de los aislados de este estudio y los aislados de PHYVV, PepGMV y TYLCV previamente reportados (^{Brown e Idris, 2006}; Hou et al., 1996 Com. Pers.³; ^{Rodelo-Urrego et al., 2015}; ^{Torres-Pacheco et al., 1993}). Al considerar los criterios establecidos por el Comité Internacional Taxonómico de Virus (^{ICTV, 2018}), se propone que los aislados corresponden a las especies reportadas para PHYVV, PepGMV y TYLCV en el cultivo del chile en Sinaloa.

Análisis filogenético

Se analizaron secuencias del virus PHYVV aislado de muestras del cultivo de chile procedentes de Sinaloa, México, comparadas con otras secuencias registradas en el GenBank. El análisis filogenético se realizó a partir de secuencias parciales del gen de la replicasa (Rep) y región común (RC) en un total de 1268 nt, que corresponden a secuencias del PHYVV obtenidas en el presente estudio, las cuales fueron comparadas con la primera secuencia reportada de PHYVV en México por ^{Torres-Pacheco et al. (1993)}, con número de accesión X70418.1 y dos secuencias del estado de Sinaloa, con números de accesión AY044162.1 registrada en el año 1996 (Hou et al., 1996 Com. Pers.³) y LN848878.1 en el año 2015 (^{Rodelo-Urrego et al., 2015}).

El árbol filogenético construido por el método del vecino más cercano con re-muestreo para 1000 réplicas separó a las secuencias en dos grupos principales. El grupo inferior principal se separó en dos subgrupos (C y D), en el subgrupo C se asociaron el primer aislado proveniente de Tamaulipas con registro X70418.1 del año 1993, con la accesión AY044162.1 registrada para Sinaloa en el año 1996 y un aislado del centro (KY006849), con identidad del 97 y 98 %, respectivamente; en el subgrupo D se asociaron tres aislados del norte del estado de Sinaloa, (KY366180, KY499896 y KY366178), con una identidad del 95 al 96 %.

El grupo superior principal se separó en dos subgrupos (A y B), en el subgrupo A los aislados se asociaron con la accesión LN848878.1 registrada para Sinaloa en el año 2015, las secuencias del sur (KY499897, KY288518, KY366177, KY499895), con identidad del 97 al 98 %, centro (KY366176), con identidad de 98 % y norte (KY366179, identidad identidad del 99 %) del estado de Sinaloa. En el subgrupo B se asociaron dos aislados del sur de Sinaloa (KY006848, KY288517), con identidad de 97 y 98 %, respectivamente (Figura 2); por lo anterior, se considera que el PHYVV posiblemente se introdujo a Sinaloa por el municipio de Culiacán durante el año agrícola 1994, a través de plántulas de tabaco infectadas de Begomovirus, enviadas desde invernaderos localizados en Tepic, Nayarit, lo que ocasionó una amplia distribución del virus en Sinaloa, ya que es uno de los principales productores de hortalizas en México; posteriormente, se prohibió la siembra de este cultivo por ser hospedero de mosca blanca y portador del PHV (PHYVV) (Garzón Tiznado, J. A. Com. Pers.⁴).

^{Torres-Pacheco et al. (1996)} reportan que PHYVV no se identificó en muestras de chile colectadas y analizadas antes de abril de 1990 en Sinaloa. En este estudio se determinó, que PHYVV es el Begomovirus predominante en el cultivo de chile con 74.4 % de infección en plantas analizadas y con 36.4 y 5.8 % de infecciones mixtas con PepGMV y TYLCV, respectivamente. Este tipo de interacciones sugiere una fuente potencial de variabilidad en Begomovirus, lo que facilita eventos de recombinación como se ha reportado anteriormente (^{Méndez-Lozano et al., 2003}). La presencia de varios genomas virales y ciclos cortos de replicación en cada célula vegetal infectada favorecen la presencia de mutaciones, lo que puede implicar ganancia o pérdida de función, que finalmente conlleva a la adaptación o evolución de las especies (^{Stange, 2006}).