Muestreos, aislamientos, cultivo in vitro, identificación

Los muestreos de plantas y suelo se realizaron en diversas localidades de los estados de Guanajuato y México (Cuadros 1 y 2). El material vegetal colectado de diferentes partes de la planta se lavó con hipoclorito de sodio comercial al 2.5 % (v/v) y con alcohol etílico al 70 %; se hicieron cortes de tejido y se sembraron en medio de papa dextrosa agar (PDA), posteriormente se incubaron a 27 ºC. De las muestras de suelo se tomaron 10 g y se colocaron en matraces Erlenmeyer de 150 mL, se agregaron 90 mL de agua destilada estéril y se llevó a un volumen de 1000 µL, de éste se tomaron 50 µL y de forma individual se distribuyeron en cajas de Petri con medio PDA, se incubaron a 27 ºC de 7 a 10 días (d). Los esporangios germinados se localizaron con un microscopio, se transfirieron a cajas nuevas con PDA y se incubaron a 27 ºC para su posterior utilización (^{French y Hebert, 1982}).

Las muestras de suelo se tomaron de la rizósfera de plantas de siembras comerciales. Para el aislamiento de P. capsici de suelo se utilizó la técnica de trampa-cebo o atrayente vegetal. Se pesaron 30 g de suelo, mismos que fueron colocados en un frasco de vidrio, se agregaron 40 mL de agua destilada estéril y se colocó un fruto de chile serrano previamente lavado y desinfestado de 7 a 10 d a 25 ºC, se aisló y purificó el crecimiento de micelio algodonoso con la técnica de punta de hifa. Se sembró una porción del micelio en medio agar agua. Se apreciaron hifas separadas dentro del medio de cultivo, y se hizo un corte detrás de la célula terminal de la hifa, la cual se transfirió a medio PDA y se incubó a 27 ºC. Las cepas aisladas de Penicillium spp. se transfirieron a medio PDA, donde se describió la forma y color de colonia con base en las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (1972)}. Para la obtención de las cepas de Phytophthora capsici, los tejidos se sembraron en medio de cultivo V8 y se identificaron morfológicamente, de acuerdo con ^{Erwin y Ribeiro (1996)}.

Extracción y purificación de ADN, PCR-RFLP, PCR-ISSR, agrupamientos

Para la extracción de ADN se utilizó la técnica del amortiguador CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) (^{Doyle y Doyle, 1987}; ^{Weising et al., 2005}). El CTAB al 2 % se calentó a 60 ºC, se extrajo micelio de la cepa purificada y se colocó dentro del tubo con CTAB. Se incubó a 80 ºC durante 60 min, se centrifugó durante 5 min a 10,000 × g. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se adicionaron 500 µL de cloroformo-isoamílico (24:1), se mezcló y se centrifugó nuevamente por 10 min a 10,000 × g. El sobrenadante se pasó a un tubo nuevo, se lavó con 700 µL de cloroformo-isoamílico (24:1) y se volvió a centrifugar por 10 min a 10,000 rpm. El sobrenadante se llevó a otro tubo con 950 µL de etanol al 100 % previamente enfriado, se incubó por 2 h a -20 ºC, se centrifugó a 10,000 × g por 30 min, se decantó el sobrenadante, se resuspendió la pastilla en 400 µL de amortiguador Tris-EDTA (TE) y se incubó a 55 ºC por 15 min. Se añadieron 34 µL de acetato de sodio 3 M más 1 mL de etanol al 95 % y se incubó a -20 ºC por 1 h, se centrifugó a 10,000 rpm por 5 min y se descartó el sobrenadante. La pastilla se lavó con 600 µL de isopropanol al 70 %. Se centrifugó por 5 min a la misma velocidad que en los pasos anteriores y se dejó secar a temperatura ambiente. Se resuspendió la pastilla en 100 µL de TE y se almacenó a -20 ºC. Para determinar la calidad del DNA se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

Para el revelado, el gel se sumergió en una solución de bromuro de etidio (0.5 μg mL^-1) durante 10 min, después se enjuagó en agua destilada por 10 min y se analizó en un fotodocumentador (Modelo Universal Hood II, BIORAD®, Palo Alto, CA, USA) con el programa QuantityOne®. Para amplificar la región ribosomal del ADN de los hongos se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa con los iniciadores de espaciadores internos transcritos (PCR-ITS, por sus siglas en inglés) 5HP y NL4. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial de 95 ºC por 4 min, 35 ciclos (94 ºC por 1 min; 58 ºC por 1 min; 72 ºC por 2 min) y un ciclo de extensión final de 72 ºC por 10 min. Los productos de la PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2 %.

Para la técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLPs) se utilizó el producto de PCR de la región ITS más las enzimas de restricción Hinf I, Hha I y Hae III. La reacción de digestión se preparó de acuerdo con las especificaciones de cada fabricante. La visualización de los cortes producidos por las enzimas se hizo en geles de acrilamida. Para la técnica de PCR con marcadores de secuencia de repetición simple interna (PCR-ISSR, por sus siglas en inglés) se utilizaron los iniciadores (AC)₈YG y AC(GACA)₄. Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial de 95 ºC por 3 min, 35 ciclos (95 ºC por 30 s, 55 o 46 ºC por 45 s, 72 ºC por 2 min) y un ciclo de extensión final de 72 ºC por 10 min.

Para la separación de los fragmentos amplificados se utilizó una cámara vertical. Los geles se revelaron con varias soluciones: 1) solución fijadora de etanol al 10 % y ácido acético al 1 % durante 10 min, 2) solución de tinción con nitrato de plata al 0.2 % durante 10 min, 3) enjuague con agua destilada, y 4) solución reveladora de hidróxido de sodio al 3 % con formaldehido (100 μL por cada 100 mL) hasta la visualización de las bandas. Se generó una matriz binaria que se llevó al programa FreeTree© versión 0.9.1.50 para ser analizada mediante el índice Jaccard y el método de construcción de árbol de agrupamiento par con media aritmética no ponderada UPGMA. Para visualizar el dendrograma se utilizó el programa TreeView© versión 1.6.6.

Patogenicidad de Phytophthora capsici

Las cepas de P. capsici que se aislaron previamente se sembraron en los medios PDA y V8 para registrar el crecimiento diario y, posteriormente, calcular su velocidad de crecimiento en cada uno de los medios. Para cuantificar el grado de patogenicidad e identificar la cepa más agresiva, se evaluaron ocho aislamientos de P. capsici (Phy-1, Phy-2, Phy-3, Phy-4, Phy-5, Phy-6, Phy-7 y Phy-8) bajo un diseño completamente al azar con nueve repeticiones. Cada aislamiento correspondió a un tratamiento, y la unidad experimental correspondió a una planta individual inoculada. Se utilizó la variedad de chile Anaheim (tipo común, California chili), ampliamente reconocida como susceptible. Se colocaron en frascos de vidrio plantas con tres hojas verdaderas, cada frasco con agua destilada estéril y fragmentos de medio de cultivo V8 con micelio de P. capsici. Se registró la incidencia y severidad para determinar la cepa más agresiva y así utilizar sólo ésta en los siguientes estudios. Para la incidencia de la enfermedad (IE) se aplicó la fórmula de ^{Wolcan et al. (2001)}. La severidad se estimó con la escala de daño de ^{Bosland y Lindsey (1991)}. La cepa que resultó más agresiva (Phy-2) se utilizó para las confrontaciones posteriores.

Confrontaciones in vitro

Con base en los resultados obtenidos en los RFLPs de Penicillium sp. se generaron grupos genéticamente cercanos de los cuales se tomaron aislamientos representativos (flechas en la Figura 1), más otros seleccionados con base en su distribución en la Figura 2, que se utilizaron para definir los 30 tratamientos incluidos en el Cuadro 4 para las confrontaciones in vitro. Dichas confrontaciones se hicieron únicamente contra la cepa Phy-2 de P. capsici, que resultó la más agresiva. Cada confrontación tuvo cuatro repeticiones.

En cajas de Petri de 10 cm de diámetro con medio PDA se colocaron los organismos a 1 cm de la orilla de la caja. Primero se colocaron las cepas de Penicillium spp. mediante la impregnación de una suspensión de conidios en papel filtro a una concentración de 4 × 10⁶ (^{Fang y Tsao, 1995}) y se incubó a 27 ºC. Al siguiente día la cepa Phy-2 de P. capsici se transfirió en cada tratamiento y repetición para iniciar la confrontación dual. El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar y se evaluó cuando el tratamiento con P. capsici sin antagonista llenó la caja Petri, lo que ocurrió alrededor del décimo día. Para el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento del fitopatógeno se aplicó la fórmula de ^{Seema y Devaki (2012)}.

Para la técnica de microcultivo, a una caja con PDA se le fraccionó en cuadros de 10 × 10 mm. Cada uno de los fragmentos se colocó en el centro de un portaobjetos y un cubreobjetos en la parte superior, todo ésto dentro de una caja de Petri a la que se le agregó glicerol al 10 %. El fragmento se inoculó en la parte sur por el antagonista Penicillium spp. con un día de ventaja, ya que es de crecimiento lento. Al día siguiente se inoculó la cepa de Phytophthora (Phy-2) en la parte norte del fragmento. Para establecer el grado de antagonismo se utilizó la escala de ^{Agamez et al. (2009)}. Las cajas se incubaron a 25 ºC por 8 d. Una vez que el crecimiento de micelio invadió el fragmento, se cubrió con un cubreobjetos y se colocó en un nuevo portaobjetos, el cual contenía una gota de colorante azul algodón. Al portaobjetos que contenía el fragmento de medio se le retiró éste, y en su lugar se colocó una gota del colorante azul algodón, se colocó un nuevo cubre objetos y se selló para posterior observación del mecanismo del efecto antagónico.

Confrontación in vivo

Con base en los resultados del experimento de la confrontación in vitro, se seleccionaron las 10 cepas de Penicillium spp. con el mejor porcentaje de inhibición para la confrontación in vivo (Cuadro 5). La evaluación se realizó en un experimento bajo un diseño completamente al azar con 10 repeticiones, donde los tratamientos fueron las cepas de Penicillium spp. y la unidad experimental fue una planta de chile individual. El testigo de referencia no incluyó a ninguno de los dos organismos. Cuando la plántula tuvo dos hojas verdaderas se trasplantó a vasos de unicel, se sumergió la raíz en una suspensión de conidios de los microorganismos antagonistas con una concentración de 5 × 10⁷ mL^-1 por 5 min (^{Fang y Tsao, 1995}). Al segundo día se realizó una re-inoculación de 5 mL a la misma concentración en la base del tallo. Al tercer día se inoculó P. capsici (cepa Phy-2) en la base de la planta, se vaciaron 5 mL de la suspensión de zoosporas (2000 zoosporas mL^-1, ^{Bosland y Lindsey, 1991}).

Análisis estadístico

La información obtenida se analizó mediante el programa SAS (^{SAS Institute, 2011}) con comparación de medias (Tukey, 0.05). Las variables estudiadas fueron severidad de la enfermedad (%), inhibición (%) y antagonismo (%).

Tipo de control biológico

Con el fin de identificar el tipo de control biológico del microorganismo antagonista, se hizo un microcultivo con la técnica de Ridell o método de laminilla (^{Paul, 1999}). Los montajes se observaron en microscopio compuesto y se documentó fotográficamente el tipo de control biológico de cada organismo evaluado.

Muestreos, aislamientos, cultivo in vitro e identificación

Se obtuvieron 55 cepas, de las cuales ocho fueron de Phytophthora capsici y 47 de Penicillium spp. (Cuadros 1 y 2, respectivamente). La identidad morfológica por comparación de estructuras se confirmó mediante análisis moleculares.

Agrupamientos moleculares

La región de los espaciadores internos transcritos (ITS) amplificada con los iniciadores 5 HP y NL 4 para Penicillium spp. y Phytophthora capsici fue de aproximadamente 1300 y 1500 pb, respectivamente. Las enzimas de restricción Hha I, Hae III y Hinf I produjeron polimorfismos en la región ITS de ambos microorganismos. En la Figura 1 se muestran los dendrogramas generados con la técnica de ISSR para ambos géneros. Las flechas indican los aislamientos de Penicillium que se consideraron como representantes de grupos diferentes y, por lo tanto, fueron seleccionados para el ensayo de confrontación dual. La Figura 2 corresponde al dendrograma generado con los iniciadores (AC)₈YG y (GGAT)₄ para las cepas de Penicillium spp., en la cual se basó la selección de otros aislamientos para completar los tratamientos de la confrontación dual. La Figura 3 corresponde al dendrograma generado por los iniciadores (AC)₈YG y (GGAT)₄ para las cepas de Phytophthora capsici; en él se aprecia que, aun tratándose de la misma especie, existen diferencias.

Contrario a lo esperado, la mayor cercanía genética se observa entre aislamientos de diferentes localidades (Dolores Hidalgo, Phy-2 y Abasolo, Phy-5; San José de Iturbide, Phy-4, y Abasolo, Phy-6). En estos agrupamientos el factor hospedante pudiera explicar las cercanías, ya que los aislamientos 2 y 5 se tomaron de plantas de chile, mientras que las cepas 4 y 6 se aislaron de tomate (Solanum lycopersicum). Por otro lado, las mayores distancias se identificaron entre cepas de una misma localidad (Abasolo, Phy-7 y Phy-8), lo que también se explica por el factor hospedante, pues se tomaron de suelo con tomate (Phy-7) y de suelo con chile (Phy-8).

Patogenicidad de Phytophthora capsici

Eventualmente la mayoría de las cepas lograron 100 % de incidencia, pero en diferentes tiempos (Cuadro 3). A los 6 d las cepas de P. capsici presentaron diferencias en severidad. La comparación de medias (Tukey, 0.05) mostró dos agrupaciones donde se definen las cepas agresivas (Phy-2, Phy-7, Phy-5, Phy-1 y Phy-3). La Phy-2 sobresale por el porcentaje de daño ocasionado, que alcanzó 91.6 % a los 6 d. Al día 12 las cepas de P. capsici también presentaron diferencias en severidad. En ese lapso se presentó el mismo agrupamiento de nivel de agresividad que a los 6 d, identificándose, por otro lado, a Phy 8 y Phy 4 como las menos agresivas o de infectividad más lenta (Tukey, 0.05, Cuadro 3). Con estos resultados se decidió que para las posteriores confrontaciones con Penicillium se utilizaría únicamente la cepa Phy-2 de P. capsici, obtenida de plantas de chile en Dolores Hidalgo, Gto. (Cuadro 1).

Confrontación in vitro

A los 10 d después de la instalación del ensayo, las cepas de Penicillium presentaron diferentes efectos de inhibición sobre el desarrollo de Phytophthora capsici en la confrontación in vitro. Las cepas más sobresalientes fueron Pe42, Pe45, Pe12, Pe33 y Pe32, con inhibiciones de 63 a 54 %, sin diferencia estadística entre ellas (Cuadro 4). A los 25 d las cepas de Penicillium spp. igualmente presentaron diferentes efectos de interacción antagónica sobre el desarrollo de P. capsici. En este tiempo, la cepa Pe45 resultó la mejor al presentar 81.25 % de antagonismo o inhibición de crecimiento de P. capsici. Otras cepas sobresalientes fueron Pe40, Pe47, Pe33, Pe42, Pe32, Pe12 y Pe19, con inhibiciones de 56 al 75 %.

Confrontación in vivo

Bajo condiciones in vivo, la comparación de medias (Tukey, 0.05) a los 10 d indicó que los tratamientos con mejor control sobre P. capsici fueron las cepas Pe47 y Pe19, donde se observó una media de daño menor a 10 %, seguidos por los tratamientos con las cepas Pe01, Pe45, Pe42 y Pe33, con porcentajes de daño entre 10 y 20 % (Cuadro 5). Los tratamientos con el menor control biológico fueron con Pe40, Pe12 y Pe32, con un porcentaje de daño de entre 28 y 35 % (Cuadro 5, Figura 4).

Tipo de control biológico

Con la técnica del microcultivo es posible apreciar a nivel microscópico las interacciones entre ambos microorganismos. En este estudio, el micelio de P. capsici sin antagonista se conservó intacto (Figura 5 A), mientras que en la presencia de Penicillium hubo competencia (Figura 5 B) y desintegración (Figuras 5 C y D). Dadas las dificultades para cuantificar los efectos del micoparasitismo, muchos estudios previos sobre este tema se basan cualitativamente en fotografías (^{Adams, 1990}; ^{Paul, 1999}) en las que se identifican diversos mecanismos de acción, como la antibiosis, la competencia diversa entre la microflora y los patógenos, o el parasitismo directo y unilateral (^{Adams, 1990}; ^{Guillén-Cruz et al., 2006}). En este estudio se presentó competencia porque ambos microorganismos persistieron en algunas ubicaciones en la raíz sin que se afectaran de otra manera (Figura 5 B); no obstante, también se observó la desintegración del micelio del patógeno (Figuras 5 C y D), como una antibiosis de acción lítica (^{Guillén-Cruz et al., 2006}; Roselló, 2003; Com. Pers.¹).

Consideraciones generales

^{Dupont et al. (2006)} mencionan que la identificación de especies de Penicillium se mantiene como algo subjetivo si se usan características fenotípicas, debido a que las cepas pueden perder dichas características y las hace difíciles de identificar cuando son mantenidas y almacenadas durante largos periodos en medios de cultivo. De hecho, estos autores sólo pudieron identificar a nivel de especie a 35 aislamientos de 60 analizados cuando amplificaron la región ITS. Actualmente se considera que los estudios morfológicos ya no son suficientes para el estudio de la diversidad de especies, y es necesario complementarlos con estudios moleculares (^{Allende et al., 2013}; ^{Peterson, 2000}). En el presente estudio no se llegó a identificar a nivel de especie a los géneros de Penicillium, pero se confirmaron las identidades de los microorganismos hasta nivel de género con marcadores moleculares.

Los diversos iniciadores arrojaron distribuciones, agrupamientos y distancias genéticas diferentes para cada uno de los microorganismos utilizados; así, las enzimas Hha I, Hae III y Hinf I no identificaron polimorfismos diferentes entre cuatro de las cepas más agresivas de P. capsici, independientemente de su origen geográfico y hospedante (Phy-2, de Dolores Hidalgo, en chile; Phy -3, de Juventino Rosas, de tomate; Phy-6, de Abasolo, de tomate; y Phy-7, de Abasolo, de suelo cultivado con chile, Figura 1), mientras que los marcadores de secuencia de repetición simple interna (AC)₈YG y AC(GACA)₄ arrojaron una distribución diferente y distanciamiento genético no relacionado con la agresividad (Figura 3).

Resultados similares se han reportado en España, al no encontrar correlación entre los agrupamientos moleculares y el grado de agresividad de P. capsici en chile (^{Silvar et al., 2006}). Con Penicillium, el mayor antagonismo se presentó en cepas genéticamente distantes, lo cual era de esperarse, ya que la selección de éstas para los ensayos se hizo precisamente con base en la representatividad de los diferentes agrupamientos. También es de resaltar que las nueve cepas más destacadas por su acción in vitro conservaron su antagonismo in vivo, pues, aunque hubo diferencias entre ellas, sólo permitieron de 5 a 35 % de infección, mientras que, en su ausencia, P. capsici tuvo una infectividad de 85 %.

^{Ferrera-Cerrato y Alarcón (2007)} mencionan que ciertos hongos presentes en el suelo son antagónicos a fitopatógenos y pueden prevenir la infección de las plantas. Este antagonismo involucra la competencia por nutrimentos o la producción de compuestos inhibitorios como metabolitos secundarios y enzimas extracelulares; además, estos hongos, junto con otros microorganismos, forman parte de los bioplaguicidas que representan una alternativa importante para disminuir el uso de plaguicidas químicos en el combate de los fitopatógenos. Lo anterior coincide con lo observado en las cepas de Penicillium que se aislaron y evaluaron durante el desarrollo del presente trabajo.

Con respecto a la inhibición del patógeno bajo diferentes condiciones (in vitro e in vivo), fueron varias las cepas de Penicillium que mantuvieron los mejores resultados tanto en confrontación dual in vitro como en antagonismo a P. capsici in vivo, sobresalieron las cepas Pe42, Pe45, Pe47, Pe40, Pe33, Pe32, Pe19 y Pe12. Esto coincide con lo reportado por ^{Kang et al. (2003)}, quienes mencionan que al activarse un gen de una cepa de Penicillium, se inhibe el crecimiento de micelio de P. capsici. ^{Fang y Tsao (1995)} también evaluaron a Penicillium funiculosum como agente de control biológico contra Phytophthora cinnamomi, P. parasitica y P. citrophthora en la pudrición de raíz de azalea (Rhododendron L.) y naranja dulce (Citrus x sinensis), y observaron inhibición de la actividad patogénica de los oomicetos ante la presencia de Penicillium. Roselló (2003, Com. Pers.¹) y Vázquez (2013, Com. Pers.²) hacen referencia a Penicillium oxalicum en el control de enfermedades vasculares de plantas hortícolas como las causadas por Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae, V. albo-atrum, Botrytis cinerea, Phytophthora parasitica y P. infestans en tomate, melón (Cucumis melo) y sandía (Citrullus lanatus). Esto proporciona indicios de los alcances que pueden tener las especies del género Penicilllium como organismos de control biológico para una amplia diversidad de patógenos.