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Introducción
Los pseudocereales son fuente importante de fibra, incluso mayor que otros cereales y vegetales. Se caracterizan por poseer un elevado índice de valor nutricional y biológico, y son libres de gluten. Aunque existen diferentes tipos de pseudocereales en el mundo, los más conocidos y consumidos son la quinoa y el amaranto (Kaur et al., 2023). El amaranto (Amaranthus hypochondriacus L. y A. cruentus L.) es una planta anual de amplia distribución (Petrova y Petrov, 2020), mientras que la quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) es una planta nativa de Sudamérica que pertenece a la misma familia que el huauzontle (Chenopodium berlandieri subsp. nuttalliae (Saff.) H. Dan. Wilson & Heiser).
El huauzontle es un pseudocereal nativo de México, de bajo costo y gran contenido nutrimental y de fitoquímicos (Assad-Bustillos et al., 2014). Debido a estas cualidades, se ha incrementado el interés sobre su idoneidad como base para la elaboración de alimentos funcionales con diversos beneficios a la salud (Lugo-Garcia 2023). México es uno de los mercados emergentes de alimentos funcionales en Latinoamérica, reportando un crecimiento de 12.7 mil millones de dólares en 2011 a 16.3 mil millones de dólares en 2015 (Rojas-Rivas et al., 2018). En 2020 se reveló que la obesidad y enfermedades derivadas del consumo de alimentos ultraprocesados con exceso de azúcares, grasas, sodio y calorías, causan más de 200,000 muertes al año en México (INEGI, 2019). Esto sugiere que el desarrollo de nuevos alimentos funcionales utilizando pseudocereales como materia prima es de gran importancia para la salud mexicana, y el huauzontle puede contribuir como parte de una estrategia integral.
Estudios reportados por Vandeputte et al. (2017) y Ugural y Akyol (2022) documentaron que pseudocereales como el amaranto y la quinoa pueden presentar características prebióticas. Estas pueden incluir no ser hidrolizados ni absorbidos en la parte superior del tracto gastrointestinal, ser un sustrato selectivo para un número limitado de microorganismos, modificar la microbiota a favor de una composición más saludable, y/o inducir efectos intestinales o sistémicos benéficos para la salud del hospedador (Vandeputte et al., 2017; Ugural y Akyol, 2022). Sin embargo, en el caso del huauzontle, no se ha reportado si este pseudocereal puede presentar estas propiedades. En este sentido, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar su efecto promotor sobre el crecimiento de Lactiplantibacillus plantarum (Orla-Jensen, 1919) Zheng et al. 2020 Lp22 y Lp24 (Santiago-López et al., 2024), Lacticaseibacillus casei (Orla-Jensen 1916) Zheng et al. 2020 y Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 (Meile et al. 1997) Masco et al. 2004, como parte de su caracterización potencialmente prebiótica, asociado a su contenido de fibra y compuestos fenólicos.
Materiales y Métodos
Preparación de la muestra de huauzontle
El huauzontle se adquirió en un centro comercial local de Hermosillo, Sonora, México. La inflorescencia se lavó con agua potable y posteriormente se le retiró el exceso de agua con papel absorbente (Fig. 1). Las inflorescencias se secaron en un horno de convección (VWR International, Radnor, EUA) a 60 °C por 12 h (27.9% de humedad), seguido de una molienda usando un molino para café (Cuisinart DCG-20BKN, Glendale, EUA).
Cultivos de trabajo
Las bacterias probióticas que se utilizaron como referencia en el estudio fueron Lacticaseibacillus (Lcb.) casei Shirota (cepa probiótica comercial) y Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 ATCC 11863. Adicionalmente, se emplearon dos cepas con potencial probiótico aisladas de huauzontle Lactiplantibacillus (Lpb.) plantarum Lp22 y Lpb. plantarum Lp24 (Santiago-López et al., 2024). Los cultivos probióticos testigo y aislados pertenecen al cepario del Laboratorio de Química y Biotecnología de Productos Lácteos del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD). Las cepas de Lcb. casei Shirota y Lpb. plantarum se cultivaron a 37 °C en caldo MRS (de Man Rogosa & Sharpe, Difco, Detroit, EUA), utilizando dos subcultivos: uno de 24 h y el otro de 18 h. Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 se propagó bajo condiciones anaeróbicas en caldo MRS (pH 6.4) adicionado con cisteína (0.5%, p/v). La cepa de Escherichia coli (Migula 1895) B & Chalmers 1919 ATCC 43892 fue utilizada como referencia de bacterias entéricas. Esta cepa se cultivó en caldo soya tripticasa (Difco, Detroit, EUA) durante 16 y 14 h a 37 °C en condiciones aerobias.
Fermentación del huauzontle
Los prebióticos testigo y el huauzontle fueron tratados térmicamente (85 °C, 15 min), previo a ser incorporados al medio de cultivo (Garcia et al., 2022). Las cepas de estudio Lpb. plantarum Lp22 y Lp24, Lcb. casei Shirota, E. coli ATCC 43892 (bacteria entérica representativa) y Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 (bacteria probiótica colónica representativa) se inocularon en caldo MRS. Escherichia coli se sembró en caldo soya-tripticasa y se sustituyó la fuente de carbono (glucosa) en ambos medios por 0.3% (p/v) de huauzontle seco o prebióticos comerciales (testigos), a saber, fructooligosacáridos (FOS) de achicoria (Orafti®P95, BENEO GmbH, Mann, Alemania) o inulina de agave (Fiber Prime®, Best Ground International SA de CV, Zapopan, México), los cuales fueron proporcionados por el Laboratorio de Bioquímica de Proteínas y Glicanos del CIAD. Al final de la fermentación se determinó la actividad prebiótica (AP) e índice prebiótico (IP), pH, la concentración celular (expresada en UFC/ml), así como la concentración de fenoles y fibra soluble e insoluble.
Parámetros determinados
El contenido de fenoles se determinó por espectrofotometría (SpectroMax M3, Molecular Devices LLC, San Jose, EUA), utilizando el método de Folin-Ciocalteu, y siguiendo la metodología descrita por Gunathilake et al. (2018). Para ello, se elaboró una curva estándar de ácido gálico de cinco puntos (0 a 125 μg/ml) y la concentración se expresó como μg/ml de equivalentes de ácido gálico (EAG).
La determinación de la fibra soluble e insoluble se realizó siguiendo la metodología reportada por la AOAC, método No. 991.43 (AOAC, 2023). En este caso se utilizó 1 ml de muestra fermentada y se llevó a digestión con enzimas α-amilasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), seguido de proteasa (Proteasa de Bacillus licheniformis (Weigmann 1898) Chester 1901, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) y amiloglucosidasa. Las muestras se filtraron y el retenido se utilizó para determinar la fibra insoluble, mientras que el líquido filtrado se empleó para determinar la fibra soluble. Así mismo, se determinó el contenido de proteína (método micro-Kjeldahl No. 9910.20) y cenizas (método No. 923.03) reportados por la AOAC, y se calculó el porcentaje de fibra.
Evaluación de la actividad prebiótica
La actividad prebiótica (AP) es una determinación basada en la capacidad de un sustrato específico (prebiótico o sustrato potencialmente prebiótico), para promover el crecimiento de una cepa probiótica específica relativo a microorganismos entéricos (p. ej., E. coli), y en relación con el crecimiento con un sustrato no prebiótico como la glucosa (Huebner et al., 2007). Los cambios en la concentración celular derivaron de las diferencias en log UFC/ml entre 0 y 8 h de fermentación. La AP se calculó utilizando la siguiente fórmula:
Donde: P = probiótico comercial, G = glucosa, E = E. coli, x = huauzontle (muestra a evaluar).
Determinación del índice prebiótico
El índice prebiótico (IP) es un parámetro que determina el cambio de viabilidad de grupos bacterianos específicos durante un proceso de fermentación (Vulevik et al., 2004). Para determinar este índice se utilizó la siguiente fórmula:
Análisis estadísticos
Los datos obtenidos fueron analizados aplicando un análisis de varianza de una vía para comparar entre tratamientos (índice y actividad prebiótica, crecimiento microbiano, y pH). Para la comparación de fenoles y fibra, se utilizó una prueba de t-pareada. Los datos se analizaron en el programa estadístico NCSS 2022 v. 22.0.9 (Hintze, 2008).
Resultados
La concentración celular de Lpb. plantarum Lp22, Lp24, Lcb. casei Shirota (Fig. 2A, B, C) y B. animalis subsp. lactis Bb12 (Fig. 2D) incrementó dos ciclos logarítmicos (de 6 a 8 Log UFC/ml) al fermentar en el caldo MRS adicionado con huauzontle, siendo similar a los dos prebióticos testigo (FOS e inulina). Las cepas de Lcb. casei Shirota y Lpb. plantarum Lp22 y Lp24 no mostraron diferencias en el crecimiento celular. Sin embargo, el crecimiento de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 fue menor en presencia de huauzontle y diferente (p<0.05) comparado con los tratamientos de inulina y FOS.
Figura 2: Concentración celular en caldo MRS adicionado con huauzontle, inulina de agave o fructooligosacáridos de achicoria. A. Lpb. plantarum Lp22; B. Lpb. plantarum Lp24; C. Lcb. casei Shirota; D. Bifidobacterium animals subsp. lactis Bb12. Los valores representan la media y la desviación estándar (n=3), ***(p<0.001) muestran diferencia entre prebióticos a 8 h de fermentación.
En el cuadro 1 se muestran los cambios de pH de las diferentes muestras. Después de 8 h de fermentación, no se observaron cambios (p>0.05) en el descenso de pH entre los diferentes tratamientos. Los rangos oscilaron entre 5.27 y 6.24 a las 8 h de fermentación para el tratamiento con huauzontle, mientras que para inulina fue de 5.25 a 6.18, y para el tratamiento con FOS fue de 5.14 a 6.17.
Cuadro 1: Registro de pH en medios MRS modificados y fermentados por las cepas de estudio. Los valores representan la media y la desviación estándar (n=3). FOS= Fructooligosacáridos. Lpb. Lactiplantibacillus, Lcb: Lacticaseibacillus.
| Cepa | Tiempo (h) | Huauzontle | Inulina de agave | FOS |
| Lpb. plantarum Lp22 | 0 | 6.40 ± 0.16 | 6.48 ± 0.21 | 6.59 ± 0.24 |
| 8 | 6.09 ± 0.47 | 6.18 ± 0.5 | 6.17 ± 0.50 | |
| Lpb. plantarum Lp24 | 0 | 6.46 ± 0.19 | 6.58 ± 0.24 | 6.57 ± 0.22 |
| 8 | 5.87 ± 0.68 | 5.82 ± 0.74 | 5.84 ± 0.69 | |
| Lcb. casei Shirota | 0 | 6.31 ± 0.03 | 6.24 ± 0.12 | 5.95 ± 0.39 |
| 8 | 6.24 ± 0.14 | 6.18 ± 0.00 | 5.49 ± 0.31 | |
| Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 | 0 | 6.58 ± 0.07 | 6.40 ± 0.02 | 6.44 ± 0.09 |
| 8 | 5.27 ± 0.02 | 5.25 ± 0.08 | 5.14 ± 0.02 |
Los valores de actividad prebiótica (AP) se presentan en el cuadro 2. Los puntajes de AP para el tratamiento con huauzontle se encontraron en un rango de -0.93 a -0.52. Para el tratamiento con los FOS fue de -0.60 a -0.04, mientras que para la inulina fue de -0.81 a -0.02. No se encontró diferencia entre el huauzontle y los prebióticos testigo. En el cuadro 3 se muestran los valores correspondientes al índice prebiótico. En general, los resultados fueron cercanos a uno, y no se mostró diferencia con los prebióticos testigo, lo cual indica que las bacterias presentan capacidad similar (p>0.05) para utilizar prebióticos específicos o el huauzontle. Así mismo, se puede destacar que la cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 fue la que mostró una tendencia cercana a uno.
Cuadro 2: Valores de puntuación de la actividad prebiótica de las muestras fermentadas con las cepas de estudio. Los valores representan la media y la desviación estándar (n=3). Los valores con letras diferentes indican diferencia estadística entre tratamientos (p<0.05). FOS=Fructooligosacáridos, Lpb.=Lactiplantibacillus, Lcb.=Lacticaseibacillus.
| Tratamientos | Cepa de estudio | |||
| Lpb. plantarum Lp22 | Lpb. plantarum Lp24 | Lcb. casei Shirota | Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 | |
| Huauzontle | -0.68 ± 0.01a | -0.76 ± 0.13b | -0.93 ± 0.16a | -0.52 ± 0.02b |
| FOS | -0.36 ± 0.08a | -0.23 ± 0.05ab | -0.60 ± 0.24a | -0.04 ± 0.02a |
| Inulina de agave | -0.02 ± 0.46a | 0.28 ± 0.51a | -0.81± 0.30a | -0.07 ± 0.13a |
Cuadro 3: Valores de índice prebiótico de las cepas de estudio con los diferentes tratamientos. Los valores representan la media y la desviación estándar (n=3). Los valores con letras diferentes indican diferencia estadística entre tratamientos (p<0.05). FOS=Fructooligosacáridos. Lpb. =Lactiplantibacillus, Lcb.= Lacticaseibacillus.
| Tratamientos | Cepa de estudio | |||
| Lpb. plantarum Lp22 | Lpb. plantarum Lp24 | Lcb. casei Shirota | Bifidobacterium animalis subsp. lactisBb12 | |
| Huauzontle | 0.92 ± 0.01a | 0.92 ± 0.02a | 0.91 ± 0.01a | 0.96 ± 0.00c |
| FOS | 0.93 ± 0.02a | 0.94 ± 0.02a | 0.91 ± 0.02a | 0.98 ± 0.00a |
| Inulina de agave | 0.93 ± 0.01a | 0.93 ± 0.02a | 0.89 ± 0.03a | 0.97 ± 0.00b |
En el cuadro 4 se muestra la concentración de fenoles totales. En general, la concentración de fenoles incrementó en promedio ca. 1.33 veces. En particular, el incremento de fenoles fue mayor al fermentar con la cepa de Lpb. plantarum Lp24, siendo ca. 1.51 veces, seguido de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12, con 1.42 veces (p<0.05). En el caso de la fibra insoluble se observó una disminución promedio de 0.2%, (p<0.05) para la fermentación con la cepa Lpb. plantarum Lp22. Por el contrario, el porcentaje de fibra soluble incrementó entre 0.2 a 0.5%, siendo significativo para las muestras fermentadas con las cepas Lpb. plantarum Lp22 y Lp24 y Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12.
Cuadro 4: Porcentaje de fibra y concentración de fenoles totales determinados en las muestras fermentadas con huauzontle. Los valores muestran el promedio y desviación estándar (n=3). No se encontraron diferencias significativas entre 0 y 8 h de fermentación. Lpb.=Lactiplantibacillus, Lcb.=Lacticaseibacillus.
| Bacteria | Tiempo (h) | Fenoles totales | Fibra insoluble | Fibra soluble |
| (µg/ml) | (%) | (%) | ||
| Lpb. plantarum Lp22 | 0 | 95.46 ± 4.05a | 0.66 ± 0.03a | 1.32 ± 0.04a |
| 8 | 123.70 ± 26.89a | 0.34 ± 0.02b | 1.82 ± 0.07b | |
| Lpb. plantarum Lp24 | 0 | 85.64 ± 8.14a | 0.55 ± 0.02a | 1.43 ± 0.17a |
| 8 | 129.84 ± 5.39b | 0.26 ± 0.03a | 1.60 ± 0.05b | |
| Lcb. casei Shirota | 0 | 73.43 ± 9.72a | 0.44 ± 0.11a | 1.42 ± 0.07a |
| 8 | 83.19 ± 15.37a | 0.32 ± 0.01a | 1.85 ± 0.13a | |
| Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 | 0 | 73.15 ± 5.35a | 0.58 ± 0.01a | 1.51 ± 0.01a |
| 8 | 104.40 ± 7.26b | 0.47 ± 0.01a | 1.84 ± 0.12b |
Discusión
Estudios previos han reportado la selectividad de algunas cepas, especialmente de los géneros Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. para fermentar la inulina (Astó et al., 2019). Se ha establecido que la capacidad de degradar fuentes ricas en carbohidratos es cepa-dependiente. Por ejemplo, se ha reportado que L. rhamnosus (Collins et al. 1989) Zheng et al. 2020 GG, una cepa probiótica, no utiliza fructooligosacáridos como fuente de energía, pero sí tiene la capacidad de fermentar fructosa, lo que evidencia la presencia de al menos un sistema de transporte de fructosa (Dong et al., 2024). En contraste, Lcb. paracasei (Collins et al. 1989) Zheng et al. 2020 1195 utiliza los fructooligosacáridos, ya sea por mecanismos de unión e hidrolizar mediante un sistema de transporte de cassette de unión dependiente de ATP y una β-fructofuranosidasa citoplasmática, respectivamente (Figueroa-González et al., 2019). Por otro lado, Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12 tiene la capacidad de fermentar diferentes sustratos, lo cual explicaría, al menos parcialmente, que presente valores mayores con respecto a las cepas de Lactobacillus evaluadas (Turroni et al., 2019).
En el caso de los fenoles, estos son metabolitos que se pueden absorber en el intestino delgado, pero aquellos que no lo hacen siguen su tránsito hacia el colon, lugar donde son hidrolizados por la microbiota colónica (Subbiah et al., 2024). Se ha documentado que, durante la fermentación, los compuestos fenólicos unidos se bioconvierten de sus formas ligadas o conjugadas a formas libres por diferentes mecanismos: 1) la ruptura de los enlaces con los componentes de la pared celular de su fuente de origen, 2) actividad de enzimas, tales como β-glucosidasa, descarboxilasa, esterasas, hidrolasas y reductasas, y 3) actividad metabólica de los microorganismos fermentadores (Adebo y Medina-Meza, 2020). En el caso de la acción metabólica por bacterias, se ha reportado que cepas de Lcb. casei CICC 20995 son capaces de metabolizar compuestos fenólicos en semillas fermentadas de quinoa (Meleni y Meleni, 2021). Además, cultivos de Lpb. plantarum pueden metabolizar polifenoles, ya que poseen enzimas como tannasa, ácido-fenólico-descarboxilasa y bencil-alcohol-deshidrogenasa, las cuales les permiten degradar compuestos fenólicos (Rodríguez et al., 2008). Para el caso de especies de Bifidobacterium, estas tienen la capacidad de hidrolizar compuestos fenólicos como (-)-epigalocatequina-3-O-galato a (-)-epigalocatequina y ácido gálico (Subbiah et al., 2024). Por su parte, Lcb. casei Shirota y especies de Lpb. plantarum han demostrado su habilidad para metabolizar diferentes tipos de taninos (Dallagnol et al., 2013).
Los resultados que se obtuvieron de la cuantificación de la fibra muestran que algunas enzimas presentes en las bacterias posiblemente pueden hidrolizar la fibra insoluble y liberar carbohidratos simples que se pueden reflejar en el incremento de la fibra soluble, tal como se ha documentado en otros estudios (Slavin, 2013; Rios-Covian et al., 2016). Durante el proceso de fermentación y por acción enzimática de las bacterias, estas pueden degradar la fibra dietaría y por tanto cambiar la composición fisicoquímica de la misma y así mejorar su actividad biológica al utilizarla como sustrato (Chen et al., 2020; Li et al., 2022). Específicamente, las fibras solubles, tales como glucano, pectina, goma guar, arabinoxilano e inulina, son conocidas por su efecto prebiótico, ya que favorece el crecimiento de bacterias probióticas (Obayomi et al., 2024). Sin embargo, en el caso de la fibra insoluble, algunas bacterias de la especie Lpb. plantarum pueden producir durante su crecimiento glucosidasas que son enzimas encargadas de hidrolizar a la celulosa y liberar moléculas de β-glucosa (Li et al., 2022). La liberación de carbohidratos a partir de fibra insoluble ayuda a mejorar el potencial prebiótico del huauzontle, apoyando su papel como alimento funcional y promover la salud digestiva (Chaires Martínez et al., 2013).
Los hallazgos derivados de este estudio evidencian que la inflorescencia de huauzontle cumple con algunos de los criterios de clasificación in vitro para considerarlo como sustrato con potencial prebiótico. Esto se debe a que su comportamiento fue similar a la exhibida por los prebióticos testigo utilizados. Además, se observó que las bacterias utilizan la fibra soluble e hidrolizan la fibra insoluble promoviendo la liberación de fenoles, ya que estos últimos se incrementaron después de 8 h de fermentación. Considerando estos resultados, se puede atribuir que tanto la fibra y los fenoles promueven el crecimiento de las bacterias. Particularmente la fibra soluble presente en el huauzontle actuaría como sustrato y los fenoles, estos podrían ser biotrasformados por el metabolismo bacteriano. Sin embargo, se requieren estudios sobre fermentación donde se contemple el ajuste en la concentración de fenoles y fibra para complementar los hallazgos obtenidos, así como el análisis de perfil enzimático y producción de metabolitos.
Financiamiento
Los autores agradecen a la Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación por el financiamiento del proyecto 319922 perteneciente a la convocatoria Paradigmas y Controversias FOP-16-2021 y al apoyo de la beca nacional para LFMN (No. 1239520) y la beca posdoctoral para LSL (No. 4839686).
Declaración de disponibilidad de datos
El conjunto de datos que apoya los resultados de este estudio fue sometido en SciELO Data y puede ser accedido en https://doi.org/10.48331/scielodata.0FWHFL.
