Esporas

Las ocho especies son homospóricas, con esporas triletes (Cuadro 2, Fig. 1 A-H). Las esporas de Pellaea cordifolia midieron 37 (39) 42 µm de diámetro (tamaño mínimo, promedio y máximo), fueron de color pardo oscuro, semiesféricas distalmente a triangulares en vista proximal, con el perisporio ligeramente rugulado, crestas inconspícuas y lesura resaltada (Fig. 1A). Las de P. notabilis midieron 43 (45) 48 µm de diámetro, fueron de color pardo claro, semiesféricas a triangular-globosas, con el perisporio rugulado y crestas irregulares prominentes (Fig. 1B). Las de P. oaxacana midieron 53 (57) 60 µm de diámetro, fueron de color pardo oscuro, semiesféricas, con el perisporio rugulado y pliegues ligeramente ondulados (Fig. 1C). Las de P. pringlei midieron 48 (51) 53 µm de diámetro, fueron de color pardo claro a oscuro, semiesféricas a globosas, con el perisporio regulado y con pliegues irregulares ondulados (Fig. 1D). Las de P. ribae midieron 53 (55) 60 µm de diámetro, fueron de color pardo oscuro, tetraédrico-globosas a globosas, con el perisporio rugulado a rugoso y crestas irregulares prominentes, a menudo equinuladas (Fig. 1E). Las de P. sagittata midieron 41 (46) 49 µm de diámetro, fueron de color pardo oscuro, semiesféricas, con el perisporio rugulado y con crestas ligeramente prominentes (Fig. 1F). Las de P. ternifolia (AMR 776 y 945) midieron 51 (54) 59 µm y 50 (53) 58 µm de diámetro, respectivamente, fueron de color pardo claro, triangulares a globosas, con el perisporio ligeramente rugoso, con crestas inconspícuas y la lesura ligeramente resaltada (Fig. 1G), mientras que las del número JCR 1561 midieron 38 (40) 43 µm. Finalmente, las esporas de Pellaea villosa, 46 (49) 53 µm de diámetro, fueron de color pardo oscuro, semiesféricas, con el perisporio rugulado y con crestas o pliegues tenuemente visibles (Fig. 1H).

Figura 1: Ornamentación de las esporas de Pellaea Link (Pteridaceae). A. esporas de Pellaea cordifolia (Sessé & Moc.) A.R. Sm., la literal (l) indica la lesura; B. espora de P. notabilis Maxon, la literal (p) indica el perisporio; C. espora de P. oaxacana Mickel & Beitel; D. espora de P. pringlei Davenp.; E. espora de P. ribae A. Mend. & Windham; F. espora de P. sagittata (Cav.) Link; G. espora de P. ternifolia (Cav.) Link; H. espora de P. villosa (Windham) Windham & Yatsk. 

Germinación

Todas las especies presentaron germinación exospórica, la cual inició entre los (5)6-8 días después de haber sido sembradas las esporas (Fig. 2 A-C). De acuerdo con los tipos de germinación propuestos por ^{Nayar y Kaur (1971)} y ^{Raghavan (1989)}, los taxones presentaron el tipo Vittaria (Cuadro 2), que se caracteriza porque la primera división, que da lugar a la célula del rizoide y a la célula protálica inicial, es perpendicular al eje polar de la espora. Las siguientes divisiones de la célula protálica inicial son perpendiculares a la primera división y producen un filamento uniseriado (Fig. 2D).

Figura 2: Germinación, filamentos y diversos estados laminares de gametofitos de Pellaea Link (Pteridaceae). A. germinación de P. ternifolia (Cav.) Link; B. primera célula protálica de P. notabilis Maxon; C. germinación y primera célula rizoidal de P. cordifolia (Sessé & Moc.) A.R. Sm.; D. filamento y células con cloroplastos de P. ternifolia; E-F. gametofitos filamentosos con 4-6 células de P. notabilis; G. inicio de la formación de la lámina en P. ternifolia; H. gametofito joven con meristemo apical diferenciado en P. ternifolia; I. gametofito joven con meristemo lateral diferenciado en P. sagittata (Cav.) Link. Cm=célula meristemática, cp=célula protálica, m=meristemo, r=rizoide. 

Fase filamentosa

Se presentó entre los 7 y 17 días. Los filamentos tuvieron 2-5 células de longitud en Pellaea ribae, P. ternifolia y P. villosa, mientras que en P. cordifolia, P. notabilis, P. oaxacana, P. pringlei y P. sagittata llegaron a tener hasta seis células (Fig. 2 E, F). En todos los casos, los filamentos fueron cilíndricos, uniseriados, con uno a dos rizoides que se desarrollaron en la célula basal (Cuadro 2).

Fase laminar

De manera general se presentó entre los 14 y 30 días después de la germinación de las esporas. Sin embargo, en P. villosa se produjo entre los 11 y 14 días, mientras que en P. ternifolia (AMR 776) tuvo lugar entre los 14 y los 45 días (Cuadro 2). La mayor parte de los taxones tuvieron un desarrollo del prótalo tipo Adiantum (^{Nayar y Kaur, 1971}), que se caracteriza por la formación de una célula meristemática apical en etapas tempranas del desarrollo. Esta es reemplazada por un meristemo pluricelular apical que produce un crecimiento bidimensional simétrico (Fig. 2 G, H). Dos representantes de P. sagittata y uno de P. ternifolia (AMR 776) presentaron el tipo Ceratopteris (Fig. 2I), caracterizado porque el meristemo es lateral y produce un crecimiento asimétrico. En la madurez se vuelve simétrico debido al desplazamiento del meristemo hacia la región apical central. En general, la forma de los gametofitos jóvenes fue espatulado-cordiforme, con alas simétricas a ligeramente asimétricas (Fig. 3 A-D).

Figura 3: Fase laminar y márgenes de gametofitos de Pellaea Link (Pteridaceae). A. gametofito laminar joven de P. sagittata (Cav.) Link; B-C. gametofito laminar joven de P. notabilis Maxon; D. gametofito cordiforme vegetativo de P. villosa (Windham) Windham & Yatsk.; E. gametofito cordiforme de P. cordifolia (Sessé & Moc.) A.R. Sm.; F. gametofito espatulado con arquegonios de P. cordifolia; G. margen con células pareadas en forma de dientes en P. cordifolia; H. gametofito cordiforme con arquegonios de P. notabilis Maxon; I. gametofito cordiforme con embrión apogámico en P. oaxacana Mickel & Beitel; J. gametofito cordiforme en forma de mariposa de P. pringlei Davenp.; K. meristemo central con seno pronunciado en P. notabilis; L. margen con células onduladas en P. notabilis. Al=alas del gametofito, ar=arquegonios, c=cojinete, cd=células dientes, m=meristemo. 

Fase adulta

Se considera a partir de que los gametofitos están totalmente diferenciados e inicia la formación y desarrollo de los gametangios. Los gametofitos adultos de Pellaea cordifolia se observaron entre los 42-76 días (Cuadro 3). Fueron cordiforme-reniformes, presentan un cojinete central corto, amplias alas que se ondulan y forman pliegues, márgenes lisos o irregulares, con células pareadas dando la apariencia de pequeños dientes y una muesca meristemática o seno poco profundo (Fig. 3 E-G). Los de P. notabilis, P. oaxacana y P. pringlei se presentaron entre los 42-50 días. Fueron espatulado-cordiformes, con el cojinete central corto, una zona meristemática o seno pronunciado, con amplias alas, márgenes irregulares con células resaltadas en pequeños dientes de dos células (Figs. 3H-L; 4A, B). En P. ribae, P. sagittata, P. ternifolia y P. villosa la madurez del prótalo ocurrió entre los 40-50 días. Los gametofitos fueron espatulado-cordiformes a cordiforme-reniformes (Fig. 4 C-G), con el cojinete central corto a largo. Los márgenes de los gametofitos de P. ribae fueron irregulares con dientes de dos células prominentes (Fig.4D), los de P. sagittata y P. villosa fueron lisos y los de P. ternifolia fueron ligeramente ondulados a ondulados; la zona meristemática resultó con un seno poco pronunciado (Fig. 4 H, I; Cuadro 3).

Figura 4: Formas y márgenes de gametofitos cordiformes adultos con gametangios de Pellaea Link (Pteridaceae). A. margen con algunas células onduladas de P. oaxacana Mickel & Beitel; B. margen con célula pareadas en forma de dientes en P. pringlei Davenp.; C. gametofito con anteridios y arquegonios de P. ribae A. Mend. & Windham; D. margen con células pareadas en forma de dientes de P. ribae; E. gametofito cordiforme vegetativo de P. sagittata (Cav.) Link; F. gametofito con arquegonios de P. sagittata; G. gametofito con arquegonios de P. ternifolia (Cav.) Link; H. gametofito con anteridios de P. villosa (Windham) Windham & Yatsk.; I. margen con células de paredes lisas de P. sagittata (Cav.) Link; J. cuellos de arquegonios sobre el cojinete en P. notabilis Maxon; K. acercamiento al cuello del arquegonio de P. ternifolia (Cav.) Link; L. diferenciación de anteridios en P. ternifolia. An=anteridios, ar=arquegonios, cd=células en forma de dientes. 

Gametangios

La mayoría de las especies presentaron gametofitos protóginos, con excepción de P. ribae que presenta protándricos, y de P. ternifolia (AMR 945) y P. villosa, en que ambos gametangios se desarrollaron de manera simultánea. Los arquegonios iniciaron su formación entre los 40-75 días, presentaron cuellos cortos formados por cuatro hileras de células, se concentraron en la región apical del cojinete, cerca de la zona meristemática y se orientaron hacia la región basal del gametofito (Fig. 4 J, K). En general los anteridios iniciaron su diferenciación entre los 50 y 70 días, excepto en P. villosa que lo hicieron a los 24 días y en P. ribae a partir de los 27 días. En todos los casos los gametangios masculinos estuvieron conformados por tres células: basal, media y la opercular (Figs. 4L, 5A). La mayoría se localizaron en la región media basal del gametofito o sobre las alas.

Los gametofitos de P. cordifolia (AMR 950), P. sagittata (AMR 870), P. ternifolia (AMR 945) y P. villosa (JRT s.n.) fueron monoicos; los de P. notabilis (LAFG 14) y P. ribae (AMR 250, AMR 986) fueron dioicos; los de P. cordifolia (AMR 2600), P. oaxacana (AMR 2599), P. pringlei (AN 1634), P. sagittata (AMR 2589) y P. ternifolia (JCR 1561) desarrollaron solo arquegonios o permanecieron estériles; y finalmente los de P. ternifolia (AMR 776) no desarrollaron gametangios (Cuadro 3).

Esporofitos

Las especies cuyos gametofitos presentaron gametangios, pero no formaron esporofitos después de 200 días en cultivo, fueron Pellaea cordifolia (AMR 950) y P. pringlei (AN 1634). Por otra parte, P. cordifolia (AMR 2600), P. oaxacana (AMR 2599), P. sagittata (AMR 2589) y P. ternifolia (JCR 1561) produjeron arquegonios, pero no anteridios; los esporofitos fueron apogámicos y se formaron a partir de las células del cojinete (Figs. 3I; 5B-D). Los gametofitos de P. ternifolia (AMR 776) no formaron gametangios, pero sí produjeron esporofitos apogámicos. Finalmente, los prótalos de P. notabilis (LAFG 14), P. ribae (AMR 250, AMR 986), P. sagittata (AMR 870), P. ternifolia (AMR 945) y P. villosa (JRT s.n.) desarrollaron ambos órganos sexuales, así como esporofitos producto de la fecundación (Fig. 5 E-I). En las especies en las que se formó el esporofito de origen sexual o apogámico, la primera hoja presentó forma espatulada a espatulada-cordiforme, las siguientes fueron cordiformes y finalmente, adquirieron la forma y los grados de división que presentan sus respectivos representantes adultos.

Figura 5: Gametangios y esporofitos jóvenes de Pellaea (Pteridaceae). A. vista lateral del anteridio en P. sagittata (Cav.) Link; B. gametofito con embrión apogámico en P. oaxacana Mickel & Beitel; C. acercamiento al embrión apogámico; D. formación de embrión apogámico en P. sagittata (Cav.) Link; E. gametofito con esporofito de P. notabilis Maxon; F. hoja con la lámina semicircular de P. sagittata (Cav.) Link; G. hoja con la lámina espatulada de P. ternifolia (Cav.) Link; H. hoja con la lámina espatulada de P. villosa (Windham) Windham & Yatsk.; I. hojas con la lámina cordiforme o reniforme de P. notabilis Maxon. cb=célula basal, cm=célula media, co=célula opercular, e=embrión, es=escamas del esporofito, l=lámina, p=pecíolo. 

Esporas

Autores como ^{Manton (1950)}, ^{Tryon (1968)}, ^{Wagner (1974)}, ^{Barrington et al. (1986}; ²⁰²⁰), ^{Beck et al. (2011)}, ^{Grusz et al. (2021)} y ^{Henry et al. (2014)} han relacionado el tamaño de las esporas con el nivel de ploidía de los individuos que las producen, señalando que generalmente las especies poliploides presentan esporas más grandes que las diploides. Sin embargo, ^{Dyer et al. (2013)} señalaron que, si bien la variación en el tamaño del genoma puede deberse al aumento en el número de cromosomas, también puede ser causado por el incremento en su tamaño debido a la amplificación del ADN repetitivo. ^{Barrington et al. (2020)} mencionaron que en algunos grupos es necesario considerar además la biología reproductiva, la ecología y el tamaño de las esporas de progenitores-híbrido.

Las esporas de las especies estudiadas formaron dos grupos: las que midieron entre 37 y 49 µm (P. cordifolia, P. notabilis, P. pringlei, P. sagittata, P. ternifolia JCR 1561 y P. villosa) y las de 50 a 60 µm (P. oaxacana, P. ribae y P. ternifolia AMR 776, AMR 945). La mayoría de los representantes del primer grupo han sido determinados en otros trabajos (Cuadro 2) como diploides o con individuos diploides, mientras que algunos de los elementos del segundo grupo han sido definidos como triploides o tetraploides. Sin embargo, se debe resaltar que P. villosa es un taxon tetraploide cuyas esporas miden 46 a 53 µm, por lo que ejemplificaría una excepción en la correlación entre el número de cromosomas y las dimensiones de las esporas. En el caso de P. ribae aún no se ha determinado el nivel de ploidia.

En los helechos, el número de esporas por esporangio se ha usado para inferir su tipo de reproducción: las especies sexuales presentan 64 esporas, mientras que las especies asexuales, 32 (^{Knobloch, 1966}; ^{Beck et al., 2011}; ^{Hernández et al., 2015}). Esta reducción del número de esporas por esporangio se debe a la supresión de una división mitótica en las células madre de las esporas antes de entrar en meiosis (^{Picard et al., 2021}). Sin embargo, P. cordifolia (AMR 2600) y P. ternifolia (AMR 776 y 1561) presentaron 64 esporas y se reprodujeron por apogamía. La presencia de dos tipos de reproducción en una misma especie se puede relacionar con diferencias en las condiciones ambientales. En este estudio las condiciones de cultivo fueron las mismas para todas las especies; sin embargo, no se puede descartar esta posibilidad. En el caso particular de P. ternifolia (AMR 776), cuyo tamaño de esporas sugiere se trata de un poliploide, la presencia de apogamia permitiría mantener el nivel de ploidía.

Germinación

La germinación tipo Vittaria y el número de células que constituyen la fase filamentosa (Cuadro 2) son similares en todas las especies estudiadas y concuerdan con los registrados por otros autores (^{Pray, 1968a}, ¹⁹⁷⁰; ^{Huerta-Zavala et al., 2013}), salvo para P. notabilis, especie para la que ^{Pray (1970)} reportó filamentos de dos células y que en este trabajo fueron de dos a seis células.

La presencia de dos tipos de desarrollo protálico en Pellaea fue observado por ^{Pray (1968a}; ¹⁹⁷⁰) quien señaló diferencias en la ubicación del meristemo marginal. La mayoría de las especies estudiadas en este trabajo presentaron el tipo Adiantum, con el meristemo en posición apical produciendo gametofitos simétricos desde las etapas juveniles. El tipo Ceratopteris se observó en P. sagittata y P. ternifolia AMR 776, en las que el meristemo es inicialmente lateral y posteriormente se desplaza a una posición apical, dando lugar en etapas tempranas a un prótalo asimétrico que en la madurez adquiere una forma cordiforme simétrica. Pellaea ternifolia registró ambos tipos de desarrollo y P. sagittata el tipo Ceratopteris. Cabe señalar que los mecanismos celulares que determinan el desarrollo de los meristemos en los gametofitos de helechos siguen siendo en gran medida desconocidos (^{Wu et al., 2021}).

Reproducción

Las características y tiempo de desarrollo de los gametofitos adultos son similares en las especies estudiadas. Sin embargo, el tipo de reproducción (asexual o sexual) varía: P. cordifolia (AMR 2600), P. oaxacana, P. sagittata (AMR 2589) y P. ternifolia (JCR 1561 y AMR 776) formaron esporofitos apogámicos, estrategia reproductiva que ya había sido reportada para estas especies (^{Pray, 1968a}, ¹⁹⁷⁰; ^{Tryon, 1968}; ^{Huerta-Zavala et al., 2013}). Pellaea ternifolia (AMR 776) no formó gametangios. El resto de los taxones solo produjeron arquegonios, lo que de acuerdo con ^{Hornych et al. (2022)}, dentro de los helechos es más frecuente de lo que se ha registrado anteriormente, aunque al no estar presentes los anteridios su potencial reproductivo es nulo. Se observa que el tiempo de aparición de los esporofitos apogámicos es menor que en los de origen sexual (Cuadro 3). Se ha señalado que esto tiene claras ventajas en hábitats xéricos donde la humedad es escasa o está disponible por un tiempo limitado (^{Haufler et al., 2016}). Una síntesis de las características de este tipo de reproducción en helechos, y particularmente en Pellaea y géneros asociados, fue realizado por ^{Grusz (2016)} y ^{Grusz et al. (2021)}, quienes propusieron un modelo de evolución y establecimiento de esta estrategia reproductiva. Además, resaltan su relación con la presencia de factores ambientales estresantes, como la temperatura y la disponibilidad del agua, así como con las características genéticas de los taxones que la presentan.

El desarrollo de prótalos unisexuales masculinos y femeninos en P. notabilis y P. ribae se relaciona con la presencia de fecundación intergametofítica (alogámica), es decir la fusión de gametos procedentes de dos gametofitos independientes que pueden provenir de un mismo esporofito (geitonogamia) o de esporofitos separados (genogamia). Requiere la llegada sincrónica de dos esporas genéticamente compatibles y viables a un sitio (^{Beck et al., 2011}), lo que puede limitar la colonización de nuevos hábitats, pero también producir una mayor variabilidad genética.

Pellaea sagittata (AMR 870), P. ternifolia (AMR 945) y P. villosa desarrollaron gametofitos bisexuales (con ambas estructuras sexuales en el mismo prótalo), condición que ya había sido registrada para las dos primeras especies (^{Tryon, 1968}, ¹⁹⁷²; ^{Huerta-Zavala et al., 2013}) y que se relaciona con la presencia de fecundación intergametofítica (autogámica). Esta se asume como ventajosa para la dispersión a larga distancia y el establecimiento de nuevas poblaciones en las que no hay disponibilidad de parejas, lo que permite colonizar nuevos hábitats a partir de una sola espora (^{Bucharová y Münzbergová, 2012}; ^{Haufler et al., 2016}). Se considera que la presencia de este tipo de reproducción puede resultar ventajosa, o al menos no perjudicial, en especies poliploides (P. sagittata es triploide y P. ternifolia y P. villosa son tetraploides) ya que el material genético adicional que se presenta después de la duplicación del genoma puede servir como un "amortiguador" contra los efectos de la homocigosis en alelos deletéreos. Además, acorta los tiempos de fecundación en regiones con disponibilidad de agua limitada y permite que los eventos de dispersión puedan introducir diversidad genética adicional a través del desarrollo de la reproducción sexual (^{Sessa et al., 2016}). Si bien se ha planteado que en gametofitos monoicos la maduración diferencial de los gametangios puede promover el cruce alogámico (^{Haufler, 2014}), en P. ternifolia y P. villosa ambas estructuras sexuales se producen casi al mismo tiempo (Cuadro 3). Este mecanismo puede asegurar un esporófito por autogamia en especies poliploides. La reproducción sexual en tetraploides fue reportada por ^{Grusz et al. (2021)} para P. wrightiana Hook., P. ternifolia y P. rufa A.F. Tryon y ahora, en este trabajo, se puede sumar a P. villosa.

Pellaea cordifolia (AMR 950) y P. pringlei presentaron gametangios, pero no formaron esporofitos después de 200 días. De acuerdo con ^{Sessa et al. (2016)}, puede deberse a las condiciones de cultivo en laboratorio, que las especies tarden mucho tiempo en alcanzar la madurez sexual y a que, por lo tanto, no se observen durante el período en que se realiza el estudio o que requieran forzosamente de fecundación cruzada. Cabe mencionar que para P. cordifolia, ^{Díaz Espinoza (2002)} registró la presencia de gametangios entre los 103 y 311 días. Para P. ovata, ^{Herrera-Soriano et al. (2011)} mencionaron que los esporofitos se formaron hasta los 380 y 390 días en dos sustratos distintos, lo que plantea la necesidad de mantener y observar los cultivos el mayor tiempo posible.

Con la adición en este trabajo de la información correspondiente al desarrollo de la fase sexual de P. oaxacana, P. ribae y P. villosa, se tienen registradas en condiciones de laboratorio las características de esta etapa del ciclo de vida, de 15 de las 16 especies de Pellaea sección Pellaea que crecen en México. Sin embargo, aún es necesario, pese a su complejidad, realizar observaciones in situ que permitan conocer la manera en que se relacionan los diferentes tipos de reproducción del grupo con los factores bióticos y abióticos de los lugares en los que habitan, así como su impacto en la distribución geográfica y taxonomía del grupo.