Área de muestreo

Se colectaron 23 muestras de sedimento en la zona costera del estado de Baja California Sur en el Océano Pacífico mexicano (localidades específicas identificadas como Pichilingue, Mulegé, Bahía Concepción, Bahía de La Paz, El Comitán, El Salitral, Océano Pacífico, entre otros) y Tabasco en el Golfo de México (localidades especificas identificadas como Sistema Lagunar Carmen-Pajonal-Machona-Redonda y Sistema Lagunar Mecoacán). Las muestras de sedimento se colectaron en frascos estériles, se almacenaron en refrigeración en el Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR-MX) y posteriormente se procesaron en la Universidad Central de Las Villas (Centro de Bioactivos Químicos; Laboratorio de Microbiología), Cuba.

Procesamiento de muestras y aislamiento de cepas

De cada muestra de sedimento se tomó 1 g y se suspendió en 9 mL de agua de mar estéril, agitando durante 3 minutos en equipo vórtex (Benchmark mixer^®, Benchmark Scientific Inc. Sayreville, NJ, USA). Cada suspensión se incubó a baño maría durante 6 min a temperatura de 55 °C conforme a ^{Pisano, Sommer y López (1986)}. Enseguida se realizaron diluciones 1:9 en agua de mar esterilizada hasta obtener finalmente una dilución equivalente a 10^-5 del concentrado inicial. Enseguida se realizó una siembra en placa, utilizando diferentes medios de cultivos selectivos para actinobacterias [ACA (almidón 10 g, K₂HPO₄ 2 g, KNO₃ 2 g, caseína 0.3 g, MgSO₄•7H₂O 0.05 g, CaCO₃ 0.02 g, FeSO₄•7H₂O 0.01 g, agar 15 g, agua de mar 1L), AAH (ácido húmico 1 g, K₂HPO₄ 0.5 g, FeSO₄•7H₂O 0.001 g, agar 20 g, solución de vitamina B1 mL (tiamina-HCl (50 mg), riboflavina (50 mg), niacina (50 mg), pyridoxina-HCl (50 mg), inositol (50 mg), Ca-pantotenato (50 mg), ácido p-aminobenzoico (50 mg), biotina (25 mg) y agua destilada (100 mL), SNC (agar 18g; novobiocina 25 µg mL^-1; agua de mar 1 L) y AMM (almidón, 10 g; extracto de levadura, 4 g; peptona, 2 g; agar, 18 g; agua de mar, 1 L)], agregando 100 µg mL^-1 de cicloheximida y 30 µg mL^-1 de ácido nalidíxico para inhibir especies indeseables, principalmente hongos. Finalmente, las placas se incubaron a 30 °C durante 28 días.

Análisis de actividad antimicrobiana

Tamizaje primario. La actividad antibacteriana de los actinomicetos aislados se realizó por el método de estrías perpendiculares (^{Ganesan et al., 2017}). Se prepararon placas de agar Muller Hinton Agar (AMH) para determinar la actividad frente a Vibrio spp. [V. algynolyticus (CIAD-CAIM 57), V. parahaemolyticus (ATCC 17802), V. harveyi (CIAD-CAIM 1793) y V. vulnificus (CIAD-CAIM 157)]. Las cepas CAIM de referencia se obtuvieron en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD-MX) y las cepas ATCC, de la colección interna de microorganismos del CIBNOR-MX. Los actinomicetos se sembraron por una sola estría en el centro de las placas de AMH e incubados a 28 °C durante 7 días. Los organismos de ensayo se estriaron perpendicularmente al aislado del actinomiceto respectivo (tres réplicas por actinomiceto), y luego, las placas fueron incubadas durante 24 h a 37 °C. Una vez realizado lo anterior y basado en la zona de inhibición contra los patógenos de prueba, los actinomicetos potenciales se seleccionaron para realizar el tamizaje secundario.

Tamizaje secundario. Aquellas cepas que presentaron actividad en el tamizaje primario fueron sometidas a un cribado secundario, aplicando la técnica de difusión en agar (^{Eccleston, Brooks y Kurtböke, 2008}). Para tal propósito, cada una de las cepas de actinomicetos se sembró en placas de ACA y durante 7 días se incubó a 30 °C (tres réplicas por cepa de actinomiceto). Las cepas de Vibrio sp. se sembraron superficialmente en placas Petri con TSA, adicionadas con NaCl al 3%, habiendo establecido como punto de partida una carga microbiana de 1×10⁸ UFC mL^-1. Enseguida, de cada placa con actinomicetos se extrajeron muestras circulares (“plugs”) con un diámetro de 6 mm y se colocaron en la superficie de las placas sembradas con Vibrio spp., utilizando como control, plugs sin actinobacterias. La evaluación de la actividad antimicrobiana de los aislados se realizó después de 24 h de incubación a 35 °C y se expresó en función del respectivo diámetro del halo de inhibición (mm) alrededor de cada plug, conforme a la metodología de ^{González, Ayuso, Anderson y Genilloud (2005)}.

Caracterización macroscópica y microscópica de las cepas de actinomicetos aisladas

Caracterización macroscópica. Para la optimización de procedimientos y obtención de máximo crecimiento y bioactividad, los aislados se cultivaron en diferentes medios, tales como agar de harina de soya con glucosa, ISP 1 (caldo de extracto de levadura triptona), ISP 2 (agar de malta de levadura), ISP 3 (agar de harina de avena), ISP 4 (agar de almidón de sal inorgánica), ISP 5 (base de agar de glicerol-asparagina), ISP 6 (agar de hierro con extracto de levadura peptona), ISP 7 (agar de tirosina), agar de Muller Hinton, agar nutritivo, agar de caseína de almidón, y agar de dextrosa de Sabouraud (^{Gebreyohannes, Feleke, Sahile y Raja, 2013}). Las colonias aisladas que presentaron una morfología de tipo actinomicetos en cultivo puro fueron conservadas en glicerol al 20%, a temperatura de -20 °C para su posterior estudio.

Se observaron las características macroscópicas de cada colonia y su crecimiento en ACA, tomando referencia en su forma, color, textura, bordes y apariencia superficial. Se seleccionaron como una primera aproximación, aquellas colonias adheridas al agar y con un aspecto ceroso y polvoso, con una coloración variable entre blanca, grisácea, crema, terrosa y rosa, que en lo general son características propias y distintivas de los actinomicetos (Vélez y Rodríguez, 2012).

Caracterización microscópica. Típicamente los actinomicetos son Gram positivos y tienen una morfología de coco (^{Valdés et al., 2005}). Por ello, se aplicó una tinción de Gram y se realizó una primera clasificación de las colonias desarrolladas en medio Agar-Caseína-Almidón, descartando aquellas que, siendo macroscópicamente similares en su forma, a los actinomicetos, presentaron una morfología microscópica diferente.

Identificación a nivel de género según morfología a través de microcultivos. Por medio del microcultivo y aplicando la técnica de ^{Ridell, Wallerström y Williams (1986)} en cultivos sobre portaobjetos y cubreobjetos, se observó el crecimiento del micelio aéreo típico de los actinomicetos. La observación de la ramificación de este micelio se realizó según los patrones de desarrollo relacionados para el género correspondiente, teniendo en cuenta la clave taxonómica del Bergey (Vélez y Rodríguez, 2012).

Caracterización fisiológica. De conformidad con ^{Tresner, Hayes y Backus (1968)} se estudió la tolerancia del aislado más promisorio a diferentes concentraciones de NaCl (0, 5, 7 y el 10%). Los aislados se observaron después de haber incubado a 37 °C por 7-15 días en medio líquido. La presencia o ausencia de crecimiento se registró a partir del día 7 de cultivo.

Utilización de fuentes de carbono. La capacidad de utilización de carbono de cada aislado potencial se estudió mediante su cultivo en agar (ISP 9) suplementado con 1% de diversas fuentes de carbono como arabinosa, xilosa, manosa, fucosa, D-ribosa, galactosa, arabinosa y manitol (^{Nonomura, 1974}). El carbono en agar se utiliza para la caracterización de Streptomyces sp. teniendo en cuenta la fuente de carbono aplicada por los aislados de este género.

Caracterización bioquímica. Se realizaron varias pruebas bioquímicas que incluyeron indol, uso de citrato, rojo de metilo, Voges Proskauer, oxidasa, catalasa, gelatinasa, amilasa, caseinasa para la identificación de un aislado potencial (^{Abirami, Khanna y Kannabiran, 2013}).

Actividad enzimática. Se utilizaron diferentes sustratos para determinar en los aislados promisorios su capacidad para hidrolizar polímeros macromoleculares tales como proteínas, lípidos y carbohidratos, y para medir la actividad enzimática, se añadió NaCl al 3% a los diferentes medios de cultivo empleados.

Hidrólisis del almidón. La actividad amilolítica se relaciona con la capacidad de una cepa para producir amilasas, y fue determinada mediante difusión radial en placa con agar marino y almidón al 2%, aplicando el método de ^{León et al. (2000)}. Estas placas se incubaron a 30 ºC durante 4-5 días, determinando la producción de amilasa mediante la medición de halos alrededor de las colonias en cultivo, después de añadir superficialmente solución de lugol en la placa.

Hidrólisis del Tween 80. La actividad lipolítica se relaciona con la capacidad de la cepa estudiada para producir lipasas, y se determinó utilizando medio Agar-Tween (^{Harley y Prescott, 2002}), con pH final de 7.0-7.4. Este medio de cultivo incluye peptona (10 g), NaCl (5 g), CaCl (0.1 g) en 1 L de agua destilada, Tween 80 (10 mL) y 15 g de agar. Después de incubar durante 4-5 días a 30 °C, si el microorganismo presente hidroliza Tween 80, alrededor de cada colonia se hace visible un halo de precipitación, asociado a la combinación de Ca²⁺ con ácidos grasos producidos mediante hidrólisis.

Hidrólisis de caseína y gelatina. La capacidad que tienen las cepas de actinomicetos para la hidrólisis de proteínas se relaciona con su habilidad para producir proteasas, y para su medición se utilizó medio de cultivo TSA 1% de leche descremada y 0.4% de gelatina (^{Harley y Prescott, 2002}). La hidrólisis de caseína se evaluó después de la incubación a 30 °C durante 4-5 días y haber observado y medido alrededor de las colonias, el diámetro de halos claros sobre las placas adicionadas con leche descremada. La hidrólisis de gelatina se registró después de incubar a 30 °C por 4-5 días, inundando las placas con HgCl₂ (15 g de HgCl₂, 20 mL de HCl y 100 mL de H₂O). La presencia de gelatina no hidrolizada se asoció a la formación de un precipitado blanco opaco y formación de una zona clara del crecimiento alrededor de las colonias.

Hidrólisis de celulosa. La actividad celulolítica de los aislados está asociada a la producción de celulasa y su evaluación se realizó en placa con agar ISP2 adicionado con CMC (1%), incubando durante 4-5 días a 30 °C. Alrededor de cada colonia se formaron halos claros que se midieron después de aplicar lugol en solución (^{Tuong, Nguyen, Le, Masaru y Ikuo, 2011}).

Aislamiento de actinomicetos

Según la morfología de las colonias y utilizando medios de agar ACA, AAH, SNC y AMM, se aislaron un total de 54 actinomicetos procedentes del muestreo en diferentes sitios de dos regiones de México, localizadas en el Océano Pacífico (B.C.S.) y en el Golfo de México (Tabasco). Se observaron distintas colonias de actinomicetos en placas de cultivo a diluciones variables, entre 10^-3 y 10^-4. De los cuatro medios utilizados para el aislamiento, AAH, AMM y ACA permitieron obtener un número mayor de actinomicetos, mientras que, el medio agar SNC resultó ser el menos favorable para el aislamiento de actinomicetos (Figura 1). El resultado anterior se explica en función de la presencia de macromoléculas (almidón y caseína) en estos medios (AAH, AMM y ACA), que son catabolizadas por la mayoría de los actinomicetos; es por ello que estos medios son favorables para el crecimiento de actinobacterias (^{Boughachiche, Reghioua, Zerizer y Boulahrouf, 2012}). La disponibilidad de nutrientes es un factor determinante en el crecimiento de diversos microorganismos, incluyendo a los actinomicetos. A diferencia de otros grupos de bacterias que requieren fuentes de carbono y nitrógeno más simples, los actinomicetos son microorganismos que utilizan como fuente de energía una gran variedad de nutrientes como almidón, proteínas, glucosa y aminoácidos (^{Gil, Pastor y March, 2009}). Por otro lado, se ha demostrado que, la adición de un agente antimicrobiano a los medios de cultivo es eficaz para eliminar microorganismos contaminantes y facilitar el aislamiento de actinomicetos de crecimiento lento (^{Das, Romi, Das, Sharma y Thakur 2018}).

Figura 1: Apariencia y morfología macroscópica de cepas de actinomicetos aisladas de dos ambientes (Océano Pacífico Mexicano y Golfo de México) en diferentes medios de cultivo. (A) Medio AMM, (B) Medio AAH.  

Figure 1: Appearance and macroscopic morphology of actinomycetes strains isolated from two environments (Mexican Ocean Pacific and Gulf of Mexico) in different culture media. (A) AMM medium, (B) AAH medium. 

Los aislados de actinomicetos exhibieron colonias con diferentes morfologías y características (tamaño, forma y color) de tamaño pequeño a mediano, con un color del micelio aéreo esporulante maduro, variando de blanco a gris, beige, naranja claro y rosado. También se registró el micelio del sustrato de color gris, blanco, beige y amarillo (Cuadro 1; Figura 2) siendo predominantes los cultivos miceliales de color gris, blanco y beige.

Figura 2: Aislados de actinomicetos procedentes de zonas costeras del Pacífico Mexicano y el Golfo de México, mostrando diferentes tonalidades de color blanco a beige y rosado. (A) cepa M6, (B) cepa M9, (C) cepa M4. Los microorganismos se crecieron en medio de cultivo ACA por 7 días a 30 grados centígrados. 

Figure 2: Isolates of actinomycetes from coastal areas of the Mexican Ocean Pacific and Gulf of Mexico, showing different shades from white to beige and pink. The microorganisms were grown in ACA culture medium for 7 days at 30 degrees Celsius. 

Tamizaje primario y secundario

Los actinomicetos producen diferentes tipos de compuestos bioactivos, con acción antibacteriana, antifúngica y anticancerígena (Elsayed, Galil, Sedik, Hassan y Sadik 2020; ^{Bukhari et al., 2021}). Esta investigación reveló la importancia de los actinomicetos aislados de sedimentos de transición mar-tierra en la franja costera marítimo-terrestre, como productores de potentes compuestos antimicrobianos, con un potencial interesante para su aplicación productiva en los proyectos de acuicultura y acuaponía.

Entre las 54 cepas de actinomicetos que se aislaron, 14 de ellas mostraron actividad antibacterial, al menos frente a una de las cepas patógenas de Vibrio sp. evaluadas (Figura 3). Los aislados con una amplia gama de actividad antibacteriana durante el tamizaje primario, se sometieron al secundario, aplicando el método de difusión en agar (^{Eccleston, Brooks y Kurtböke, 2008}).

Figura 3: Tamizaje primario de cepas de actinomicetos y evaluación de su potencialidad contra patógenos bacterianos agro-acuícolas, aplicando el método de estrías perpendiculares. 

Figure 3: Primary screening of actinomycetes strains and evaluation of evaluation of its potential against agro-aquacultural bacterial pathogens using the perpendicular streak method. 

Entre todos los aislados obtenidos y evaluados durante el presente estudio, el M4 mostró un amplio espectro de actividad contra todos los patógenos probados (V. alginolyticus CIAD-CAIM 7, V. parahaemolyticus CIAD-CAIM 29, V. alginolyticus CIAD-CAIM 57, V. campbellii y V. bivalvicida), mostrando una actividad significativa contra Vibrio alginolyticus CIAD-CAIM 7 (15 mm), V. parahaemolyticus CIAD-CAIM 29 (20 mm), V. alginolyticus CIAD-CAIM 57 (20 mm), V. campbellii (25 mm) y V. bivalvicida (21 mm), cepas patogénicas de alta virulencia y de gran interés académico, científico y tecnológico-comercial para la acuicultura (Figura 4).

Figura 4: Actividad antimicrobiana de los aislados de actinomicetos contra cepas patógenas y altamente virulentas de Vibrio spp. (método de Kirby-Bauer).  

Figure 4: Antimicrobial activity of actinomycete isolates against pathogenic and highly virulent strains of Vibrio spp. (Kirby-Bauer method). 

Las enfermedades bacterianas emergentes han obstaculizado el crecimiento de proyectos agroacuícolas. Durante el desarrollo de un estudio similar al presente, ^{León et al. (2016)} reportan que un 37% de los actinomicetos que aislaron del molusco pectínido marino Argopecten purpuratus, presentaron actividad frente a V. vulnificus, V. anguillarum y V. alginolyticus. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar agentes antibacterianos eficientes a partir de fuentes naturales, que permitan reducir o controlar y gestionar las enfermedades bacterianas de peces, moluscos y crustáceos de interés ecológico y comercial.

Caracterización morfológica

Las colonias del aislado M4 fueron de tamaño mediano a grande, pulverulentas y con margen irregular en medio de cultivo ACA. El micelio aéreo presentó una coloración de blanco a beige y el micelio del sustrato, amarillo-pálida. Este aislado fue Gram-positivo y se observaron largas cadenas de esporas en el examen microscópico de luz (aumento de 1000X). El aislado exhibió características estructurales y morfología de Streptomyces sp.; sus características fenotípicas y fisiológicas se muestran en el Cuadro 2.

El género Streptomyces sigue siendo una excelente fuente para la producción de compuestos bioactivos naturales, ya que dos tercios de todos los nuevos compuestos bioactivos descubiertos de Actinobacteria entre 2015 y 2019 se obtuvieron a partir del género Streptomyces (^{Jose, Maharshi y Jha, 2021}). Las características morfológicas de M4, tales como crecimiento aeróbico notable, apariencia polvorosa, micelio aéreo y de sustrato con diferentes colores, además del típico y distintivo “olor a tierra”, sugieren que esta cepa pertenece al género Streptomyces, pues estas características básicas son ampliamente consideradas para la identificación preliminar de este género (^{Taddei, Rodríguez, Márquez y Castelli, 2006}).

La cepa M4 toleró concentraciones de NaCl hasta 7%, sin crecimiento por encima de este porcentaje (Cuadro 2). Estos resultados sugieren que tiene la capacidad de resistir concentraciones de NaCl de hasta 70 g L^-1 (7%). En un estudio realizado por ^{Rammali et al. (2022)} concluyeron que, los ambientes salinos o hipersalinos requieren una consideración especial, porque podrían proporcionar nuevas vías para el descubrimiento de nuevas moléculas naturales y de utilidad industrial. En el Cuadro 2 se muestran datos experimentales que permiten asumir que la cepa M4 utiliza diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, siendo abundante su crecimiento si se cultiva en fuentes ricas de nitrógeno como peptona y extracto de levadura.

Actividad enzimática extracelular

Los actinomicetos son bacterias miceliales Gram-positivas y ubicuas en el suelo; son bien conocidas como productoras de muchas enzimas extracelulares con propiedades degradantes de polímeros, tales como almidón, celulosa, lípidos y proteínas (^{Chater, Biro, Lee, Palmer y Schrempf, 2010}; ^{Prakash et al., 2013}). La cepa M4 podría considerarse candidata a probiótica, ya que mostró una fuerte actividad enzimática extracelular y además produjo celulasa, amilasa, lipasa, gelatinasa y quitinasa (Figura 5). No se encontró referencia para acuaponía, pero en sistemas de producción acuícola, estas enzimas ayudan a los organismos marinos, incluidos los camarones peneidos, a mejorar la digestión de los alimentos y su tasa de crecimiento, además de impactar positivamente la calidad del agua al degradar materia orgánica y fecal y restos de la dieta no consumida en los tanques de incubación de laboratorio y estanques para engorda comercial (^{Bermudez-Brito, Plaza, Muñoz, Gómez y Gil, 2012}; ^{Zhou, Wang y Li, 2009}). Nuestros resultados coinciden con la descripción del género Streptomyces en el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey, lo que indica que la cepa M4 es compatible con los del género Streptomyces (Shirling y Gottlieb, 1966).

Figura 5: Actividad enzimática extracelular. (A): actividad proteolítica, (B): actividad celulolítica de la cepa M4. 

Figure 5: Extracellular enzyme activity. (A): proteolytic activity, (B): cellulolytic activity of strain M4.