Introducción

En la agricultura el uso de los fertilizantes nitrogenados contribuye de manera importante a la producción de alimentos, pero incrementa los costos de producción y la contaminación por nitratos en los ecosistemas terrestres y acuáticos (^{Fernández-Pascual, María y Felipe, 2002}; ^{Apáez-Barrios, Escalante, Sosa, Rodríguez y Apáez, 2014}; ^{Habete y Buraka, 2016}). Una opción para reducir las aplicaciones de estos fertilizantes químicos, es mediante la fijación biológica de nitrógeno (FBN) a través de la relación simbiótica Rhizobium-leguminosa, donde se consignan fijaciones de nitrógeno entre 24 kg ha^-1 y 584 kg ha^-1 por año (^{FAO, 1984}; ^{van Kessel y Hartley, 2000}). La literatura señala también que el proceso puede ser capaz de abastecer, en algunos casos, hasta 90% de las necesidades de las plantas (^{Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015}).

Los trabajos de investigación de Rhizobium en frijol común, inicialmente se orientaron a la selección de cepas de mayor eficiencia en FBN (^{Graham, 1990}; ^{Ferrera-Cerrato, Almaraz, Rodríguez y Espinosa, 1990}; ^{Granda-Mora, Ochoa, Ruilova, Guamán y Torres, 2014}; ^{López-Alcocer, Lépiz, González, Rodríguez y López, 2020}). ^{Graham (1990)}, señala que el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) hizo colecciones de Rhizobium en México, Brasil, Ecuador y Argentina, y evaluó un gran número de cepas. Reporta que en 1978 y 1979 se realizó un ensayo internacional (IBIT) de 10 cepas previamente evaluadas (^{Graham et al., 1981}) donde se seleccionó CIAT 640. La cepa CIAT 640 fue efectiva en amplio rango de suelos y climas. ^{Graham (1990)} menciona que posteriormente se identificó y distribuyó la cepa CIAT 899 con tolerancia a suelos ácidos. Ambas cepas se han utilizado como inoculante comercial en Centroamérica y África (^{Vlassak, Vanderley y Avilio, 1996}; ^{Morón et al., 2005}) y como organismos modelo para el estudio de diversas propiedades simbióticas (^{Martínez-Romero, 2003}; ^{Graham et al., 1994}). En México ^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)}, evaluaron 98 cepas de Rhizobium colectadas en frijol de las regiones centro y norte. Encontraron variabilidad y mejor nodulación en variedades de hábito indeterminado.

Un segundo tema de investigación en Rhizobium es la evaluación y selección de variedades de frijol eficientes para fijación de nitrógeno en simbiosis con la bacteria (^{Rosas y Bliss, 1986}; ^{Graham, 1990}; ^{Ferrera-Cerrato et al.,1990}; ^{Gómez, Hernández, Sánchez, Toscano y Sánchez, 1998}; ^{Hardarson et al., 1993}; ^{Romero-Rosales y Acosta, 2013}; ^{Farid y Navabi, 2015}; ^{Kawaka et al., 2018}). ^{Graham (1990)} documenta trabajos de nodulación y fijación de nitrógeno en cultivares nativos de frijol; señala amplia variabilidad y que las tasas de fijación variaron desde 3 kg de N ha^-1 hasta 125 kg de N ha^-1; asienta que las variedades de hábito determinado fueron pobres en fijar N₂. Informa que en la Universidad de Wisconsin realizaron trabajos de mejoramiento genético para transferir la capacidad de fijar N₂ del cultivar Puebla 152 a progenitores seleccionados; señala que se obtuvieron líneas con alta capacidad de fijación y buen rendimiento de grano. ^{Hardarson et al. (1993)} evaluaron en experimentos de campo 20 variedades y líneas de frijol en siete países para determinar su potencial en fijación de nitrógeno. Observaron diferencias en fijación entre genotipos, con 35% promedio de N derivado de la atmósfera. Identificaron genotipos de frijol con altos niveles de fijación de nitrógeno. ^{Farid y Navabi (2015)} evaluaron el potencial de fijación de nitrógeno de genotipos andinos y mesoamericanos. Encontraron variación entre genotipos. Afirman que los genotipos andinos fueron superiores en nodulación y los del acervo genético mesoamericano, mejores en fijación de nitrógeno.

Por otra parte, la literatura señala que en los estudios orientados a incrementar la FBN, debe buscarse la interacción efectiva entre los dos simbiontes (^{Rosas, Nolt, Henson y Bliss, 1987}; ^{Ferrera-Cerrato et al., 1990}; ^{Tajini, Drevon, Lamouchi, Aouani y Trabelsi, 2008}; ^{Romero-Rosales y Acosta, 2013}; ^{Gunnabo et al., 2019}; ^{Milcheski, Senf f, Orsi, Botelho y Fioreze, 2022}). En este campo, ^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)} reportan interespecificidad entre cepas de Rhizobium y variedades de frijol; señalan que 37.5% de las cepas evaluadas fueron efectivas en más de una variedad, 10% en tres variedades y sólo una mostró efectividad en las cuatro variedades incluidas. ^{Gunnabo et al. (2019)} en combinaciones factoriales entre cepas y variedades de frijol andinos y mesoamericanos de África Oriental, encontraron que CFN 42 de R. etli y CIAT 899 de R. tropici, mostraron nodulación efectiva en todos los genotipos y NAK 91 mostró interacción positiva con dos variedades de frijol. ^{Milcheski et al., (2022)} encontraron interacción significativa entre cepas y genotipos en las variables masa total de nódulos y peso seco de la parte aérea. La cepa CIAT 899 promovió la nodulación efectiva, el peso seco del vástago y la acumulación de N en el vástago.

Con base en la variabilidad genética de frijol común (^{Lépiz-Ildefonso y Ramírez, 2010a}) y de Rhizobium (^{López-Alcocer et al., 2017}) en la región occidente de México y los antecedentes revisados, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la interacción simbiótica en fijación de nitrógeno atmosférico de 10 genotipos de frijol común (cinco cultivados y cinco silvestres), inoculados cada uno de ellos con 10 cepas de Rhizobium (siete colectadas en nódulos en variedades domesticadas y tres en la forma silvestre) a través de las variables asociadas a la fijación biológica de nitrógeno número de nódulos, peso seco de nódulos, nitrógeno total en el vástago y contenido de clorofila en las hojas.

Materiales y Métodos

La evaluación por eficiencia simbiótica a través de un diseño de tratamientos factorial de 10 genotipos de frijol común (cinco cultivados y cinco silvestres) y 10 cepas de Rhizobium spp. (siete colectadas en frijol cultivado y tres procedentes de frijol silvestre), materiales biológicos originarios de la región Occidente de México (Cuadro 1), se realizó en condiciones de invernadero en Zapopan, Jalisco, México. El inoculante se incrementó en medio CELM esterilizado en tubos de vidrio de 10 mL (^{Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015}). Las bacterias se colocaron en agitación a 180 rpm por dos días, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento de 10⁸ UFC mL^-1, de acuerdo con la escala McFarland (McFarland, 1970). Las semillas de frijol se lavaron con jabón, se esterilizaron en etanol al 70% por un minuto, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril, se transfirieron a solución de cloro al 10% durante 3 min y finalmente se lavaron por cinco veces con agua destilada (^{Rodríguez, 1993}). La semilla de frijol silvestre se escarificó con lija calibre 150 para acelerar y uniformizar el proceso de germinación. La escarificación se realizó en el dorso de la semilla hasta que se hizo visible la masa cotiledonar.

El experimento se estableció en invernadero. Los 100 tratamientos se evaluaron con un diseño experimental completamente al azar y tres repeticiones. Se sembraron cuatro semillas de frijol por contenedor de plástico de 1.0 L de capacidad, en sustrato de jal (arena gruesa) tamizado en zaranda de 4 mm × 4 mm y desinfectado con bromometano; se aplicó riego con agua destilada. Después de la emergencia se dejaron dos plantas de frijol por contenedor y se aplicaron 2 mL del inóculo. Durante el ensayo se aplicaron tres riegos por semana con solución nutritiva de ^{Jensen (Jensen y Collins, 1985}) libre de nitrógeno.

En la etapa de floración del frijol, se registraron las variables número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN), nitrógeno total (%) en el vástago (NT) y contenido de clorofila en las hojas (CL) en unidades SPAD (Soil Plant Analysis Development), (^{Gholizadeh, Soom, Rahim y Wayayok, 2011}). En las variables NN y PSN, se registró el promedio de dos plantas por contenedor; para NT se extrajo una muestra de biomasa por contenedor y para CL fue el promedio de tres lecturas en la lámina foliar. El contenido de clorofila se estimó con medidor portátil Konica Minolta 502 Plus y el nitrógeno total mediante el método Kjeldhal.

Se hizo análisis multivariado permutado de la varianza (PERMANOVA), que permite la investigación de modelos complejos que incluyen interacciones (^{Anderson, 2001}; ^{McArdle y Anderson, 2001}). El análisis incluyó distancias Bray-Curtis y 10 000 permutaciones. Se elaboró dendrograma circular para observar las agrupaciones de los genotipos-cepas con el índice de conglomeración Ward.D2 (0.98) (^{Murtagh y Legendre, 2014}) y el método de distancias euclidianas para la matriz de distancias (^{Maechler, Rousseeuw, Struyf, Hubert y Hornik, 2022}). Además, se llevó a cabo análisis canónico de coordenadas principales (ACC) basado en la matriz de distancias de Bray-Curtis y 1000 permutaciones (^{Anderson y Willis, 2003}), para explorar las relaciones de 10 genotipos de frijol y 10 cepas de Rhizobium entre las variables NT y CL con el PSN y NN. Los análisis se realizaron con los paquetes cluster 2.1.4. (^{Maechler et al., 2022}), factoextra 1.0.7 (^{Kassambara y Mundt, 2020}), ggplots2 (^{Wickham, 2016}), MASS 7.3-58.2 (^{Ripley, 2022}), purrr 1.0.2 (^{Wickham y Henry, 2023}) y Vegan 2.2-1 (^{Oksanen, Simpson, Guillaume, Kindt y Legendre, 2022}), en R Studio 4.2.3 (^{R Core Team, 2023}).

Resultados y Discusión

El análisis multivariado de PERMANOVA para número de nódulos (NN), peso seco de nódulos (PSN), nitrógeno total en planta (NT) y contenido de clorofila (CL) detectó diferencias significativas para los factores genotipos de frijol, cepas de Rhizobium y para la interacción genotipo × cepa. Los valores de SC, R2 y F muestran que los efectos de la inoculación de las cepas sobre los genotipos medidos a través de las variables NN, PSN, NT y CL, fueron mayores que el de las cepas per se y de la interacción genotipo-cepa (Cuadro 2).

El modelo del ACC fue altamente significativo (p-value = 0.001) y los dos ejes principales explican 86% de la variabilidad, mostrando diferencias estadísticamente significativas para los genotipos de frijol y las cepas en las variables: NN (p-value = 0.001), PSN (p-value= (0.037), NT (p-value = 0.001) y CL (p-value = 0.001), (Figura 2).

Los genotipos de frijol en simbiosis con las cepas de Rhizobium mostraron diferencias significativas entre sí, a través de las variables NN, PSN, NT y CL. Los resultados son similares a los reportados por ^{Rosas y Bliss (1986)}; ^{Graham, (1990)}; ^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)}; ^{Hardarson et al., (1993)}; ^{Gómez et al., (1998)}; ^{Romero-Rosales y Acosta, (2013)}; ^{Farid y Navabi, (2015)}; ^{Kawaka et al., (2018)}; ^{Lépiz-Ildefonso, López, González, Rodríguez y López (2024)}.

En genotipos de frijol para la variable NN, las variedades cultivadas Peruano 16 (arbustivo), G Zarco y Apetito (arbustivo) formaron el grupo de mayor valor, y cuatro de los seis silvestres integraron el grupo de menor número de nódulos. La variedad P Saltillo genotipo menos nodulador de los cultivados, se ubicó entre el grupo de los silvestres. En NT el grupo de genotipos cultivados resultó mejor al de los silvestres. P Saltillo (arbustivo) fue superior, seguido de Peruano 16. En CL el grupo de genotipos cultivados resultó mejor que el grupo de genotipos silvestres; la variedad Apetito registró el mayor valor. Los resultados son similares a los encontrados por ^{Lépiz- Ildefonso et al. (2024)}, quienes reportan que variedades cultivadas de hábito arbustivo, fueron mejores en las variables NN, PSN, NT y CL en relación a los genotipos de hábito enredador cultivados y silvestres.

Las cepas de Rhizobium mostraron diferencias altamente significativas para las variables NN, NT y CL. Para NN seis cepas (RhGz3, RhV1, RhMa1, RhC2, RhV3, RhAt) integraron el grupo de mayor valor, cuatro pertenecen a rizobios colectados en frijoles cultivados (RhGz3, RhMa1, RhC2, RhAt). En NT la cepa RhSa1 proveniente de frijol silvestre, que registró el menor NN, fue estadísticamente superior a todas; seis cepas formaron el segundo grupo de igualdad estadística, cuatro de origen cultivado y dos de origen silvestre. Para la variable CL el grupo de mayor valor lo integraron cinco rizobios; encabezó el grupo RhSa1 de origen silvestre. La cepa RhSa1 fue de menor valor en NN y de mayor valor en NT y CL.

Diferencias entre cepas de Rhizobium en variables relacionadas con la fijación de nitrógeno similares a las encontradas en el presente trabajo, se han reportado por muchos investigadores (^{Rosas y Bliss, 1986}; ^{Graham, 1990}; ^{Ferrera-Cerrato et al.1990}; ^{Hardarson et al., 1993}; ^{Gómez et al., 1998}; ^{Romero-Rosales y Acosta, 2013}; ^{Farid y Navabi, 2015}; ^{Kawaka et al., 2018}; ^{López-Alcocer et al., 2020}). López-Alcocer et al. (2020) en su evaluación de 27 cepas, consignan diferencias significativas entre rizobios en nodulación y fijación de N, y señalan que dos cepas procedentes de frijol cultivado y una colectada en frijol silvestre, fueron mejores en nodulación y en fijación de N.

De los resultados obtenidos en esta investigación y de los numerosos trabajos reportados en la literatura sobre evaluación de genotipos de frijol y cepas de Rhizobium, se puede aseverar que existen diferencias significativas entre ambos simbiontes en las variables asociadas a la fijación de nitrógeno, número de nódulos, peso seco de nódulos, contenido total de nitrógeno en el vástago y contenido de clorofila en las hojas.

En el dendrograma circular (Figura 1) los puntos corresponden a los 100 binomios genotipo-cepa. El agrupamiento de los binomios frijol-cepa estuvo determinado por el genotipo que presentó mayor valor de respuesta a la inoculación en las cuatro variables registradas, que por las cepas per se (Cuadro 2). En el primer nivel de agrupamiento, el dendrograma separa al genotipo B (Peruano 16, color azul) perteneciente al Acervo Genético Andino, de los nueve materiales del Acervo Genético Mesoamericano. La separación de genotipos entre acervos genéticos de frijol, está documentada no solo para nodulación y fijación de nitrógeno (^{Farid y Navaby, 2015}), sino para otras características como tamaño de grano, color del grano, contenido de faseolina, forma del foliolo central y forma de bracteolas (^{Singh, Gepts y Debouck, 1991}; ^{Lépiz et al., 2010b}).

Figura 1: Agrupación jerárquica. Dendrograma circular donde cada punto es una combinación de genotipo (letra) y cepa (número). A = P. Saltillo; B = Peruano 16; C = G. Zarco; D = Flor de Mayo; E = Apetito; F = ROL 633; G = ROL 486; H = ROL 497; I = ROL 517; J = ROL 242. Cepas = 1) RhV1; 2) RhV3, 3) RhMa1, 4) RHMa2, 5) RhAt, 6) RHCb3, 7) RhSa1, 8) RhGz2, 9) RhGz3, 10) RhC2.  

Figure 1: Hierarchical clustering. Circular dendrogram where each dot is a combination of genotype (letter) and strains (number). A = P. Saltillo; B = Peruano 16; C = G. Zarco; D = Flor de Mayo; E = Apetito; F = ROL 633; G = ROL 486; H = ROL 497; I = ROL 517; J; ROL 242. Strains = 1) RhV1, 2) RhV3, 3) RhMa1, 4) RHMa2, 5) RhAt, 6) RHCb3, 7) RhSa1, 8) RhGz2, 9) RhGz3, 10) RhC2. 

En un segundo nivel de agrupamiento, el dendrograma separa a los genotipos mesoamericanos en silvestres (color amarillo) y cultivados (colores tinto y lila). Se han reportado diferencias morfológicas entre las dos formas de frijol en tamaño de semilla, longitud del foliolo central, longitud de vaina, hábito de crecimiento, dehiscencia (^{Lépiz et al., 2010b}) y genéticas a través de marcadores moleculares (^{Castellanos-Hernández, Lépiz, Castellanos, Rodríguez y Torres, 2017}). El dendrograma muestra relación directa con lo encontrado en los efectos simples, donde de manera general los frijoles cultivados mostraron mayor valor que los frijoles silvestres en las variables NN, PSN, NT y CL.

En tercer nivel de agrupamiento, los frijoles cultivados se separan en dos conjuntos: en color lila A (P Saltillo) y en color tinto C (G Zarco), D (Flor de Mayo) y E (Apetito). Esta separación está definida principalmente por la variable NN: P Saltillo de baja nodulación y G Zarco, Flor de Mayo y Apetito, noduladores. El genotipo I (ROL 517) de la forma silvestre e híbrido natural entre las dos formas, se ubica en el área de los cultivados noduladores. En el tercer nivel, los silvestres forman dos conjuntos: F (ROL 633) y J (ROL 242) por un lado y por el otro G (ROL 486) y H (ROL 497). La separación de los genotipos silvestres tiene también relación con los efectos simples en las variables NN, NT y CL, donde los dos primeros genotipos registraron valores mayores, en relación a los dos segundos.

El análisis canónico de coordenadas principales (ACC) basado en la matriz de distancias de Bray-Curtis y 1000 permutaciones, que explora las relaciones entre NT y CL con PSN y NN de los 100 binomios genotipo de frijol y cepas de Rhizobium spp. (Figura 2), mostró interacción genotipo-cepa en las cuatro variables agronómicas (p-value < 0.001) y asociación positiva de los genotipos cultivados con las variables NN, PSN, NT y CL. Los genotipos domesticados P Saltillo (A) y Peruano 16 (B) en simbiosis con la mayoría de las cepas, muestran interacción positiva en las variables NT y PSN. De manera similar, G Zarco (C) en simbiosis con seis de las cepas, presenta interacción positiva en las variables NN y PSN. En la variable CL Apetito exhibe interacción positiva con seis de las cepas y ROL 517 de origen silvestre e híbrido natural entre las dos formas, muestra interacción positiva en cinco casos. Los resultados revelan que los genotipos de frijol interaccionan de manera diferente con las cepas de Rhizobium en las variables registradas. Lo mismo se observa en las cepas en simbiosis con los genotipos de frijol. En trabajos similares (^{Rosas et al., 1987}, ^{Ferrera-Cerrato et al., 1990}; ^{Gunnabo et al., 2019}) señalan que además de identificar cepas de Rhizobium y genotipos de frijol eficientes en fijar nitrógeno, debe buscarse interacción positiva entre los dos simbiontes para incrementar la fijación. ^{Ferrera-Cerrato et al. (1990)}, en la evaluación de cepas y variedades de frijol, con las variables número de nódulos y materia seca de la planta, reportan que 37.5% de las cepas se comportaron como efectivas en más de una variedad, 10% en tres variedades y sólo una mostró efectividad en las cuatro variedades utilizadas. ^{Gunnabo et al. (2019)}, estudiaron la interacción factorial de diversos genotipos rizobianos y variedades de frijol común de África Oriental a través de la variable nodulación. Encontraron que la cepa CFN 42 de Rhizobium etli y la cepa de Rhizobium tropici CIAT 899, fueron efectivas en todos los genotipos de frijol y que NAK 91 mostró evidencia de interacción positiva con dos genotipos específicos de frijol.

Figura 2: Gráfica del análisis de coordenadas principales. Genotipos: A = P. Saltillo; B = Peruano 16; C = G. Zarco; D = Flor de Mayo; E = Apetito; F = ROL 633; G = ROL 486; H = ROL 497; I = ROL 517; J = ROL 242. Cepas = 1) RhV1, 2) RhV3, 3) RhMa1, 4) RhMa2, 5) RhAt, 6) RhCb3, 7) RhSa1, 8) RhGz2, 9) RhGz3, 10) RhC2. En los puntos de la figura, la letra indica el genotipo y el número la cepa inoculada. Las letras en rojo son: número de nódulos (NN) y peso seco de nódulos (PSN). Figure 2: Graph of the main coordinate analysis. Genotypes: A = P. Saltillo, B = Peruano 16; C = G. Zarco, D = Flor de Mayo; E = Apetito; F = ROL 633; G = ROL 486; H: ROL 497; I = ROL 517; J = ROL 242. Strains = 1) RhV1, 2) RhV3, 3) RhMa1, 4) RhMa2, 5) RhAt, 6) RhCb3, 7) RhSa1, 8) RhGz2, 9) RhGz3, 10) RhC2. At the points in the figure, the letter indicates the genotype and the number of the inoculated strain. The letters in red are: number of nodules (NN) and dry weight of nodules (PSN). 

En el presente trabajo destacan las variedades P Saltillo (A) y Peruano 16 (B) por mostrar asociación positiva con la mayoría de las cepas en las variables NT y PSN; G Zarco (C) con seis cepas en NN; Apetito con seis de las cepas en la variable CL. De manera particular destacan otros binomios con interacción específica. Las combinaciones de A8, B8 y C8 (P Saltillo, Peruano 16 y G Zarco) con la cepa RhGz2 en la variable NT. Los binomios B6 y B8 (Peruano 16 y cepas RhCb3 y RhGz2) en la variable PSN y las combinaciones C1, C6 (G. Zarco con RhV1 y RhCb3) en NN. Finalmente destaca la combinación de Peruano 16 (B) con la cepa RhSa1 (7).

Los resultados permiten confirmar la existencia de interacción entre los binomios genotipo frijol-cepa de Rhizobium a través de las variables número de nódulos por planta, peso seco de nódulos, nitrógeno total en la planta y contenido de clorofila en los foliolos. Permiten también identificar binomios con interacción específica para una o más variables asociadas a la fijación de nitrógeno.

Conclusiones

Se detectaron diferencias significativas para la interacción genotipo × cepa entre 10 genotipos de frijol en simbiosis con 10 cepas de Rhizobium, en las variables asociadas a la fijación de nitrógeno atmosférico número de nódulos, peso seco de nódulos, contenido total de nitrógeno en la planta y contenido de clorofila en las hojas. Los genotipos de frijol cultivado y las cepas colectadas en frijol domesticado, en general fueron mejores a los genotipos silvestres y a las cepas provenientes de frijoles silvestres, respectivamente. El dendrograma separó a los binomios genotipo-cepa, por acervos genéticos de frijol (andinos y mesoamericanos); a los genotipos mesoamericanos por formas de frijol (silvestres y cultivados) y por genotipos dentro de cada una de las formas. El análisis de coordenadas principales encontró interacción positiva de los genotipos cultivados con las cepas de Rhizobium para las cuatro variables registradas. Se identificaron interacciones específicas de los binomios genotipo-cepa para una variable o más de una variable.

Declaración de Ética

No aplicable.

Consentimiento para Publicación

No aplicable.

Disponibilidad de Datos

Los datos utilizados o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente, a solicitud razonable.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Financiación

La investigación fue financiada con fondos internos de la Universidad de Guadalajara.

Contribución de los Autores

Conceptualización: R.L.I. y J.J.L.A. Metodología: J.J.L.A. y R.L.I. Análisis estadístico: W.D.R., R.L.I. y E.R.G. Validación: R.L.I. Análisis formal: R.L.I. y W.D.R. Investigación: J.J.L.A. y R.L.I. Curación de datos: J.J.L.A., R.L.I. y E.R.G. Preparación del borrador original: R.L.I., W.D.R. y J.J.L.A. Revisión y edición: R.L.I., E.R.G. y W.D.R. Visualización: R.L.I. y E.R.G. Supervisión: R.L.I. Administración del proyecto: R.L.I. Adquisición de fondos: R.L.I.