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Terra Latinoamericana

On-line version ISSN 2395-8030Print version ISSN 0187-5779

Terra Latinoam vol.38 n.4 Chapingo Oct./Dec. 2020  Epub Feb 12, 2021

https://doi.org/10.28940/terra.v38i4.654 

Artículo científico

Eficiencia en fijación biológica de nitrógeno de cepas de Rhizobium spp. recolectadas en frijol cultivado y silvestre

Biological nitrogen fixation efficiency in strains of Rhizobium spp. collected in cultivated and wild bean

José de Jesús López-Alcocer1 
http://orcid.org/0000-0002-6927-9711

Rogelio Lépiz-Ildefonso1   
http://orcid.org/0000-0002-2062-2291

Diego Raymundo González-Eguiarte1 
http://orcid.org/0000-0001-6609-0780

Ramón Rodríguez-Macías1 
http://orcid.org/0000-0003-0857-6699

Eduardo López-Alcocer1 
http://orcid.org/0000-0001-9374-8330

1 Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. Camino Ramón Padilla Sánchez 2100, Nextipac. 44600 Zapopan, Jalisco, México.


Resumen:

Se evaluó la eficiencia en fijación biológica de nitrógeno (FBN) de 27 cepas de Rhizobium spp. recolectadas en frijol silvestre y cultivado del occidente de México, al utilizar como hospedero la variedad de frijol Cuarenteño. El trabajo se realizó bajo malla sombra, se usó un diseño experimental completamente al azar con cinco repeticiones y se evaluaron longitud de vástago (LV) y de raíz (LR), peso seco de vástago (PSV) y de raíz (PSR), número de nódulos (NN) y peso seco de nódulos (PSN), nitrógeno total del vástago (NT) y contenido de clorofila (CL). Se realizaron análisis de varianza y de componentes principales; se obtuvieron índices de eficiencia por variable y por grupos de variables. Se detectaron diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01) en seis de las ocho variables registradas. Por el valor per se de las variables, se seleccionaron Rhizojal VC3 colectada en frijol silvestre y Rhizojal ZCB3, Rhizojal ZCB1, Rhizojal TP2 y Rhizojal TP3 obtenidas en frijol cultivado. Por índices de eficiencia simples y por grupos de variables, se escogieron Rhizojal VC3, Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2. El análisis de componentes principales separó a la mayoría de las cepas en dos grupos: cepas procedentes de la forma silvestre de frijol y cepas colectadas en frijol cultivado. Las cepas Rhizojal ZCB3, Rhizojal TP2 y Rhizojal TP3, mostraron los mayores valores en la escala del CP1; la cepa Rhizojal VC3, se ubicó del lado de los aislados de origen cultivado. Considerando los análisis realizados, las cepas identificadas como mejores en FBN fueron Rhizojal VC3 de frijol silvestre y Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2 de origen cultivado. Los resultados indican que los índices de eficiencia contribuyen a la evaluación y selección de cepas por FBN y que existe potencial para identificar cepas de Rhizobium eficientes en FBN en la región occidente de México.

Palabras clave: componentes principales; índices de eficiencia; materia seca; nodulación; Phaseolus vulgaris L

Summary:

To assess efficiency in biological nitrogen fixation (BNF) of 27 Rhizobium spp. strains from plants of cultivated and wild bean from the western region of Mexico, a trial was conducted in mesh shade using a variety of bean Cuarenteño as host. A completely randomized experimental design was used with five replications and eight variables were recorded: stem length (SL) and root (RL), dry weight of stem (DSW) and root (DRW), number (NN) and dry weight of nodules (NDW), total nitrogen (TN) stem and chlorophyll content (CL). Analyses of variance and principal components were performed; efficiency indices were obtained by variable and groups of variables. Highly significant differences (P ≤ 0.01) were detected in six of the eight variables recorded. By variable value per se, Rhizojal VC3 collected in wild bean and Rhizojal ZCB3, Rhizojal ZCB1, Rhizojal TP2 and Rhizojal TP3 obtained in cultivated beans were selected. Rhizojal VC3, Rhizojal ZCB3 and Rhizojal TP2 were chosen by simple and group variable efficiency indexes. The analysis of main components separated most of the strains into two groups: strains from wild bean and strains collected in cultivated beans. Strains Rhizojal ZCB3, Rhizojal TP2 and Rhizojal TP3 showed higher values on the scale of the CP1; strain Rhizojal VC3, stood on the side of cultivated origin isolates. Considering the analyses performed, the strains identified as best in BNF were Rhizojal VC3 of wild bean and Rhizojal ZCB3 and Rhizojal TP2 of cultivated origin. The results indicated that the efficiency indices contributed to strain evaluation and selection by BNF and that the potential exists to identify efficient Rhizobium strains in BNF in the western region of Mexico.

Index words: principal component analysis; efficiency index; dry matter; nodulation; Phaseolus vulgaris L

Introducción

La simbiosis leguminosa-Rhizobium es el proceso biológico capaz de convertir nitrógeno atmosférico elemental (N2) en amonio (NH4 +), forma aprovechable por las plantas. Los rizobios de los nódulos reducen entre 50 y 70% del nitrógeno biológicamente fijado en el mundo y aportan hasta 65% del nitrógeno utilizado en la agricultura (Simon et al., 2014). Se estima que los niveles de fijación biológica del nitrógeno (FBN) a través de la simbiosis leguminosa-Rhizobium, puede variar desde 24 hasta 584 kg N ha-1, proceso que puede ser capaz de abastecer en algunos casos hasta 90% de las necesidades de las plantas (Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015).

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una leguminosa poco eficiente en fijación biológica de nitrógeno (Gómez et al., 1998; Granda et al., 2009; Yadegari, 2014). Sin embargo, diversos estudios en este campo consideran que existe potencial para lograr un incremento en la fijación de nitrógeno a través de la selección de un binomio planta de frijol-cepa de Rhizobium eficiente en FBN (Acuña y Uribe, 1996; Granda et al., 2014; Farid y Navabi, 2015). En frijol, Ferrera-Cerrato et al. (1990) reportan diferencias en los niveles de fijación de nitrógeno entre variedades, desde 7.1 hasta 106.5 kg ha-1.

Los trabajos de investigación encaminados a evaluar cepas de Rhizobium en diferentes leguminosas de importancia agrícola, entre ellas el frijol común, han sido orientados a la selección de cepas de mayor eficiencia en el proceso de fijación biológica de nitrógeno (FBN) (Granda et al., 2014). Desde 1988 a 1992 el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) realizó trabajos sobre FBN en la Zona Andina con el objetivo de aumentar la producción y productividad del frijol solo y asociado con maíz, mediante la selección y uso de cepas de Rhizobium eficientes en la fijación de N2, con capacidad competitiva contra las cepas nativas y con un rango amplio de adaptación. Esta investigación se realizó en laboratorio, invernadero y en campos de agricultores de la sierra peruana, donde se seleccionaron cuatro cepas con las características deseadas: CIAT 7001, Cusco 10, CIAT 2 y Cajamarca 13. En los ensayos de campo se lograron incrementos de 22 % en el rendimiento de frijol (Pineda, 1992).

Ferrera-Cerrato et al. (1990), evaluaron 98 aislados colectados en raíces de frijol cultivado de nueve estados de la Mesa Central y del Norte-Centro de México en variedades de frijol de diferente hábito de crecimiento. Por número de nódulos efectivos y producción de materia seca, encontraron que 37.5% de las cepas estudiadas se comportaron como efectivas en más de una variedad, el 26% como efectiva en dos variedades, 10% en tres variedades y únicamente la cepa EL 63 resultó efectiva en todas las variedades de frijol común. Esta variabilidad fue evidente en fijación entre las cepas de Rhizobium y una mejor nodulación en variedades de hábito indeterminado. Estos autores también afirman que es factible incrementar la fijación de nitrógeno del frijol en el campo, mediante la selección de cepas efectivas y competitivas, capaces de sobrevivir y adaptarse a las condiciones del suelo, así como la selección de variedades de frijol con alta capacidad de fijar nitrógeno en simbiosis con Rhizobium.

Acuña et al. (2001) realizaron estudios en validación de inoculantes con cepas de Rhizobium en Centro América en 45 sitios de Panamá, Costa Rica, Nicaragua y el Salvador, con el objetivo de evaluar el efecto de los inoculantes en la producción comercial de frijol, considerando cuatro tratamientos: testigo absoluto (sin fertilización ni inoculación), inoculado, fertilización nitrogenada intermedia más inóculo y fertilización recomendada localmente. En Panamá la fertilización recomendada presentó los mayores rendimientos, seguida del tratamiento fertilización intermedia más inoculo. En Costa Rica y Nicaragua se obtuvieron los mayores rendimientos con fertilización intermedia más inoculo y fertilización recomendada. En El Salvador los mayores rendimientos de frijol se lograron con la fertilización intermedia más inóculo. Los autores concluyen que, no obstante, la buena respuesta del frijol al tratamiento combinado de fertilización nitrogenada intermedia más Rhizobium o fertilización recomendada, por menor costo de inversión el tratamiento seleccionado como mejor en el 80% de los casos, fue el de solo inoculante.

Mostasso et al. (2002), evaluaron 36 aislados y dos cepas comerciales de Rhizobium en dos variedades de frijol, con el objetivo de seleccionar cepas eficientes en fijación de nitrógeno. Reportaron que 10 de los aislados mostraron igual o mayor capacidad de fijación de nitrógeno en comparación con la cepa comercial CIAT 899, en ambas variedades. Concluyeron que los aislados seleccionados pueden ser utilizados como inoculantes para reducir el uso de fertilizante nitrogenado.

En los trabajos de evaluación y selección de cepas de Rhizobium eficientes en fijación biológica de nitrógeno atmosférico, la mayoría de los investigadores han considerado como variables importantes el número y peso seco de nódulos y peso seco de la parte aérea en ensayos de invernadero. Índices de eficiencia han sido poco utilizados en la evaluación y selección de cepas, índices que combinen más de una variable y que permitan hacer una mejor discriminación y distinción de cepas efectivas. Bécquer et al. (2013), utilizaron dos índices: índice de nodulación (IN) e índice de eficiencia de la inoculación (IEI) para selección de cepas de Bradyrhizobium de Centrocema spp. El IN lo estimaron dando valores numéricos (3, 2 o 1) al tamaño, color y cantidad de nódulos y multiplicando los tres valores obtenidos en cada aislado. El IEI se calculó usando el peso seco del vástago y la fórmula: (tratamiento inoculado - tratamiento no inoculado) / tratamiento no inoculado, todo multiplicado por 100.

La presencia en el suelo de cepas nativas poco eficientes y muy competitivas, así como algunos aspectos abióticos del suelo que afectan el proceso de infección, contribuyen a la baja eficiencia en la fijación de N2 del binomio frijol-Rhizobium (Mora, 1995; Martínez-Romero, 2001; Castro et al., 2006). Estos autores afirman que la selección de cepas eficientes y competitivas debe realizarse directamente en el área de producción, donde como primer paso se deben de colectar rizobios nativos y como segundo, evaluarlos por eficiencia en fijación en las variedades locales y bajo las condiciones de clima y suelo del área de producción. Esta estrategia puede fructificar en un incremento en la tasa de fijación (Ferrera-Cerrato et al., 1990; Granda et al., 2014).

Con base en la variabilidad genética del frijol (Lépiz y Ramírez, 2010) y del Rhizobium (López et al., 2017) en la región occidente de México, el presente trabajo tuvo el objetivo de evaluar la eficiencia en FBN de 27 cepas de Rhizobium procedentes de nódulos colectados en plantas de frijol cultivado y silvestre de los estados mexicanos de Jalisco y Michoacán.

Materiales y Métodos

El experimento se condujo bajo malla sombra en el municipio de Zapopan, Jalisco, México. Se emplearon 27 cepas de Rhizobium (Cuadro 1), nueve procedentes de raíces de plantas de frijol silvestre y 18 de frijol cultivado, colectadas en los estados de Jalisco y Michoacán (Cuadro 2). El trabajo de colección, aislamiento, purificación, conservación e incremento de las cepas en el laboratorio, se describe por López et al. (2017). Como hospedero se utilizó la variedad de frijol cultivado Cuarenteño de hábito determinado, cultivar con antecedentes de eficiencia en la producción de nódulos (Com. Pers.1).

Cuadro 1: Características morfológicas de las 27 cepas de Rhizobium spp. utilizadas en el estudio de fijación biológica de nitrógeno (FBN). 

Table 1: Morphological characteristics of the 27 strains of Rhizobium spp. used in the study of biological nitrogen fixation (BNF). 

Número cepa Código de cepa Sitio de origen Forma de frijol Características
Forma Color Aspecto Borde Textura
1 Rhizojal VC1 Nevado de Colima S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
2 Rhizojal VC2 Nevado de Colima S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
3 Rhizojal VC3 Nevado de Colima S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
4 Rhizojal BH1 Huentitán S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
5 Rhizojal BH2 Huentitán S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
6 Rhizojal BH3 Huentitán S Convexa blanco traslúcida liso gomosa
7 Rhizojal SA1 San Andrés S Cupular blanco traslúcida liso acuosa
8 Rhizojal SA2 San Andrés S Cupular blanco traslúcida liso acuosa
9 Rhizojal SA3 San Andrés S Cupular blanco traslúcida liso acuosa
10 Rhizojal ZMA1 Zapopan D Convexa blanco opaca liso gomosa
11 Rhizojal ZMA2 Zapopan D Convexa blanco opaca liso gomosa
12 Rhizojal ZMA3 Zapopan D Convexa blanco opaca liso acuosa
13 Rhizojal ZGZ1 Zapopan D Convexa blanco opaca liso gomosa
14 Rhizojal ZGZ2 Zapopan D Convexa blanco opaca liso gomosa
15 Rhizojal ZGZ3 Zapopan D Convexa blanco opaca liso gomosa
16 Rhizojal ZAT1 Zapopan D Cupular blanco traslúcida liso acuosa
17 Rhizojal ZAT2 Zapopan D Cupular blanco traslúcida liso acuosa
18 Rhizojal ZAT3 Zapopan D Cupular blanco traslúcida liso acuosa
19 Rhizojal ZCB1 Zapopan D cupular blanco traslúcida liso acuosa
20 Rhizojal ZCB2 Zapopan D cupular blanco traslúcida liso acuosa
21 Rhizojal ZCB3 Zapopan D Cupular blanco traslúcida liso acuosa
22 Rhizojal TP1 Tizapán D Convexa blanco opaca liso gomosa
23 Rhizojal TP2 Tizapán D Convexa blanco opaca liso gomosa
24 Rhizojal TP3 Tizapán D Convexa blanco opaca liso gomosa
25 Rhizomich CR1 Cojumatlán D Convexa blanco opaca liso gomosa
26 Rhizomich CR2 Cojumatlán D Convexa blanco opaca liso gomosa
27 Rhizomich CR3 Cojumatlán D Convexa blanco opaca liso gomosa

S = frijol silvestre; D = frijol domesticado.

S = wild bean; D = domesticated beans.

Cuadro 2: Ubicación geográfica de los sitios de recolecta de 27 cepas de Rhizobium spp. utilizados en el estudio de fijación biológica de nitrógeno. 

Table 2: Geographical location of the collection sites of 27 strains of Rhizobium spp. used in the study of biological nitrogen fixation. 

Cepas Forma Sitio Tipo de suelo Tipo de vegetación Longitud Latitud Altitud
m
Rhizojal VC1, VC2, VC3 S Nevado de Colima, Jalisco Leptosol orgánico Encino 103° 37’ 19° 37’ 2168
Rhizojal BH1, BH2, BH3 S Barranca Huentitán, Jalisco Leptosol pedregoso Leguminosas 103° 17’ 20° 43’ 1326
Rhizojal SA1, SA2, SA3 S San Andrés, Jalisco Leptosol pedregoso Encino y leguminosas 103° 27’ 19° 49’ 1605
Rhizojal ZMA1, ZMA2, ZMA3 C Zapopan, Jalisco Regosol cultivado Cultivos 103° 30’ 20° 44’ 1580
Rhizojal ZGZ1, ZGZ2, ZGZ3 C Zapopan, Jalisco Regosol Cultivado Cultivos 103° 30’ 20° 44’ 1580
Rhizojal ZAT1, ZAT2, ZAT3 C Zapopan, Jalisco Regosol cultivado Cultivos 103° 30’ 20° 44’ 1580
Rhizojal ZCB1,ZCB2, ZCB3 C Zapopan, Jalisco Regosol cultivado Cultivos 103° 30’ 20° 44’ 1580
Rhizojal TP1, TP2, TP3 C Tizapán el Alto, Jalisco Phaeozem cultivado Cultivos 102° 36’ 20° 02’ 1532
Rhizomich CR1,CR2, CR3 C Cojumatlán, Michoacán Phaeozem cultivado Cultivos 102° 52’ 20° 08’ 1520

S = frijol silvestre; D = frijol domesticado.

S = wild bean; D = domesticated beans.

Las cepas se incrementaron en medio CELM (Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015) en tubos de vidrio de 10 mL puestos en agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento de 108 UFC mL-1, de acuerdo con la escala de McFarland (McFarland, 1970). Las semillas de frijol se lavaron con jabón, se esterilizaron en etanol al 70% por un minuto, se enjuagaron tres veces consecutivas con agua destilada estéril, se transfirieron a una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante tres minutos y finalmente se lavaron cinco veces con agua destilada estéril (Rodríguez, 1993).

Las 27 cepas y dos tratamientos testigo (absoluto sin fertilización ni inoculación y fertilizado con 30 kg ha-1 de N) se evaluaron en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones. Se sembraron cuatro semillas de frijol por contenedor de plástico de 1 L con arena (jal) tamizada en una zaranda de 4 × 4 mm, lavada y desinfectada con Bromometano (80 g m-3 y 48 horas de exposición; evitar su inhalación); después de la emergencia se dejaron dos plantas por contenedor y se aplicaron 2 mL de inóculo. Durante el ensayo se aplicaron riegos con solución nutritiva de Jensen libre de nitrógeno, tres veces por semana. El registro de las variables se realizó en la etapa de prefloración del frijol.

Se midieron longitud de vástago, considerado como altura de planta (LV), longitud de raíz (LR), número de nódulos (NN), peso seco del vástago (PSV), peso seco de raíz (PSR), peso seco de nódulos (PSN), nitrógeno total (%) en el vástago (NT) y contenido de clorofila (CL) en unidades SPAD (Soil Plant Analysis Development) (Gholizadeh et al., 2011). Para el registro de las variables LV, LR, PSV, PSR, NN y PSN se usó el promedio de dos plantas por contenedor. Para número de nódulos, las raíces se lavaron en un contenedor con agua por dos veces, se separaron y se contaron. Para NT se extrajo una muestra de biomasa de tallos y hojas por contenedor. Para obtener el peso seco, las muestras de biomasa y los nódulos se colocaron en una estufa marca Binder (D-78532 Germany) a 40 °C hasta que se observó peso constante. El nitrógeno total se evaluó con base en el método Kjeldhal (AOAC, 1990). El contenido de clorofila (CL) se determinó como el promedio de tres lecturas en la lámina foliar de cada contenedor y se utilizó un medidor portátil Konica Minolta® 502 Plus.

Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (ANOVA). En las variables con diferencias significativas se realizó la comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05). Los análisis de varianza y la prueba de medias se realizaron con el programa de cómputo SAS® Ver. 9.4. Se realizó un análisis de componentes principales con el programa Past3exe. Además, se obtuvieron índices de eficiencia de las cepas para cada una de las variables (IEVi) que resultaron con diferencias significativas. Con los valores de NN y PSN se estimó el índice de eficiencia en nodulación (IEN) y con las variables PSV, PSR y NT se calculó el índice de eficiencia en fijación de nitrógeno (IEF). Asimismo, se obtuvo el índice de eficiencia general (IEG) para una cepa, considerando las cinco variables. Los índices expresan el porcentaje del valor per se de cada variable o de grupos de variables en relación al promedio respectivo; no hay unidades de medición y se pueden hacer comparaciones entre cepas y variables.

El índice de eficiencia para una cepa y para una variable (IEVi), se calculó utilizando la siguiente Ecuación 1:

IEVi=Vi/X-vi100 (1)

Donde: IEVi = índice de eficiencia de una cepa para la variable i; Vi = valor de la variable i de una cepa; X-vi = promedio de la variable i de todas las cepas.

El índice de eficiencia para más de una variable (IE), se obtuvo con la Ecuación 2:

IE=i=1nVi/X-vi/n100 (2)

donde: IE = índice de eficiencia de una cepa para más de una variable; Vi = valor de la variable i; X-vi = promedio de la variable i de todas las cepas; n = número de variables consideradas.

Resultados y Discusión

Variables cuantitativas

Se detectaron diferencias altamente significativas (P ≤ 0.01) entre cepas de Rhizobium en seis de las ocho variables cuantificadas; las excepciones fueron longitud de raíz y contenido de clorofila. El Cuadro 3 muestra los valores promedio de cada variable en las 27 cepas y los dos tratamientos testigo incluidos, así como las comparaciones de promedios (Tukey 0.05).

Cuadro 3: Valores promedio y parámetros estadísticos de las variables registradas en la evaluación de 27 cepas de Rhizobium spp. por fijación biológica de nitrógeno (FBN). 

Table 3: Average values and statistical parameters of the variables recorded in the evaluation of 27 strains of Rhizobium spp. by biological nitrogen fixation (BNF). 

Cepa Código LV LR LPSVV PSR NN PSN NT CL

- - - - cm - - - - - - - - g - - - - - mg % SPAD
1 Rhizojal VC1 28.7 abc 17.7 0.89 de 0.47 bc 279 abcd 68 bc 4.00 ghi 39.0
2 Rhizojal VC2 32.9 abc 16.9 0.97 bcde 0.53 bc 217 bcd 49 c 3.90 ijk 37.1
3 Rhizojal VC3 35.1 abc 17.4 1.01 abcde 0.42 c 395 a 120 ab 4.10 defgh 40.5
4 Rhizojal BH1 35.8 abc 20.2 1.00 abcde 0.47 bc 274 abcd 60 bc 4.37 a 41.7
5 Rhizojal BH2 32.7 abc 18.5 0.85 e 0.54 bc 180 cd 65 bc 3.68 lm 36.1
6 Rhizojal BH3 35.6 abc 17.6 0.99 abcde 0.86 a 177 cd 63 bc 4.02 fghi 37.4
7 Rhizojal SA1 32.0 abc 20.3 0.95 bcde 0.52 bc 268 abcd 58 ab 3.82 jkl 39.2
8 Rhizojal SA2 31.2 abc 20.8 0.97 bcde 0.62 abc 312 abc 86 abc 4.20 bcd 34.9
9 Rhizojal SA3 37.2 a 18.3 0.94 bcde 0.52 bc 239 bcd 87 abc 3.68 lm 39.0
10 Rhizojal ZMA1 33.1 abc 19.3 1.00 abcde 0.65 abc 323 abc 102 abc 3.67 lm 36.3
11 Rhizojal ZMA2 33.6 abc 20.0 1.03 abcde 0.49 bc 285 abcd 76 abc 4.01 fghi 40.0
12 Rhizojal ZMA3 32.1 abc 19.2 1.11 abcde 0.46 bc 277 abcd 92 abc 3.94 hij 36.8
13 Rhizojal ZGZ1 31.8 abc 18.4 0.95 bcde 0.55 bc 230 bcd 87 abc 3.73 klm 40.3
14 Rhizojal ZGZ2 33.9 abc 18.8 0.92 cde 0.48 bc 285 abcd 70 abc 4.26 ab 36.5
15 Rhizojal ZGZ3 33.2 abc 18.1 1.07 abcde 0.39 c 342 ab 101 abc 3.69 lm 39.5
16 Rhizojal ZAT1 32.5 abc 18.4 1.07 abcde 0.55 bc 214 bcd 121 ab 4.18 bcde 38.3
17 Rhizojal ZAT2 35.1 abc 18.6 1.18 abc 0.41 c 314abc 102 abc 3.45 o 41.1
18 Rhizojal ZAT3 31.7 abc 18.3 1.12 abcd 0.46 bc 190 cd 65 bc 3.89 ij 42.1
19 Rhizojal ZCB1 28.9 abc 20.0 1.21 ab 0.66 abc 214 bcd 74 abc 3.60 mn 40.6
20 Rhizojal ZCB2 28.1 bc 18.9 1.15 abcd 0.60 abc 209 bcd 91 abc 4.04 efgh 41.5
21 Rhizojal ZCB3 27.2 c 18.7 1.25 a 0.55 bc 341 ab 137 a 4.19 bcde 43.2
22 Rhizojal TP1 31.5 abc 17.6 1.12 abcde 0.49 bc 240 bcd 81 abc 4.14 bcdef 41.2
23 Rhizojal TP2 31.5 abc 19.8 1.20 ab 0.56 bc 266 abcd 123 ab 4.17 bcde 39.1
24 Rhizojal TP3 31.7 abc 19.1 1.25 a 0.52 bc 282 abcd 110 abc 4.26 ab 37.0
25 Rhizomich CR1 36.4 ab 19.7 1.04 abcde 0.7 ab 199 bcd 113 abc 4.10 cdefg 37.8
26 Rhizomich CR2 31.8 abc 19.0 0.97 bcde 0.47 bc 287 abcd 100 abc 4.24 abc 39.5
27 Rhizomich CR3 29.5 abc 20.0 1.10 abcde 0.55 bc 233 bcd 94 abc 3.97 ghi 40.8
Testigo absoluto (TA) 28.09 bc 18.2 0.97 bcde 0.48 bc 162 d 90 abc 3.49 no 39.4
Testigo fertilizado (TF) 32.1 abc 19.3 1.13 abcd 0.47 bc 195 bcd 65 bc 4.38 a 37.1
Valor máximo 37.2 20.8 1.25 0.86 395 137 4.38 43.2
Valor mínimo 27.2 17.4 0.85 0.39 162 49 3.45 34.9
Promedio 32.2 18.9 1.05 0.53 256 87.85 3.97 39.1
CV (%) 10.65 8.94 10.39 20.15 23.18 30.83 0.98 8.36
Tukey 0.05 7.87 NS 0.25 0.25 136.2 62.1 0.13 NS

LV = longitud del vástago; LR = longitud de raíz; PSV = peso seco del vástago; PSR = peso seco de raíz; NN = número de nódulos; PSN = peso seco de nódulos; NT = porcentaje de nitrógeno total; CL = contenido de clorofila (valores SPAD). SPAD = Soil Plant Analysis Development. Letras diferentes en cada columna denotan diferencias estadísticamente significativas con base en la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

LV = stem length; LR = root length; PSV = stem dry weight; PSR = root dry weight; NN = number of nodules; PSN = dry weight of nodules; NT = percentage of total nitrogen; CL = chlorophyll content (SPAD values). SPAD = Soil Plant Analysis Development. Different letters in each column denote statistically significant differences based on Tukey’s test (P ≤ 0.05).

Longitud de vástago. En LV la cepa Rhizojal SA3 (37.2 cm) fue superior al testigo absoluto (28.1 cm) e igual al testigo fertilizado (32.1 cm). Cinco cepas iguales a Rhizojal SA3 mostraron alturas mayores a los 35 cm: Rhizojal VC3, Rhizojal BH1 y Rhizojal BH3 de origen silvestre y Rhizojal ZAT2 y Rhizomich CR1 de origen cultivado (Cuadro 2). Otros trabajos también consignan diferencias entre cepas en esta variable (Mayz et al., 2010; Liriano et al., 2012).

Longitud de raíz. Aunque existen antecedentes sobre efectos positivos de algunas cepas sobre la longitud de raíz (Karaca y Uyanöz, 2012); en la presente investigación no se detectaron efectos de las cepas sobre esta variable, probablemente por la poca profundidad del contenedor utilizado (14 cm).

Peso seco de vástago. En PSV Rhizojal ZCB3 (1.25 g) y Rhizojal TP3 (1.25 g) ambas de origen cultivado, superaron al testigo absoluto (0.97 g). La cepa Rhizojal ZCB1 (1.21 g) también de frijol cultivado, mostró alto valor en esta variable. En evaluación de cepas por FBN, la variable PSV ha sido uno de los parámetros más utilizados y confiables (Ferrera-Cerrato et al., 1990; Hernández et al., 1999; Mayz et al., 2010; Rahmani et al., 2011).

Peso seco de raíz. En esta variable sólo la cepa Rhizojal BH3 de origen silvestre con peso seco de 0.86 g, fue superior a los dos tratamientos testigo (TA, 0.48 g y TF, 0.47 g); Rhizojal ZMA1, Rhizojal ZCB1 y Rhizojal CR1 de frijol cultivado, fueron iguales a Rhizojal BH3.

Número de nódulos. Seis cepas superaron al testigo absoluto en NN (162 nódulos), sobresalieron Rhizojal CV3 colectado en frijol silvestre y Rhizojal ZGZ3 y Rhizojal ZCB3 obtenidos en frijol cultivado, con más de 340 nódulos por planta. Esta variable se considera importante en la evaluación de cepas por FBN (Keneni et al., 2010; Cardoso et al., 2011; Liriano et al., 2012; Granda et al., 2014).

Peso seco de nódulos. La cepa Rhizojal ZCB3 presento 137 mg de PSN, colectada en frijol cultivado, fue superior al tratamiento testigo fertilizado con 65 mg; cepas iguales a Rhizojal ZCB3 y con valores altos, fueron Rhizojal VC3, Rhizojal ZAT1 y Rhizojal TP2. El análisis de varianza registró un alto coeficiente de variación (30.8%), situación que restringió una mejor discriminación en PSN entre las cepas evaluadas.

Nitrógeno total. En porcentaje de nitrógeno total del vástago, 25 cepas superaron al testigo absoluto (3.49%) y cuatro fueron estadísticamente iguales al testigo fertilizado (4.38%): Rhizojal BH1 de origen silvestre y Rhizojal ZGZ2, Rhizojal TP3 y Rhizomich CR2 de frijol cultivado. Esta variable también ha sido utilizada por muchos investigadores, quienes consignan valores entre 4.1 a 5.39% (Ferrera-Cerrato et al., 1990), que son similares a lo obtenido en la presente investigación.

Contenido de clorofila. No se encontraron diferencias significativas entre cepas, sin embargo, se detectaron diferencias en producción de materia seca y porcentaje de nitrógeno total, y aunque se esperaban diferencias significativas en el contenido de clorofila por estar relacionada directamente con el contenido de nitrógeno, sin embargo, la medición de esta variable es indirecta mediante unidades de intensidad de coloración.

El análisis de resultados de las variables con diferencias significativas, permitió identificar las cepas con valores altos en cada caso. Las cepas seleccionadas en más de tres ocasiones, fueron Rhizojal VC3 y Rhizojal SA2 colectadas en frijol silvestre y Rhizojal ZCB3, Rhizojal TP2 y Rhizojal CR1 obtenidas en frijol cultivado.

Índices de Eficiencia

Los índices de eficiencia por cepa y variable (índices simples) y por grupos de variables (índices compuestos), se muestran en el Cuadro 4. Por índices de eficiencia simples, al seleccionar las cuatro cepas con los valores mayores en cada variable, Rhizojal ZCB3 se escogió en cuatro ocasiones y Rhizojal VC3, Rhizojal ZCB1, Rhizojal TP2 y Rhizojal TP3 en dos casos cada una. De la misma manera, al seleccionar las cuatro cepas con los valores mayores en los índices compuestos, en índice de eficiencia en nodulación (IEN) fueron mejores Rhizojal VC3, Rhizojal ZGZ3, Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2; por índice de eficiencia en fijación (IEF), fueron seleccionadas Rhizojal BH3, Rhizojal ZCB3, Rhizojal TP2 y Rhizomich CR1 y por índice de eficiencia general, Rhizojal VC3, Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2 y Rhizojal TP3.

Cuadro 4: Índices de eficiencia en fijación biológica de nitrógeno (FBN) por variable y grupos de variables en 27 cepas de Rhizobium spp. recolectadas en frijol silvestre y cultivado 

Table 4: Efficiency indices in biological nitrogen fixation (BNF) by variable and groups of variables in 27 Rhizobium spp. strains collected in wild and cultivated beans. 

Número cepa Cepa NN PSN PSV PSR NT IEN IEF IEG
1 Rhizojal VC1 107 77 85 88 101 92 91 91
2 Rhizojal VC2 83 55 93 99 98 69 97 86
3 Rhizojal VC3 151 135 97 78 103 143 93 113
4 Rhizojal BH1 105 68 96 88 110 86 98 93
5 Rhizojal BH2 69 73 81 101 93 71 92 83
6 Rhizojal BH3 68 71 95 160 101 69 119 99
7 Rhizojal SA1 102 65 91 97 96 84 95 90
8 Rhizojal SA2 119 97 93 116 106 108 105 106
9 Rhizojal SA3 91 98 90 97 93 95 93 94
10 Rhizojal ZMA1 123 115 96 121 92 119 103 109
11 Rhizojal ZMA2 109 86 99 91 101 97 97 97
12 Rhizojal ZMA3 106 104 106 86 99 105 97 100
13 Rhizojal ZGZ1 88 98 91 102 94 93 96 95
14 Rhizojal ZGZ2 109 79 88 89 107 94 95 94
15 Rhizojal ZGZ3 131 114 102 73 93 122 89 102
16 Rhizojal ZAT1 82 136 102 102 105 109 103 106
17 Rhizojal ZAT2 120 115 113 76 87 117 92 102
18 Rhizojal ZAT3 73 73 107 86 98 73 97 87
19 Rhizojal ZCB1 81 83 116 123 91 82 110 99
20 Rhizojal ZCB2 80 103 110 112 102 91 108 101
21 Rhizojal ZCB3 130 154 120 102 105 142 109 122
22 Rhizojal TP1 92 91 107 91 104 91 101 97
23 Rhizojal TP2 102 139 115 104 105 120 108 113
24 Rhizojal TP3 108 124 120 97 107 116 108 111
25 Rhizomich CR1 76 127 100 130 103 102 111 107
26 Rhizomich CR2 110 113 93 88 107 111 96 102
27 Rhizomich CR3 89 106 97 102 100 97 100 99
Media silvestres 99 82 91 103 100 91 98 95
Media cultivados 101 109 105 99 100 105 101 102
Media general 100 100 100 100 100 100 100 100

LV = longitud del vástago; LR = longitud de raíz; PSV = peso seco del vástago; PSR = peso seco de raíz; NN = número de nódulos; PSN = peso seco de nódulos; NT = porcentaje de nitrógeno total; IEN = índice de eficiencia en nodulación; IEF = índice de eficiencia en fijación de nitrógeno; IEG = índice de eficiencia general en fijación biológica de nitrógeno.

LV = stem length; LR = root length; PSV = stem dry weight; PSR = root dry weight; NN = number of nodules; PSN = dry weight of nodules; NT = percentage of total nitrogen; IEN = efficiency index in nodulation; IEF = nitrogen fixation efficiency index; IEG = index of general efficiency in biological nitrogen fixation.

Utilizando índices de eficiencia y la metodología de selección practicada, se aprecia que las cepas Rhizojal VC3 de origen silvestre, Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2 de frijol cultivado, están presentes tanto en la selección por índices simples, como en los tres casos de índices compuestos, excepto Rhizojal VC3 que no fue incluida en IEF. Rhizojal VC3 mostró alta eficiencia en nodulación, atributo que no se tradujo en alta eficiencia en fijación por su bajo valor en PSR. El resultado sugiere que la buena nodulación de una cepa, no siempre se traduce en alta eficiencia en FBN, por lo que deben considerarse variables como PSV, PSR y NT. El resultado del análisis por índice de eficiencia general (IEG), indica que las mejores cepas en FBN fueron Rhizojal VC3 (113) de origen silvestre y Rhizojal ZCB3 (122) y Rhizojal TP2 (113) colectadas en variedades de frijol cultivado. Estas cepas también pertenecen al grupo de cinco rizobios seleccionados por su valor per se en las variables de efectos significativos (Cuadro 3).

El Cuadro 4 muestra también los promedios de los índices de eficiencia simples y por grupos, para el conjunto de cepas colectadas en frijol silvestre y en frijol cultivado. Se aprecia una tendencia de mayor eficiencia en las cepas de frijol cultivado, especialmente en los índices individuales PSN y PSV, así como en los índices compuestos IEN e IEG. Los índices de eficiencia han sido poco utilizados hasta ahora en la evaluación y selección de cepas de Rhizobium. Bécquer et al. (2012) utilizaron los índices de nodulación (IN) e índice de eficiencia de la inoculación (IEI); en el primero usó datos de nodulación y en el segundo utilizó el peso seco del vástago. La ventaja de trabajar con índices carentes de unidades de medición, permite hacer comparaciones y discriminación entre cepas para variables individuales y por grupos de variables de interés, como se hizo en el trabajo presente. Igualmente, la combinación de lo observado en la respuesta de las cepas por su valor per se para las variables registradas y por su valor en los índices de eficiencia individuales o compuestos, permite generar resultados más confiables.

Componentes principales

El análisis de componentes principales (CP) de las 27 cepas de Rhizobium y las ocho variables registradas, mostró que los tres primeros explicaron 62.22% de la varianza total, donde el CP1 aportó 27.83% y el CP2 contribuyó con 18.45%. El análisis gráfico de los valores del CP1 y CP2 de mayor contribución a la varianza total, se muestra en la Figura 1. Al observar los valores del CP1, las cepas se separaron en dos conglomerados principales; del lado negativo y con menor valor en la escala, se ubicaron todas las cepas procedentes de la forma silvestre de frijol, excepto la número 3 (Rhizojal VC3) y número 8 (Rhizojal SA2) situadas del lado positivo; del lado positivo se ubicó la mayoría de los rizobios colectados en raíces de frijol cultivado, excepto los identificados con los números 10, 13, 14 y 25.

Figura 1:  Ubicación de las 27 cepas y comportamiento de los vectores-variable con base en el análisis de componentes principales (CP) de ocho variables cuantitativas de Rhizobium

Figure 1:  Location of the 27 strains and behavior of the vector-variables based on the principal component analysis (PC) of eight quantitative variables of Rhizobium

Las variables asociadas de forma importante al CP1 fueron PSV y PSN; variables asociadas al CP2, fueron NN y PSR. En la Figura 1 y del lado positivo del CP1, se observa un grupo de vectores-variable conformado por LR, CL, PSV, NT y PSN, por el ángulo agudo formado por sus líneas, se puede afirmar que muestran correlación positiva alta. La figura muestra también que las variables NN, PSN y PSV estuvieron bien representadas, NT y LR mal representadas y que la variable LV fue poco relevante en este estudio.

Conclusiones

Los resultados mostraron diferencias significativas entre las 27 cepas de Rhizobium spp. en seis de las ocho variables registradas para evaluar la fijación biológica de nitrógeno. Los índices de eficiencia por variable y por grupos de variables, también mostraron diferencias entre las cepas evaluadas. El componente principal 1 separó a la mayoría de los rhizobios en dos grupos; del lado negativo se ubicaron las cepas de frijol silvestre y del lado positivo las de frijol cultivado. Los resultados mostraron evidencia de mayor eficiencia general en FBN, de las cepas obtenidas en frijol cultivado. Las cepas seleccionadas por su valor per se en las variables de efectos significativos y por índices de eficiencia en la fijación biológica del nitrógeno, fueron Rhizojal VC3 de frijol silvestre y Rhizojal ZCB3 y Rhizojal TP2 de frijoles cultivados. Los índices de eficiencia por variable y por grupos de variables, mostraron ser útiles en la evaluación e identificación de cepas de Rhizobium eficientes en fijación biológica del nitrógeno. Los resultados sugieren que existe potencial para identificar cepas de Rhizobium eficientes en la FBN para su uso en el frijol cultivado, en la región occidente de México.

Declaración de Ética

No aplicable.

Consentimiento para Publicación

No aplicable.

Disponibilidad de Datos

Los conjuntos de datos utilizados o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Fondos

La investigación fue financiada con fondos internos institucionales de la Universidad de Guadalajara.

Contribución de los Autores

Conceptualización: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Eduardo López-Alcocer, José de Jesús López-Alcocer. Metodología: José de Jesús López-Alcocer, Eduardo López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Software: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Validación: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte, Ramón Rodríguez-Macías, Eduardo López-Alcocer. Análisis formal: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Investigación: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Recursos, Curación de datos: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Preparación del borrador original: José de Jesús López-Alcocer, Rogelio Lépiz-Ildefonso. Revisión y edición: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte, Ramón Rodríguez-Macías, Eduardo López-Alcocer. Visualización: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte. Supervisión: Rogelio Lépiz-Ildefonso, Diego Raymundo González-Eguiarte. Administración del proyecto: Rogelio Lépiz-Ildefonso. Adquisición de fondos: Rogelio Lépiz-Ildefonso.

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1Rogelio Lépiz-Ildefonso, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara.

Recibido: 11 de Octubre de 2019; Aprobado: 14 de Mayo de 2020

Autor para correspondencia (rogelio.lepiz@academicos.udg.mx)

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