Introducción

La yaca (A. heterophyllus), tiene gran importancia económica para las regiones productoras de Nayarit. El fruto. El cual se comercializa en fresco o industrializado, es rico en vitaminas, carbohidratos y minerales. El estado de Nayarit concentra más del 90

% de la superficie plantada nacional (1,632.95 ha), con un rendimiento de 26 t ha-1, correspondiente a un valor de producción de 441 millones de pesos.

Entre los problemas fitosanitarios de importancia económica en este frutal destacan enfermedades fúngicas en inflorescencias, frutos y ramas. Los hongos pertenecientes a la familia Botryosphaeriaceae afectan una gran diversidad de especies botánicas e inducen síntomas como pudriciones, cánceres, muerte de ramas y muerte o declinamiento general del árbol, entre otros. Especies del género Lasiodiplodia atacan más de 500 especies de plantas, principalmente frutales tropicales y subtropicales comercialmente importantes (Luoye et al., 2020; ^{Abdollahzadeh et al., 2010}). Los síntomas progresivos de muerte descendente (MD) inducidos por Lasiodiplodia son marchitamiento en ápices de ramas periféricas o anuales, las hojas se tornan cafés y mueren, posteriormente caen y la rama muestra apariencia seca. Es común observar ramas contiguas secas y el declinamiento o muerte del árbol.

L. theobromae es considerada una especie capaz de inducir una severidad de hasta 100

%. La presencia de exudado gomoso oscuro en la corteza y sistema vascular necrosado en guanábana (A. muricata) son los principales síntomas reportados para L. theobromae. Comportamiento similar se ha observado en otros frutales. En macadamia (Macadamia integrifolia), causa necrosis del ápice, pudrición de pedúnculo y MD. En mango (M. indica), mamey (Pouteria sapota), vid (Vitis vinifera) y lima persa (C. latifolia) se ha consignado pudrición de pedúnculo, cánceres en tallo y MD causados por L. citricola y

L. pseudotheobromae (^{Valle de la Paz et al., 2019}; ^{Polanco et al., 2019}; ^{Dukare et al., 2019}; ^{Abdollahzadeh et al., 2010}). En Nayarit se reportó a L. theobromae como agente causal de pudrición blanda en frutos de yaca (A Betancourt y G. Luna-Esquivel. No publicado). Sin embargo, no se consigna su participación etiológica en la MD de esta especie frutal. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue identificar al agente causal de MD en A. heterophyllus en huertos comerciales del estado de Nayarit, México. La metodología para esta investigación se desarrolló a partir de cinco cepas de Lasiodiplodia de la colección de hongos del Laboratorio de Parasitología Agrícola de la UAN. Estas cepas se aislaron originalmente de frutos de yaca y de ramas con MD de árboles de mango, lima persa, guanábana y aguacate localizados en zonas productoras de Nayarit (Cuadro 1). Estas cepas se identificaron previamente mediante sus caracteres morfológicos de macro y microscópicos en colonias cultivadas en medio de cultivo PDA

a 7 días de edad a 28±2 °C, mediante las claves de ^{Abdollahzadeh et al. (2010}).

La patogenicidad de cada aislado se evaluó en enero 2023 en 18 árboles de un año de yaca (tres por tratamiento) en condiciones de vivero con malla sombra al 50 %, en Xalisco, Nayarit (21° 25' 45.3'' N y -104° 36' 46'' O; a 930 m de altitud). A los árboles experimentales, con un bisturí estéril, se les retiró en un solo sitio parte de la epidermis (0.4 x 1 cm de área) en el tallo principal o rama según las características del árbol, para exponer el tejido leñoso (aproximadamente a 65 cm de altura a partir de la base del tallo). Sobre el tejido xilemático expuesto de cada planta experimental se inoculó con un disco PDA de 5-10 mm (explante) con crecimiento fúngico de 7 días. Árboles inoculados con discos de PDA sin crecimiento de hongo, se usaron como testigos. La zona inoculada de los árboles experimentales se cubrió con algodón estéril húmedo y papel ‘film’ para mantener condiciones de humedad y evitar contaminación externa.

A partir de los árboles de yaca que desarrollaron necrosis o muerte regresiva de ramas, se reaislaron y verificaron morfológica y molecularmente los aislados inoculados. Para la identificación molecular, los aislados se cultivaron sobre PDA a 25±2 °C por 7 días. Se recuperó el crecimiento micelial y extrajo el ADN genómico (ADN) mediante el método CTAB II de acuerdo con ^{Allers y Lichten (2000}).

Las condiciones de amplificación para la PCR con los cebadores ITS4/ITS5 fueron; una etapa inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, 38 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 60 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 1 min, y una etapa final de extensión a 72 °C por 4 min. Para los cebadores EF-728/EF-986 las condiciones fueron; desnaturalización a 95 °C por 4 min, 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 min, alineamiento a 55 °C por 1 min, extensión a 72 °C por 2 min, y una etapa final de extensión a 72 °C por 10 min. Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5 % con amortiguador TBE 1X a 80 V por 1 h y luego, secuenciados por Macrogen Inc (Seoul, Korea).

Los resultados de la aplicación de los postulados de Koch demostraron que L. theobromae fue patogénico en yaca. Los síntomas iniciaron en los 15 días después de la inoculación con necrosis de ápices y posterior marchitamiento de hojas y avance descendente del tejido necrótico. Los síntomas a los 60 días incluyeron marchitez en ápices de ramas, rajadura y necrosis de corteza en tallo, y MD de plantas. Estos síntomas fueron similares a los reportados en guanábana, macadamia, mango, vid mamey y lima persa (^{Valle de la Paz et al., 2019}; ^{Polanco et al., 2019}; ^{Dukare et al., 2019}; ^{Abdollahzadeh et al., 2010}). En algunos casos, el daño descendió hasta la base de ramas secundarias o tallo, síntomas coincidentes a los causados por L. pseudotheobromae en Ormosia pinnata (Luoye ^{Li et al., 2020}).

Todos los aislados de Lasiodiplodia necrosaron la madera de la zona inoculada e indujeron MD en los árboles inoculados. El aislado LG4 proveniente de guanábana fue el más agresivo ya que el daño se extendió hasta la base del tallo y causó la muerte del árbol. El aislado LY1 proveniente de frutos de yaca provocó fisuras (rajaduras) en la corteza del tallo cercano a la zona de inoculación. Los aislados LM2, LA5 y LL3 provenientes de mango, aguacate y lima persa, respectivamente, solo indujeron secamiento de ramas apicales con tendencia descendente.

Después del re-aislamiento de los aislados fúngicos a partir de los tejidos sintomáticos de árboles jóvenes de yaca, se confirmó su identidad como L. theobromae mediante sus caracteres morfológicos microscópicos (Figura 1).

Figura 1 A. Cultivo de Lasiodiplodia a 3 día en PDA. B. Cultivo de Lasiodiplodia después de 7 en PDA. C. Hifas café marrón septadas vista en microscopio compuesto a 40X. D. Conidios característicos bicelulares obscuros a la maduración en microscopio compuesto a 40X. 

De los productos de PCR se obtuvieron amplicones de 600 y 350 pb para las regiones ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)/ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) y EF-728 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)/ EF-986

(TCCTCCGCTTATTGATATGC), respectivamente. La secuencia consenso de los productos de PCR fue 530 y 280 pb. Las cinco secuencias de los aislados fúngicos comparten de un 99 a 100% de similitud de nucleótidos con secuencias publicadas previamente de las regiones ITS en el GenBank (OP725658.1).

Los resultados sugieren que la virulencia (la capacidad de causar enfermedad, sensu Vanderplank) de L. theobromae, es indistinta de la planta hospedante, al ser capaz de inducir MD en diversos frutales tropicales o subtropicales, distintos a aquellos de donde fueron aislados. Sin embargo, la intensidad de síntomas diferenciados sugiere variabilidad patogénica (i.e. agresividad) del hongo en función del hospedero. Los árboles testigo, no mostraron síntomas. ^{Dukare et al. (2019}) documentaron la patogenicidad de un aislado de L. theobromae proveniente de guayaba (Psidium guajava) en frutos de mango inoculados en poscosecha.

Plantas de lima persa mostraron clorosis en hojas, MD de ramas, formación de cánceres y exudados gomosos a 22 días después de haber sido inoculadas con L. citricola,

L. pseudotheobromae y L. theobromae (^{Valle de la Paz et al., 2019}). En naranjo dulce (C. sinensis), ^{Polanco y colaboradores (2019}) reportaron marchitez, necrosis y MD de ramas, así como lesiones necróticas exteriores inducidas por L. theobromae a 32 días después la inoculación. Ese mismo hongo en mamey causó lesiones necróticas en ramas a los 30 días. Dos años después se detectó MD de brotes vegetativos (^{Tovar-Pedraza et al., 2012}).

En conclusión, cinco aislados de L. theobromae provenientes de frutos de yaca, y de MD de ramas de mango, aguacate, limón persa, y guanábana indujeron síntomas de MD de ramas de yaca (Artocarpus heterophyllus) confirmándose los postulados de Koch. Los síntomas iniciaron con pudrición de ápices, seguido de lesiones necróticas internas en ramas y tallos y finalmente la muerte del árbol. Se reporta por vez primera a L. theobromae como causante de MD en árboles de A. heterophyllus en Nayarit, México. El aislado LG4 proveniente de guanábana fue altamente agresivo al causar la muerte del árbol a los 60 días después de ser inoculados. El aislado de fruto de yaca fue el segundo en agresividad con fisuras de ramas.