Introducción

En México, se cultiva la jamaica (Hibiscus sabdariffa) en diversas regiones tropicales y subtropicales bajo condiciones de secano. Guerrero es el principal productor de esta especie con 13,793 ha cultivadas (SIAP, 2025). Diversas enfermedades afectan este cultivo, de las cuales la “pata prieta” causada por Phytophthora parasitica y el manchado de los cálices ocasionado por Corynespora cassiicola, son las que tienen mayor incidencia e impacto económico (^{Ortega-Acosta et al., 2015}a; 2015b; Ortega-Acosta et al., 2020). En 2017, se observó una nueva enfermedad en este cultivo en los municipios de Tecoanapa y Ayutla, Guerrero, denominada localmente como “bola” de los cálices. Inicialmente la incidencia era baja; sin embargo, incrementó en los posteriores ciclos de cultivo. Con base en lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue conocer el agente causal de esta enfermedad mediante la amplificación parcial del gen factor de elongación EF-1α y su análisis filogenético.

Muestreo de cálices. Se recolectaron 15 cálices de jamaica con tizón y 15 asintomáticos (Figura 1) de cada una de tres variedades: “Criolla de Guerrero”, “China Negra” y “Sudán” en las localidades de San Miguel (N 16°59'15.4", W 99°05'56.0") y San José La Hacienda (N 16°58'30.7", W 99°03'29.1"), ambas pertenecientes al municipio de Ayutla, así como en Tecuantepec (N 16°59'58.9", W 99°15'10.4") y Saucitos (N 16°59'14.0", W 99°18'16.8") en el municipio de Tecoanapa.

Figura 1 Síntomas del tizón de los cálices en tres variedades de jamaica; se observa que la cápsula queda expuesta debido al atizonamiento de los cálices; A. “Criolla de Guerrero”. B. “China Negra”. C. “Sudán”. Cálices asintomáticos de las diferentes variedades; D. “Criolla de Guerrero”, E= “China Negra” y F= “Sudán”. 

Identificación morfológica y molecular. Los cálices recolectados, se colocaron en bolsas de plástico para su traslado al laboratorio de Virus Fitopatógenos, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo. A partir de los cálices con tizón se cortaron fragmentos de tejido de la zona de avance de la lesión, se desinfestaron con hipoclorito de sodio 1 % durante dos minutos, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se colocaron sobre papel absorbente estéril para eliminar el exceso de humedad durante 10 minutos. Los fragmentos de tejido se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo PDA y se incubaron a 28 °C. El proceso anterior se realizó también tomando tejido de la parte media de cálices asintomáticos. De manera consistente se tuvo crecimiento micelial a partir de cálices con síntomas, por lo que se obtuvieron colonias fungosas puras por punta de hifa y se tomaron mediciones en cinco de ellas. El hongo obtenido se identificó morfológicamente con las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (1998}), ^{Nelson et al. (1983}) y ^{Leslie y Summerell (2006}).

Para conocer molecularmente la especie de este hongo, se seleccionaron cuatro aislamientos denominados BOLCHIN, BOLCHIN-RE (aislados de jamaica “China Negra”), BOLSUD y BOLCRIO (aislados de jamaica “Sudán” y “Criolla de Guerrero”, respectivamente) y de ellos se extrajo ADN con el método AP (^{Sambrook y Russel, 2001}) para amplificar un fragmento de 258 pb del gen factor de elongación-1α (EF-1α) con los iniciadores EF1-728F/EF1-986R (^{Carbone y Kohn 1999}). La amplificación se realizó en un termociclador Techne-TC-512^® siguiendo el programa descrito por ^{Shimomoto et al. (2011}). Los productos obtenidos de PCR fueron purificados y secuenciados por el método de Sanger (Macrogen Inc. Corea). Las secuencias fueron editadas y ensambladas con el programa MEGA X (^{Kumar et al., 2018}) y fueron comparadas en la base de datos del NCBI y Fusarium MLST (^{O'Donnell et al., 2012}) (https://fusarium.mycobank.org/).

Pruebas de patogenicidad. Para cumplir con los postulados de Koch, un aislamiento de

F. sulawesiensis (BOLCHIN) y uno de F. pernambucanum (BOLCRIO), se inocularon por separado en 15 cálices sanos de jamaica de la variedad “Criolla”. Con un palillo de dientes estéril, se tomó micelio de una colonia pura de cada asilamiento desarrollada en PDA de cinco días de crecimiento y se insertó en cuatro puntos equidistantes alrededor de la base de los cálices. Como control negativo, se tuvieron 10 cálices a los que se les realizaron heridas con palillos de dientes estériles de la manera antes indicada. Todas las plantas se mantuvieron en invernadero cubiertas con una bolsa de plástico trasparente durante 48 h, después de lo cual se retiró.

Análisis filogenético. Se realizó un análisis filogenético de las secuencias del fragmento amplificado del gen EF-1α de los cuatro aislamientos en estudio (BOLCHIN, BOLCHIN- RE, BOLSUD y BOLCRIO) con las disponibles en el GenBank (^{Xia et al., 2019}). Después del alineamiento múltiple de las secuencias, se llevó a cabo un análisis de inferencia bayesiana (BI) utilizando el software MrBayes v.3.2.1 (^{Ronquist et al., 2012}). Para ello, se implementaron cuatro corridas independientes de Markov Chains Monte Carlo (MCMC), cada una con dos análisis paralelos de cuatro cadenas. Las cadenas se iniciaron a partir de árboles aleatorios y se ejecutaron durante 1,000,000 de generaciones, tomando muestras cada 1,000 generaciones. El 25 % de los árboles filogenéticos iniciales generadas se descartó como parte de la fase de burn-in en cada análisis. A partir de los árboles restantes, se calcularon las probabilidades posteriores (PP) para respaldar los nodos en la topología final. El árbol filogenético se enraizó con la secuencia de F. concolor (GQ505674). Se muestrearon 1,502 árboles y la desviación estándar de las frecuencias de división fue 0.009744. Además, se realizó un análisis de máxima verosimilitud (ML) en raxmlGUI 1.5b2 (^{Silvestro y Michalak, 2012}). Se implementó el método de bootstrapping rápido con 1,000 réplicas, utilizando el modelo general reversible en el tiempo (GTR) junto con una distribución gamma (G) para corregir la heterogeneidad en las tasas de sustitución. Los árboles se visualizaron y editaron en el software FigTree v1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/).

En las parcelas muestreadas de ambos municipios se observó una incidencia promedio de 5 % de plantas enfermas. Los síntomas que se observaron fue un tizón que cubrió totalmente los cálices mientras que los epicálices no se vieron afectados, pero la cápsula donde se encuentra la semilla quedó expuesta (Figura 1 A, B y C), contrastando con los cálices asintomáticos que cubren totalmente la cápsula (Figura 1 D, E y F).

Identificación morfológica y molecular. Se obtuvieron 10 colonias, las cuales tuvieron rápido crecimiento en medio PDA, mostraron consistencia algodonosa, color naranja intenso en el centro y más claro en los bordes (Figura 2A-B). Produjeron abundantes macroconidios de 3-5 septos, de rectos a ligeramente curvos, de 47.8-10.3 x 4.6-2.4 µm (largo x ancho), con presencia de monofiálides, macroconidios con célula basal en forma de pie (Figura 2 C-E) así como clamidosporas en cadena (Figura 2 F-G). Las características morfológicas observadas fueron consistentes para Fusarium sp.

Molecularmente, los aislamientos BOLCHIN y BOLCHIN-RE presentaron 100 % de identidad con la filoespecie Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC)-16; por su parte, los aislamientos BOLSUD y BOLCRIO tuvieron 100 % de identidad con FIESC-17; las secuencias de los aislamientos en estudio se depositaron en la base de datos del GenBank (MH392482, MH392483, MH392484 y MH392485). Las filoespecies de FIESC fueron recientemente nombradas como Fusarium sulawesiensis (FIESC-16) y Fusarium pernambucanum (FIESC-17) (^{Maryani et al., 2019}; ^{Santos et al., 2019}; ^{Xia et al., 2019}).

Se sabe que las especies de FIESC producen la micotoxina tricoteceno (^{O’Donnell et al., 2013}). Ya que en México los cálices de jamaica se utilizan principalmente para la preparación de bebidas refrescantes, es importante realizar estudios para evaluar si dicha toxina está presente.

Análisis filogenético. En el análisis filogenético, las cuatro cepas analizadas, se agruparon en el clado Incarnatum (Figura 3). Estos resultados fueron consistentes con lo obtenido en las bases de datos NCBI y Fusarium MLST. Los aislamientos BOLCHIN y BOLCHIN-RE se agruparon con F. sulawesiensis con valores de soporte de 0.97/88 (PP/BS) mientras que BOLSUD y BOLCRIO lo hicieron con F. pernambucanum con valores de soporte de 1/100 (PP/BS). Los resultados confirmaron la identificación de dichos aislamientos.

Figura 2 Características morfológicas del complejo de especies Fusarium incarnatum-equiseti. A-B = Colonias desarrolladas en PDA durante una semana a 28 °C. A = F. sulawesiensis aislamiento BOLCHIN. B = F. pernambucanum aislamiento BOLCRIO. C = Monofiálides del aislamiento BOLCHIN. D y E = Macroconidios con célula basal en forma de pie de F. sulawesiensis y F. pernambucanum, respectivamente. F y G = Clamidosporas en cadena de F. sulawesiensis y F. pernambucanum, respectivamente. 

Prueba de patogenicidad. A los 7 días después de la inoculación (ddi) se tuvo una flacidez y tizón en el cáliz (Figura 4A-B); no se observaron síntomas en las plantas control (Figura 4C). A partir de los 15 cálices inoculados de cada aislamiento, se realizó el reaislamiento y se obtuvieron colonias con las mismas características culturales y morfológicas de los aislamientos inoculados (BOLCHIN y BOLCRIO).

Figura 3 Árbol de máxima verosimilitud (ML), del complejo de especies Fusarium incarnatum-equiseti del gen parcial EF-1α. Topología similar se generó usando inferencia bayesiana (BI). Las probabilidades posteriores bayesianas (PP> 0.5) y los valores de soporte Bootstrap (BS> 50) se muestran en los nodos (PP/BS). Las secuencias de este estudio se encuentran en negrita. La barra de escala indica el número de cambios esperados por sitio. *F. sulawesiense actualmente reconocida como F. sulawesiensis (^{Xia et al., 2019}). 

Figura 4 Pruebas de patogenicidad en cálices de jamaica después de 12 días de la inoculación artificial en condiciones de invernadero. A= F. sulawesiensis aislamiento BOLCHIN. B= F. pernambucanum aislamiento BOLCRIO. C=Cáliz en el que únicamente se lesionó la parte basal con un palillo de diente estéril. 

En México, se han reportado dos enfermedades en cálices de jamaica: “mancha acuosa” causada por Pilidiella diplodiella (^{Correa-Sánchez et al., 2011}) y “manchado de cálices” causado por Corynespora cassiicola (^{Ortega-Acosta et al., 2015}a). Por otro lado, existen reportes de diferentes especies del género Fusarium, incluidas las del clado FIESC, ocasionando diversas enfermedades en jamaica como F. incarnatum (FIESC) asociado a la pudrición basal (Ortega-Acosta et al., 2015b). En países como Estados Unidos de América, Nigeria, Malasia y Egipto se ha reportado a F. equiseti, F. semitectum (FIESC), F. oxysporum y F. solani como causantes de marchitez y necrosis del tallo de jamaica (^{Ooi KH y Salleh, 1999}; ^{Amusa et al., 2005}; ^{Ploetz et al., 2007}; ^{Hassan et al., 2014}). En Malasia se reportó a F. camptoceras y F. nygamai como patógenos que infectan tejido foliar en plántulas de jamaica (^{Eslaminejad y Zakaria, 2011}).

En esta investigación F. sulawesiensis (FIESC-16) y F. pernambucanum (FIESC-17) fueron identificados por primera vez como causantes del tizón en cálices de jamaica (Hibiscus sabdariffa) en México. Adicionalmente, se reporta por primera vez a H. sabdariiffa como nuevo hospedante de F. sulawesiensis (FIESC-16) y F. pernambucanum (FIESC-17) a nivel mundial.