Origen y diversidad genética del ToBRFV

Las especies virales del género Tobamovirus son patógenos de importancia en cultivos de solanáceas, destacando por la sintomatología que inducen y la necesidad de métodos serológicos específicos para su identificación. A pesar de ello algunos síntomas producidos son similares entre las especies que las ocasionan, como son: TMV, ToMV, ToMMV y ToBRFV (^{Alon et al., 2021}). Algunos estudios reportan que TMV, ToMV y ToBRFV pueden producir infecciones mixtas en plantas de jitomate lo que dificulta su diagnóstico (^{Jamous et al., 2022}; ^{Yan et al., 2021}a). ToBRFV fue identificado por primera vez en 2014 en una provincia de Ohad al sur de Israel. Posteriormente, un brote en viveros de jitomate en Jordania, condujo al aislamiento nombrado como “Tom1-jo”, y el nuevo virus fue denominado tomato brown rugose fruit virus (^{Salem et al., 2016}; ^{Luria et al., 2017}). A través de análisis filogenéticos que incluyeron TMV, ToMV, ToMMV y BPMV Salem et al. (2016) validaron a ToBRFV como una nueva especie dentro del género Tobamovirus. Por otro lado (Luria et al., 2017) a partir de postulados de Koch, microscopía electrónica de transmisión (MET), determinación parcial de rango de hospedantes, y análisis de antisueros para descartar reactividad cruzada con otros virus, concluyeron que el aislamiento ToBRFV-IL mostró una alta identidad con el aislamiento jordano.

Los estudios biogenómicos actuales sobre ToBRFV, a raíz de nuevos brotes,han demostrado una variabilidad genética, con más del 99 % de identidad entre distintos aislamientos (Chanda et al., 2020). ^{Eichmeier et al. (2023}) encontraron una similitud del 99.3 al 100 % entre 50 genomas de ToBRFV, mientras que ^{Zhang et al. (2022}) diferenciaron claramente a los aislamientos de ToBRFV de TMV y ToMV en un estudio de 78 secuencias genómicas. ^{Yan et al. (2021}b) reportaron más del 99.6 % de similitud entre los aislamientos Tom1-Jo “KT383474.1”, ToBRFV IL y ToBRFV MX, sugiriendo un ancestro común para todos los aislamientos de ToBRFV (^{Oladokun et al., 2019}). Además, se ha identificado la recombinación de ToBRFV con otras especies virales, señalando a ToMMV como un progenitor secundario y a la cepa Ohio V de TMV como el principal progenitor (^{Salem et al., 2016}).

Un análisis filogenético basado en el gen ORF4/CP (Figura 1), agrupó a l34 aislamientos de Turquía, en el primer clado, mientras que 49 aislamientos se ubicaron en el segundo (^{Çelik et al., 2022}). Dos aislamientos franceses “MW284988.1, MW284987.1” fueron clasificados en el tercer clado, mientras que 12 aislamientos de distintas regiones que incluyen EE. UU. (MT002973.1), México (TBRFV-MXCP “MK319944.1, MW349655.1”), Holanda y Países Bajos “MW314116.1”, Italia “OK62464678.1”, Bélgica (OM515231.1) y Reino Unido (TBRFV.21930919) formaron el quinto grupo (^{Van de Vossenberg et al., 2020}. ^{Abrahamian et al. (2022})revelaron un análisis filogenético de aislados provenientes de EE. UU., México y Perú, donde reportan que la mayoría de estos se agrupan en el clado tres, evidenciando una diversidad genética limitada entre aislados a nivel mundial. ^{Eichmeier et al. (2023}) analizaron el genoma completo del virus, identificaron al aislamiento checo de ToBRFV “OP413740.1” como perteneciente a un grupo independiente dentro del quinto clado, diferenciándolo de otros aislamientos europeos. Este panorama subraya la complejidad de la genómica de ToBRFV y la influencia de múltiples factores en su evolución y relación con los hospedantes.

Figura 1 Análisis filogenéticos de secuencias reportadas en el NCBI de ToBRFV. Para la reconstrucción del árbol filogenético se utilizó el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11 mediante el modelo de Neighbor joining con 10,000 réplicas (Bootstrap). Con una distancia genética de 0.02. 

Características físico-moleculares del ToBRFV

El ToBRFV posee partículas con forma de varillas rígidas de 300 nm de largo y 18 nm de diámetro. El genoma es de ARN monocatenario de sentido positivo (ARNss+) de ~6,400 nt. Con cuatro marcos de lecturas abiertos (ORF1, 2, 3 y 4) distintos, que codifican dos complejos de proteínas relacionadas con la replicación de 126 kDa (ORF1a) y 183 kDa (ORF1b), la proteína de movimiento (PM) de ~30 kDa (ORF2) y la proteína de cubierta (PC) de ~17.5 kDa (ORF3), expresadas mediante ARN subgenómicos coterminales (^{Eichmeier et al., 2023}). Así mismo la

proteína 126 kDa tiene la capacidad de actuar como silenciador del ARN, mientras que la PM 30 kDa facilita la translocación del virus de célula a célula (^{Zhang et al., 2022}). Se ha señalado que la estrategia de control del ToBRFV se centra en la PC, la cual juega un papel crucial en el ensamblaje de las partículas virales y su desplazamiento a larga distancia dentro de la planta hospedera (Ishikawa et al., 2022).

Descripción de sintomatología

ToBRFV es un tobamovirus que se distingue por causar una variedad de síntomas en sus hospedantes, los cuales varían dependiendo del tipo de planta hospedante que afecta, la estación, la temperatura, las condiciones de crecimiento (invernadero o cielo abierto) y la edad de la planta en el momento de la infección (^{Caruso et al., 2022}). Estos síntomas tanto directos como indirectos impactan negativamente en la calidad y el valor comercial de los frutos, resultando en pérdidas significativas de la cosecha (^{Menzel et al., 2019}). El desarrollo de los síntomas puede variar según el cultivo y las condiciones ambientales (Figura 2A y C). En jitomate los síntomas

Figura 2 Síntomas manifestados en jitomate por ToBRFV cultivados en invernadero. A) Plantas de jitomate a 180 días de la siembra mostrando alta incidencia de ToBRFV; B) Irregularidades en la maduración de los frutos; C) Plantas en estado de colapso debido a la severidad alta de ToBRFV; D) Presencia de mosaicos, moteados y ampollamientos en las hojas. 

son sistémicos, mientras que en plantas como Nicotiana tabacum, N. glutinosa, N. clevelandii, N. benthamiana, Chenopodium amaranticolor entre otras especies, los síntomas son principalmente locales (^{Chanda et al., 2021}; ^{Vásquez-Gutiérrez et al., 2024}). Aunque, los tobamovirus en general comparten expresión de síntomas similares, como mosaicos y amarillamientos, ToBRFV se caracteriza por inducir un síndrome más severo que cualquier otra especie dentro de este género. Entre los síntomas foliares destacan mosaicos, ampollamientos, enrollamientos, deformaciones (Figura 2D), reducción de la lámina foliar y retraso en el crecimiento; mientras que en frutos se observan deformación, manchas marrones, moteados, maduración irregular (Figura 2B), manchas amarillas y necrosis tanto externa como interna (^{González-Concha et al., 2023}; ^{Jewehan et al., 2022}a; Vásquez-Gutiérrez et al., 2023a; ^{Zhang et al., 2022}). Esta diversidad de manifestaciones subraya la importancia de identificar y gestionar eficazmente la presencia de ToBRFV para minimizar su impacto en la producción agrícola.

Métodos de diagnóstico

Los métodos de diagnósticos inician a partir de la identificación de síntomas en planta, la observación de oscuros mosaicos, deformación y estrechamiento en hojas en los brotes jóvenes apicales y rugosidad color marrón en frutos, confirma la presencia de ToBRFV (^{Alfaro-Fernández et al., 2021}). En la actualidad existen alternativas para la identificación y detección del ToBRFV, estas se pueden clasificar en diferentes tipos: diagnóstico por plantas diferenciales, microscopía electrónica de transmisión (MET), serológico, tiras reactivas y moleculares (^{González-Garza, 2017}).

Diagnóstico por plantas diferenciales. Los tobamovirus poseen característica de expresión sintomática distintiva que permite diferenciarlos de otros géneros (^{Roistacher, 1991}). Hace algunos años se consideraba que ToBRFV sólo podía infectar de forma natural pimiento y jitomate como hospedantes naturales susceptibles (^{Luria et al., 2017}), estudios recientes demuestran que ToBRFV puede infectar de forma natural Convolvulus arvensis y Polycarpon tetraphyllum y servir como reservorio (Cultrona et al., 2024); sin embargo, ^{Vásquez-Gutiérrez et al. (2024}) identificaron que ToBRFV podía infectar 21 hospedantes de manera natural, confirmados por ELISA.

ToBRFV puede infectar más de 40 especies pertenecientes a cuatro familias: Amaranthaceae, Apocynaceae, Asteraceae y Solanaceae (Cuadro 1). Dado su cercanía filogenética con ToMV, ToBRFV tiene un rango de hospedantes similar (Chanda et al., 2020). La utilización de plantas diferenciales amplía la capacidad de diagnóstico para ToBRFV dado a la respuesta de hipersensibilidad (RH), aunque

puede complicarse por expresiones mixtas de diferentes especies de tobamovirus (González et al., 2017). El efecto de la inoculación mecánica del ToBRFV en plantas experimentales, desencadena una RH en el hospedante, de tal forma que aísla las partículas virales del ToBRFV, limitando la colonización sistémica del hospedante (^{Fidan et al., 2021}). Diversos autores han estudiado el rango de hospedantes experimentales para ToBRFV, principalmente son especies de las familias: Chenopodiaceae, Amaranthaceae y Solanaceae, mientras que, no infecta a especies de Brassicaceae, Cucurbitaceae y Verbenaceae (^{Yan et al., 2021}a; ^{Chanda et al., 2021}a). Las plantas indicadoras muestran síntomas sistémicos y locales, aunque algunas como Solanum tuberosum y S. melongena permanecen asintomáticas (Yan et al., 2021b). Sin embargo, en un reciente estudio realizado por ^{Vásquez-Gutiérrez et al. (2024}) reportaron que Solanum tuberosum al permanecer en contacto con plantas de jitomate infectadas con ToBRFV, expresaron síntomas visuales de amarillamiento, deformación de hojas, reducción de tamaño, los cuales fueron confirmados mediante ELISA.

Hospedantes alternos. ToBRFV ha demostrado ser uno de los patógenos con amplio rango de hospedantes potenciales, incluyendo cultivos y diversas malezas (^{Chanda 2021}a; ^{Zhang et al., 2022}; ^{Matzrafi et al. (2023}) (Cuadro 1). Las malezas juegan un papel importante en la diseminación del inóculo ToBRFV (Matzarafi et al., 2023), lo que subraya la importancia de una gestión integral que incluya el control de malezas para limitar la propagación del virus.

Diagnóstico microscópico. Los métodos microscópicos son considerados factores importantes en el diagnóstico, pero representan una imprecisión, debido a la variabilidad en el tamaño de las partículas virales entre diferentes especies (^{Luria et al., 2017}). La microscopía óptica especialmente cuando se combina con técnicas de fluorescencia es una herramienta que apoya al diagnóstico de tobamovirus mediante inclusiones virales en tejidos vegetales (^{Pepperkok y Ellenberg, 2006}). La clasificación de virus mediante inclusiones virales se realiza por géneros, dado que la mayoría de las especies de tobamovirus, poseen la particularidad de formar inclusiones hexagonales y en forma de aguja como el tobacco mosaic virus (^{Khamphirapaeng et al., 2017}), que a comparación del potato virus Y (especie Potyvirus yituberosi), producen cuerpo amorfos esféricos (Guo et al., 2022). Anteriormente las inclusiones del ToBRFV no habían sido descritas, recientemente en un estudio por ^{Vásquez-Gutiérrez et al. (2024}) reportaron la formación de cuerpos X, placas redondeadas y apiladas, como respuesta de infección al ToBRFV en tejidos de jitomate y tabaco. El microscopio electrónico de transmisión (MET), ha contribuido desde el primer avistamiento de ToBRFV por (Luria et al., 2017) para la identificación morfológica del virus (^{Zhang et al., 2022}), considerado a tal punto, como uno

de los métodos clásicos para visualizar tejidos vegetales (Home et al., 2018). El diagnóstico mediante MET brinda ventajas para la caracterización de las partículas virales, basándose en la clasificación de características morfológicas (^{Kitajima et al., 2004}). El inconveniente de la MET es que representa una imprecisión, ya que las partículas virales no suelen ser del mismo tamaño, lo que dificulta su identificación (^{Luria et al., 2017}). La microscopía electrónica también puede utilizarse para detectar alteraciones celulares durante las infecciones por ToBRFV, relacionadas con las inclusiones virales. A pesar de ser un patógeno recientemente identificado, la MET resultó ser un método importante, para su caracterización viral, y la observación de partículas virales.

^{Luria et al. (2017}); Cambrón-Crisantos et al. (2019); ^{Eichmeier et al. (2023}); ^{Fidan et al. 2021}); ^{Levitzky et al. (2019}); ^{Mahillon et al. (2022}) iniciaron muestreando foliolos y frutos infectados de jitomate cv. Mose e Ikram, con síntomas inusuales, posteriormente purificaron el virus desconocido de acuerdo con la descripción de Cohen et al. (2000). Con esto obtuvieron que las partículas virales mostraban un tamaño promedio de 265.6±56.2nm de largo y 19±1.41nm de diámetro, también mencionan que las partículas virales difieren de la procedencia de la muestra, pueden ser varillas cortas y alargadas.

Detección serológica de ToBRFV. La detección serológica de ToBRFV emplea técnicas como el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas tipo Sandwich de Doble Anticuerpo (DAS-ELISA), la inmunofluorescencia in situ y el Western blot para identificar la presencia del virus. Anteriormente estos métodos carecían de especificidad dificultando la distinción entre ToBRFV y especies relacionadas como TMV y ToMV, posiblemente debido a la reactividad cruzada entre los anticuerpos y la proteína de la cubierta (CP) de diferentes tobamovirus. ^{Luria et al. (2017}) caracterizaron serológicamente al ToBRFV, generando anticuerpos para la detección de la PC del virus, mediante DAS-ELISA con una dilución de (1: 12,000). El análisis de la especificidad de los anticuerpos contra el virus mostró una ligera reactividad cruzada con TMV y PMMoV. En campo es inusual que haya síntomas del virus con estas concentraciones virales, por lo que el diagnóstico que se realiza proviene directamente de foliolos sintomáticos con presencia del virus, lo que aumenta la precisión de resultados con DAS-ELISA.

^{Yan et al. (2021}b) desarrollaron anticuerpos monoclonales que reconocen espe-

cificamente la PC de ToBRFV sin reaccionar con TMV y ToMV, mejorando la sensibilidad y especificidad del diagnóstico. ^{Eads et al. (2023}) validaron una técnica DAS-ELISA Agdia® con sensibilidad analítica (64 a 320 pg mL-1) y una especificidad alta para ToBRFV, sin embargo, encontraron que produce una reacción cruzada con otros tobamovirus TMV, ToMV, ToMMV, con un límite analítico de detección superior a 10 000 ng mL-1 de virus purificado. ^{Luria et al. (2017}) implementaron el

método Western blot para diagnóstico con anticuerpos policlonales específicos para ToBRFV, analizando la intensidad de las bandas de la PC a través de una prueba t-student. El principio de la prueba western blot es similar a la técnica ELISA a partir de anticuerpos policlonales para la PC del ToBRFV. La inmunofluorescencia in situ, complementada por técnicas como el uso de fluoróforos específicos para microscopía de barrido láser, permite la detección directa de ToBRFV en muestras infectadas, diferenciando entre distintos tobamovirus (^{Klap et al., 2020}). Por otro lado, la prueba de inmunofluorescencia para microscopia de barrido láser se basa en la conjugación de los anticuerpos con Alexa Fluor 594® que es un fluoróforo brillante y estable capaz de emitir un rango rojo del espectro de color, corroborando la presencia de ToBRFV en la muestra analizada (^{Salem et al., 2022}). Otra de las variantes aplicadas a la inmunofluorescencia, es la tinción de semillas, tejidos vegetales y raíces, para la hibridación in situ por fluorescencia y detección microscópica. Para esto se tiñen los tejidos con una tinción de Alexa fluor 594®, para su posterior hibridación, y observación en un microscopio (^{Ragasová et al., 2022}). Estos métodos serológicos contribuyen no sólo para un diagnóstico más certero, sino, también para caracterizar el efecto fisicoquímico del ToBRFV en el hospedante infectado, ofreciendo herramientas valiosas para el manejo y control del virus.

Diagnóstico con tiras reactivas. Actualmente, el interés de encontrar nuevas alternativas que permitan un diagnóstico rápido del virus bajo condiciones de campo ha cobrado relevancia (^{Fillmer et al.,2015}; Li et al., 2019). Con la aparición del ToBRFV (^{Salem et al., 2016}; ^{Luria et al., 2017}) se empezaron a emplear ensayos inmunocromatográficos rápidos con tiras inmunológicas para las detecciones de virus de plantas, esto tomó relevancia en los últimos años, dado a su sensibilidad y diagnóstico rápido en condiciones de campo (Byzova et al., 2009). Las tiras inmunológicas Agdia® para ToBRFV, poseen especificidad para aislamientos detectados en Israel, Países Bajos, Italia, Alemania y México, que validan la detección previa durante el monitoreo en campo (^{Levitzky et al., 2019}; ^{Eldan et al., 2022}). Aun cuando el límite de detección del ToBRFV es de 200 ng mL-1, se han reportado reacciones cruzadas con virus pertenecientes al mismo género. Las tiras inmunológicas Agdia® para ToBRFV pueden reaccionar de forma cruzada con TMV, ToMV y ToMMV a bajas concentraciones del virus, por lo que la prueba debe validarse mediante ensayos moleculares (^{Wilstermann y Ziebell, 2019}). Recientemente ^{Eads et al. (2023}) evaluaron el límite de dilución para detección de ToBRFV de 1: 259,000 en tejido infectado con 64-320 pg mL-1 de virus purificado; por otro lado, validaron la utilización de tiras inmunológicas Agdia® para ToBRFV, donde reportan una leve reacción cruzada con TMV y ToMV, con un límite analítico de detección de 200 ng mL-1 de virus purificado, aun así, las tiras inmunológicas no mostraron reacción cruzada con otras especies parentales a ToBRFV. Además de

384 muestras positivas a ToBRFV todas resultaron ser positivas utilizando las tiras inmunológicas (Figura 3 A y B).

Figura 3 Procedimiento de detección rápida para ToBRFV con tiras inmunológicas Agdia®.selección de tejido sintomático (hojas jóvenes); B) Macerado y reacción positiva a ToBRFV, donde se observa la línea de control y la línea de prueba (ambas en color rojo). 

Técnicas moleculares para la detección de ToBRFV. La detección temprana mediante diagnóstico molecular del ToBRFV representa una oportunidad para reducir el riesgo de entrada y propagación del virus (^{Luigi et al., 2022}) por ello, se han desarrollado diferentes protocolos que se basan en la amplificación de ácidos nucleicos los cuales incluyen: reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR), PCR cuantitativa con transcripción reversa (RT-qPCR), y PCR digital (ddPCR) para detección en foliolos, frutos y semillas (^{Panno et al., 2019}b; Rodríguez et al., 2019; ^{Chanda et al., 2021}b; ^{Yan et al., 2021}b; Menzel y Winter, 2021). El desarrollo de estas técnicas moleculares ha cobrado relevancia para ampliar las estrategias de diagnóstico del virus en tiempo real. Debido a la variación de resultados y la eficacia de los métodos moleculares existentes, continuamente se han desarrollados nuevas técnicas que permiten la detección específica de genes en las proteínas virales del ToBRFV. Estos cebadores descritos en el Cuadro 2, se emplean para el diagnóstico preventivo del ToBRFV, lo cual reduce el riesgo de entrada a países con ausencia del virus.

^{Vargas-Hernández et al. (2022}) implementaron un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas (ddPCR) que permite la detección del virus partiendo de plásmidos recombinantes que codifican un gen específico de la cubierta del virus. Siendo el primer reporte de detección de ToBRFV en semillas de jitomate usando ddPCR. Sin embargo, la técnica no se ha implementado masivamente para su aplicación en campo. Otro método reciente es la aplicación de AmplifyRP XRT, una técnica basada en el principio molecular, que utiliza la amplificación de la polimerasa recombinasa. Esta técnica está diseñada para ser una herramienta hibrida de detección en campo y/o laboratorio. Por tanto, se considera como una técnica altamente sensible y precisa, con una sensibilidad analítica de 16 fg µL-1 y una especificidad analítica que abarca a todos los aislamientos del ToBRFV, sin producir reacciones cruzadas (^{Eads et al., 2023}).

La detección basada en la amplificación isotérmica por bucle (LAMPe) ofrece una alternativa eficiente y sólida para el diagnóstico de ToBRFV. ^{Sarkes et al. (2020}) describen el principio de esta técnica que se basa en la especificidad de un conjunto de cebadores; F3: TTGCAAGTCTTAGATGCG, B3: GGACACCGTCAACTAGG con un tamaño de 279 pb. FIP(F1c+F2): CCTTCTCCAACTGTCGCAAGTCACATGCTAGGAAGTACCAC, BIP (B1c+B2) CCGTGAGTTCTGAGTCAATGGTTGAGGCTCACCACCATCTCTTAA y loopF; CTCCATGCTCAT-

CATACCCAA. Los ensayos en LAMP se realizan en una máster mix colorimétrica de LAMP WarmStart (NEB Canadá). El programa de reacción consiste en un solo paso, donde los tubos se incuban a 65 °C durante 30 min, después de la incubación las reacciones se visualizan y los resultados se registran en fotografía. Los resultados positivos confirman la presencia del virus, cuando hay un cambio de color en la mezcla de reacción de rosa a amarillo. Estos resultados indican que LAMP puede detectar seis moléculas en una reacción de 25 μL siendo más específica que la RT-PCR. Por otro lado, LAMP-PCR, se ha estado utilizando en combinación con la tecnología de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas (por sus siglas en inglés, CRISPR), para la detección específica del ToBRFV en campo (Rizzo et al., 2022). La secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés), ha cobrado relevancia conforme a la aparición de nuevas tecnologías ómicas, las NGS siguen siendo dominantes en la detección de virus de plantas, debido a su alto rendimiento y bajo costo (^{Dumschott et al., 2020}). La importancia radica en la capacidad para generar enormes datos y su rápido procesamiento (^{Mehetre et al., 2016}). NGS comparte procesos que son comunes para la detección de virus de plantas, como son la extracción de ácidos nucleicos (ADN/ ARN) de muestras infectadas, la posterior fragmentación del ácido nucleico para la preparación de la biblioteca. Por último, desarrollar varios cebadores sintéticos en el ADN fragmentado; para consecutivamente desarrollar diferentes químicas de secuenciación y plataformas para el análisis de ToBRFV (Luria et al., 20017; ^{Riesenfeld et al., 2004}). La NGS acoplada a MiSeq Illumina conocida como tecnología de segunda generación, permite la detección de ToBRFV en concentraciones bajas en la planta, incluso en infecciones asintomáticas, a través de un análisis metagenómico (Mehetre et al., 2021). La técnica podría utilizarse para el monitoreo masivo de virus emergentes, limitando la diseminación y el impacto en cultivos de importancia económica.

Diseminación del virus

El primer registro del tomato brown rugose fruit virus, fue identificado por primera vez en Israel en 2014, en plantaciones de jitomate bajo malla sombra, según ^{Luria et al. (2017}). A pesar de ello, no fue hasta el 2015 cuando se realizó el primer reporte de su presencia en invernaderos de jitomate en Jordania donde se observaron síntomas atípicos comparados con otros virus; en hojas, mosaicos, ampulaciones y en frutos, manchas amarillas a rugosidades color marrón (^{Salem et al., 2016}). Análisis moleculares confirmaron en plantas de jitomate la presencia de un nuevo tobamovirus al que se identificó como tomato brown rugose fruit virus (Salem et al., 2016; Luria et al., 2017). La aparición y gravedad de los síntomas en frutos afectados por ToBRFV constituyeron un obstáculo significativo para su comercialización, y la ausencia de métodos diagnósticos adecuados junto con planes epidemiológicos retrasaron la implementación de medidas de control cuarentenario (^{Zhang et al., 2023}). Tras su descubrimiento, el virus se diseminó rápidamente a nivel mundial, principalmente a través de semillas contaminadas, ya que Israel y Jordania son destacados exportadores de semillas. Esto marcó el inicio de la expansión global del virus (^{Van de Vossenberg et al., 2020}). Actualmente, ToBRFV está presente en cinco continentes: América, Asia, África, Europa y Oceanía, abarcando 47 países donde se ha reportado en cultivos de Solanum lycopersicum y Capsicum annum (Figura 4). Aunque en Oceanía no se ha confirmado oficialmente su presencia, se ha indicado que semillas provenientes de Australia estaban contaminadas con ToBRFV, sugiriendo su existencia en la región (EPPO, 2023; Zhang et al., 2022).

Con la importación de semillas a México, en 2017 se evidenciaron síntomas de

una enfermedad que se propagaba de forma mecánica en invernaderos de jitomate. En julio de 2018, se registró el primer caso de ToBRFV en Ensenada Baja California. Las muestras analizadas mostraron 100 % de identidad con la región de 1052 pb del gen RdRP de los aislamientos de ToBRFV identificados en Israel y Jordania, según las secuencias depositadas en el GenBank (KX619418 y KT383474.1) (^{Camacho-Beltrán et al., 2019}). En septiembre del 2018 el virus fue también detectado en invernaderos de jitomate y chile en la región de Yurécuaro Michoacán, confirmado mediante RT-PCR con una identidad del 100 % a las cepas de Israel (Cambrón-Crisantos et al., 2019). Así mismo, ^{Ling et al. (2019}) en septiembre del mismo año, reportaron la presencia de ToBRFV en un invernadero con plantas de jitomate provenientes de Baja California. Esto evidencia que el virus se diseminó rápidamente a través de las áreas de producción de jitomate y pimiento en México, encontrándose actualmente en una amplia distribución a lo largo del territorio nacional, según reportes oficiales (Figura 5).

Figura 4 Registros del ToBRFV en regiones productoras del Mundo, indicando su presencia en 47 países distribuidos en los continentes de América, Asia, África, Europa y Oceanía. Los países afectados están marcados con una flecha e iluminados de acuerdo con el primer hospedante encontrado. 

Figura 5 Registros del ToBRFV en la República Mexicana donde se detectó tomato brown rugose fruit virus. Los números 1, 2, 3, etc., representan la secuencia cronológica de las detecciones del virus, comenzando por el primer caso confirmado en México. 

Epidemiología

La dinámica de propagación y evolución de la enfermedad causada por el ToBRFV en cultivos de jitomate se articula a través de distintas fases epidemiológicas, reflejando una complejidad inherente al comportamiento del virus. La enfermedad policíclica ToBRFV tiene una constante producción de inóculo mediada por los procesos de replicación del virus al interior de las células del hospedante (^{Smith y Dambrovsky, 2019}), así como la rápida dispersión y posterior infección de nuevos individuos (Madden et al., 2007). Las etapas de desarrollo epidemiológicas del ToBRFV se pueden describir (Figura 6) durante la infección y el progreso de la enfermedad en plantas de jitomate. Comienza con una fase inicial (Figura 6A), donde la tasa de infección es relativamente baja, lo cual se atribuye a la fase de aclimatación del patógeno a su nuevo entorno y hospedero. La fase inicial suele

Figura 6 Evolución de una epidemia por ToBRFV en cultivo de jitomate (Diseño hipotético). A) inicio de la infección; B) fase de crecimiento o etapa exponencial; C) punto máximo de infección; D) fase de desaceleración o fase estacionaria. 

desencadenarse por la germinación de semillas contaminadas; el hipocótilo activa la replicación del virus, que estaba en estado latente en los cotiledones. (^{Dombrovsky et al., 2017}b). A medida que la enfermedad progresa, se observa una fase de crecimiento exponencial (Figura 6B), durante la cual la velocidad de transmisión y la replicación viral se intensifican drásticamente, en correlación directa con la incidencia observada. Dado a la alta capacidad de transmisión mecánica del ToBRFV y el inicio de las labores culturales en el cultivo, el virus se propaga rápidamente (^{Levitzky et al., 2019}). En este período de tiempo la tasa relativa de la enfermedad aumenta de tal modo que produce un punto máximo de transmisión (Figura 6C), impulsado por infecciones secundarias en el conjunto de plantas evaluadas. Las prácticas de manejo del cultivo, junto a la insuficiencia de medidas de desinfección, propician un escenario donde la incidencia puede alcanzar el 100 % (^{Jeger et al., 2018}; ^{Klein et al., 2023}).

Al culminar esta fase, la epidemia entra a una etapa de desaceleración o fase estacionaria (Figura 6D), señalando el momento en que la enfermedad ha infectado al máximo número posible de individuos dentro de la población de plantas. A diferencia de otros miembros del género tobamovirus, el ToBRFV es capaz de causar infecciones particularmente severas (^{Temple et al., 2023}) las cuales pueden ser fatales para la planta, especialmente bajo la presencia de infecciones mixtas con otros tobamovirus. (^{Vásquez-Gutiérrez et al., 2023}b; Abou et al., 2023). Los síntomas causados por ToBRFV en jitomate son influenciados por factores bióticos y/o abióticos, como precipitaciones, humedad y temperatura los cuales juegan un papel crucial en la incidencia y severidad del virus (Nolasco et al., 2023). ^{González-Concha et al. (2023}) destacan que la sintomatología en plantas de jitomate cultivadas a cielo abierto difiere significativamente de aquellas cultivadas en invernadero, con altas temperaturas exacerbando tanto incidencia como la severidad del virus (^{Salem et al., 2016}). ^{Menzel et al. (2019}) reportaron la aparición de protuberancias de color verde oscuro en foliolos de jitomate baja condiciones de alta temperatura, mientras que ^{Oladokun et al. (2019}) identificaron lesiones necróticas en los pedúnculos de foliolos, y necrosis en tallos. ^{Panno et al. (2019}a) observaron necrosis en el cáliz y peciolos de foliolos de jitomate. Aunque los tobamovirus, generalmente no actúan como parásitos necrotróficos con sus hospedantes, ToBRFV constituye una excepción notable a esta tendencia (^{Caruso et al., 2022}). Bajo condiciones propicias, este virus tiene la capacidad de provocar el colapso de sus hospedantes, demostrando un impacto patogénico distinto y más severo en comparación con otros miembros de su género (Dombrosky y Smith, 2017).

Estrategias de Manejo

Ante la ausencia de métodos específicos para el control y manejo del ToBRFV, se han implementado diversas estrategias culturales que reducen parcialmente la diseminación del virus en el área de trabajo. Entre estas estrategias se incluye el uso de semillas libres del virus, evitar la reutilización de sustratos (García-Estrada et al., 2024), o en su defecto, se recomienda aplicar tratamientos térmicos de inactivación y desinfección para ToBRFV (^{Michael et al., 2022}; Samarah et al., 2021; Ling et al., 2022), remover plantas sintomáticas después del trasplante, mantener

el área de trabajo libre de malezas, que puedan actuar como reservorios del virus, y considerar la rotación de cultivos específicamente con leguminosas. Además, es crucial mantener ubicados en áreas específicas al personal de trabajo (^{Ehlers et al., 2022}b), limpieza correcta de la ropa y zapatos de los trabajadores, junto con la desinfección de herramientas antes y después de la entrada al área de producción Ehlers et al. (2022a). Son algunas estrategias de mitigación que podrían contribuir en un buen manejo del ToBRFV.

Aunque actualmente no existen productos químicos específicamente efectivos contra el ToBRFV en plantas hospedantes, se han investigado productos desinfectantes para reducir su incidencia y severidad en campo (^{Iobbi et al., 2022}; ^{Nourinejhad-Zarghani et al., 2023}; ^{Pablo et al., 2022}). Por ejemplo, se ha reportado el uso de peróxido de Hidrógeno (PH) en hidrogel de alcohol polivinílico (APV)/ polivinilpirrolidona (PVP) para liberación controlada en aplicaciones de campo, la tasa de liberación del PH hidrogel a través del contacto directo e indirecto con el suelo (fase gaseosa) ha demostrado baja fitotoxicidad y una alta eficacia contra ToBRFV en plantas de jitomate y tabaco (^{Eldan et al., 2022}; ^{Liao et al., 2013}).

El uso de inductores de resistencia aplicados directamente al cultivo, para contrarrestar el daño causado por el ToBRFV es aún limitado, debido a la reciente aparición del virus. No obstante, estudios recientes han evaluado (^{Ortiz-Martínez y Ochoa-Martínez, 2023}) el efecto de 14 elicitores y bioestimulantes sobre parámetros agronómicos de morfología, rendimiento y calidad de los frutos en plantas de jitomate infectadas con ToBRFV. Determinaron que Virablock® 3G50, Optifert®, Silicant ® y Haifa ProtekTM mejoraron los parámetros agronómicos evaluados, mientras que Haifa ProtekTM indujo mayor sistema radicular.

ToBRFV es considerado el primer tobamovirus capaz de romper la resistencia a los genes Tm-2, Tm-1 y Tm-22 que confieren resistencia a TMV, ToMV y ToMMV en solanáceas (^{Hak y Spiegelman, 2021}). Por ello, la selección de materiales silvestres para la aplicación de mejoramiento genético con resistencia a ToBRFV, ha brindado resultados favorables en la investigación; como lo indican ^{Kabas et al. (2022}), quienes evaluaron materiales de jitomate que incluyen 10 especies silvestres y 11 híbridos interespecíficos F1 derivados de Solanum habrochaites y S. pennellii, estos se probaron con aislados de ToBRFV mediante el método de prueba biológica. Al final, obtuvieron que S. pimpinellifolium (LA1651), S. penellii (LA0716) y S. chilense (LA4117A, LA2747) podrían ser tolerantes a ToBRFV con un índice de severidad (ISE) menor a 19.6, 28.3, 35.0 y 35.2% respectivamente. Adicionalmente, existen reportes que indican que ToBRFV es capaz de infectar sistémicamente plantas de pimiento que portan genes L1 o L2 resistentes a ToMV (^{Eldan et al., 2022}), aunque en pimiento con genes L2 y L4, ToBRFV produce lesiones locales como resistencia al virus (^{Fidan, 2021}). ^{Pelletier y Moffett (2022}) indicaron que Nicotiana tabacum cultivar BY-2 confirió resistencia a ToBRFV mediante el

reconocimiento del fragmento viral P50 y PC, respectivamente; esto pudo haberse logrado, por la resistencia mediada por los genes N y N’ al no inducir una respuesta de hipersensibilidad (RH) en N. tabacum.

Esto resalta la limitada disponibilidad de materiales genéticos, tanto silvestres y comerciales, que ofrecen resistencia a ToBRFV, un aspecto crucial para mitigar las pérdidas en cultivos de jitomate y pimiento (^{Avni et al., 2021}; ^{García-Estrada et al., 2022}). Es importante mencionar que, aunque existen genotipos en el mercado considerados resistentes, sin embargo, no siempre contrarrestan la infección por el ToBRFV, es decir, los genotipos establecidos a temperaturas normales (20 a 28 °C) pueden tolerar al patógeno, pero a temperaturas extremas de (30 a 48 °C) pueden manifestarse como susceptibles. Por ello, es necesario tomar en cuenta la validación de la resistencia al ToBRFV, antes de su establecimiento en zonas de producción (^{González-Concha et al., 2023}; Nolasco et al., 2023).

Control legal y normatividad

La problemática fitosanitaria de la presencia del ToBRFV, hizo que Estados Unidos en el 2018, a través del Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA), junto con el Departamento de Agricultura (USDA) evaluaran los riesgos que incluiría la presencia del ToBRFV, con ello establecieron restricciones a importaciones de material vegetativo, semilla de jitomate y pimiento, que permitieran la dispersión del inóculo. Pese a estas medidas, se detectó por primera vez ToBRFV en invernaderos de jitomate en el Sur de California, EE. UU (^{Ling et al., 2019}).

En México, tras la detección del virus el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVEF), ejecutó medidas que clasificaron el estatus de la plaga como “Plaga transitoria accionable y en curso de erradicación (PTAyCE)”, dado que no existían reportes por las Normas Internacionales de Medidas Fitosanitarias (NIMF) (FAO, 2023) para impedir su diseminación. Estas acciones incluyeron: diagnóstico, eliminación de plantaciones con presencia del ToBRFV y destrucción de material propagativo contaminado (semillas). Sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, por lo cual, en ese mismo año cambió al estatus “Plaga cuarentenaria, bajo control oficial (PCCO)”. Respecto a la aparición del virus en nuestro país se ha planteado la siguiente hipótesis. El inóculo provino de un bloque de semillas importadas de Jordania a Israel (^{Luria et al., 2017}), lo cual se distribuyó en toda la república mexicana, detectándose por primera vez en Baja California y posteriormente en Michoacán. Desde el 2019 hasta la fecha el virus fue considerado: “Plaga no cuarentenaria reglamentada (PNCR)”, por lo cual se siguieron implementando normativas para semillas y material vegetal con el objetivo de reducir su impacto en la producción mexicana. En 2019 se emitió la primera circular dirigida

a semillas, plántulas y frutos frescos de jitomates y chiles con fines de exportación

y ausencia del ToBRFV (SENASICA, 2023).

Por último, la Unión Europea emitió una notificación de Decisión de Ejecución (U.E.) 2019/1615, donde establecen medidas de emergencia para evitar la introducción y propagación del ToBRFV en la U.E., motivo por el cual, en el 2021, se publicó la circular No. 040, para la exportación de semillas de jitomates y chiles con destino a la U.E. Dichos lineamientos se siguen respetando hoy en día, para la importación y exportación de semillas con destinos a EE. UU., U.E. y México.