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Introducción
El tequila es considerado la bebida alcohólica mexicana por excelencia. En 2022, se utilizaron 2.61 millones de toneladas de “piñas” de agave tequilero (Agave tequilana var. azul), su materia prima imprescindible, alcanzándose un volumen histórico de producción de 651 millones de litros de tequila, de los cuales el 64% fue exportado (CRT, 2023). El cultivo requiere seis años para madurar y en ese lapso es susceptible a la marchitez del agave, enfermedad en la que Fusarium oxysporum provoca una marchitez vascular o Fusarium solani induce una pudrición radicular, letales a la madurez, reducen drásticamente la producción (Aceves, 2003; Avila-Miranda et al., 2010; Ramírez-Ramírez et al., 2017). F. solani es un hongo necrotrófico, que forma monofialides largas con microconidios apicales no catenulados y macroconidios tipo Fusarium. (Leslie y Summerell 2006; Schroers et al., 2016), pero análisis filogenéticos indicaban que integrantes de esta especie, conformaba el complejo de especies Fusarium solani (FSSC), diverso y sin tipificación específica (Coleman et al., 2009; Nalim et al., 2011; O’Donnell, 2000; O’Donnell et al., 2008; Short et al., 2013; Zhang et al., 2006). Por lo que recientemente, para estabilizar la taxonomía y nomenclatura del FSSC, se reconocieron especies filogenéticas que se incluyeron en el género Neocosmopora (Sandoval-Denis et al., 2019, Crous et al. 2021) o en el género Fusarium (Geiser et al. 2021). Sin embargo, la patogenicidad vegetal del FSSC, continua ambigua, ya que si bien, durante más de 50 años, se han descrito once formas especiales (f. spp.) con capacidad patógena específica a un grupo estrecho de especies hospederas denominadas: phaseoli, pisi, cucurbitae, batatas, radicicola, robiniae, mori, piperis, eumartii, xanthoxyli and glycines (Snyder y Hansen, 1941; McClure, 1951; Sakurai y Matuo, 1959; Sakurai y Matuo, 1961; Matuo y Sakurai, 1965; Roy et al., 1989), pero en 2017 se reportaban más de 1,000 relaciones patogénicas de F. solani, con más de 500 especies de plantas hospederas (Farr y Rossman, 2017).
Como estrategia de manejo de la marchitez del agave cuando incrementa a ni-
veles antieconómicos, se realiza rotación de cultivos, siendo el maíz (Zea mays) el principal cultivo alternante, aunque existe reportes de epidemias severas, aun después de años de rotación. Así mismo, se recomienda sembrar frijol (Phaseolus vulgaris) como cultivo entre hileras en los primeros años, para mejorar el manejo
de maleza y anticipar un beneficio económico en el largo ciclo del agave (HerreraPérez, 2017). Considerando la escasa información de F. solani como fitopatógeno del agave tequilero, este estudio tuvo como objetivos: Definir la taxonomía de 24 cepas identificadas morfológicamente como F. solani, obtenidas de plantas de agave tequilero con marchitez y síntomas de pudrición de raíz y corona, secuenciando el fragmento conservado del ADNr ITS1-5.8S-ITS2 y comparando estas secuencias en la base de datos FUSAROID-ID para ubicarlas taxonómicamente considerando su similitud de secuencias con las nuevas especies filogenéticas reportadas a partir de complejo de especies Fusarium solani (FSSC); con estas mismas secuencias, se buscó relacionar 24 cepas de agave, con las11 f. spp. de F. solani, y definir con base a la presencia de intrones en la subunidad 18S del ADNr (SSU), su similitud molecular con la f. sp. phaseoli que es patogénica a frijol. Adicionalmente, se buscó definir la diversidad genética del genoma completo, utilizando huellas génicas de amplificación de fragmentos repetidos Rep-PCR y a partir del análisis de su diversidad, determinar la capacidad patogénica de cepas representativas, sobre plantas de agave, maíz y frijol, para constatar o definir su condición de hospederos.
Materiales y Métodos
Muestreo de plantas de Agave con síntomas
Se muestrearon campos comerciales de nueve municipios de Jalisco, México y un campo cultivado de A. americana con síntomas similares en Comitán, Chiapas, México. Los muestreos estaban encaminados a obtener plantas de agave tequilero con síntomas de marchitez y necrosis rojiza en la base del tallo y corona Figura 1 A y B), con la finalidad de obtener aislamientos de Fusarium solani.
Figura 1 Apariencia de las plantas de las que se obtuvieron los aislados Fusarium solani A) Planta de Agave tequilana var. azul, con síntomas de marchitez del agave. B) Tejido necrótico rojizo típico en la corona y base del tallo.
Se obtuvieron fragmentos de tejido interno sano, contiguo a tejido necrótico de la base del tallo o la corona (Figura 1B). Los fragmentos se desinfectaron en una mezcla cloro, alcohol y agua estéril (1:1:8, v/v/v) por 1.5 min. y se sembraron en placas de Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) incubando a 28 ºC por siete días. Se seleccionaron hongos con conidióforos largos con un solo microconidio en el ápice, preferentemente con macroconidios tipo Fusarium (Figura 2 A y B) (Booth, 1971; Leslie y Summerell, 2006).
Figura 2 Microfotografía de las principales características morfológicas usadas para identificar aislados de Fusarium solani obtenidos de tejido necrótico en corona o base del tallo de plantas de Agave tequilana var. azul. A). Conidioforos largos con solo un microconidio. B) Macroconidios tipo Fusarium.
Para generar micelio, los aislados se sembraron sobre círculos de celofán dulce estéril, colocado sobre PDA, incubando diez días a 27 °C. El micelio se criofracturó en nitrógeno líquido, extrayéndole el ADN utilizando el protocolo de Zymo Research Plant/Seed DNA MiniPrep®, Cat. No. D6020. Su integridad y pureza se corroboró por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% teñido con SYBER® safe Invitrogen DNA gel stain, evidenciada con un transiluminador de luz azul Dark Reader®.
Utilización de marcadores moleculares de ADN
Como marcadores moleculares de ADN se utilizaron: El fragmento ITS1-5.8SITS2, que se obtuvo con los iniciadores ITS1 (5’-TCCTCCGCTTATYGATATGC-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), y la subunidad pequeña del ADNr (SSU) amplificando con los iniciadores NS1 (5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’) e ITS2 (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) (White et al., 1990). La
reacción de PCR se llevó a cabo en un cóctel de 50 µL que contenía: 30 µL de agua
desionizada, 10 µL de buffer de reacción 5X MyFi® (1 mM de dNTPs y 3 mM de MgCl2), 2 µL (1 µL por cada iniciador a 20 µM), 2 µL de MyFi® ADN polymerasa Bioline™ y 6 µL del ADN templado. La amplificación se realizó en un termociclador Gradient Palm (Corbett Life Sciences™) con el programa de amplificación siguiente: Una desnaturalización inicial a 95 ºC por 2 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, anillamiento a 61 ºC durante 2 min y extensión a 72 ºC durante 2 min y una extensión final a 72 ºC por 6 min. Las amplificaciones se evidenciaron en gel de agarosa al 1% teñido con SYBER®safe y foto documentando con una cámara Canon Powershot A620. El tamaño de los amplificados se determinó comparándolos con el marcador de ADN HyperLadder 100bp plus de Bioline®. Los fragmentos amplificados se secuenciaron en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV (Irapuato, Guanajuato, México). Para definir la ubicación taxonómica molecular de las cepas, el fragmento ITS1-
5.8S-ITS2 de cada cepa, se comparó con la colección de nucleótidos (nr/nt) del GenBank, obteniendo reportes de secuencias altamente semejantes con la herramienta Mega BLAST. Adicionalmente, se obtuvieron las secuencias de este mismo fragmento, que fueron agregadas al GenBank por O’Donnell et al. (2008), Lombard et al. (2015), Rupe et al. (2001), Suga et al. (2000b) y Zaccardelli et al. (2008) de las 11 f. spp. de F. solani reportadas a la fecha: batatas, cucurbitae, eumartii, glycines, mori, phaseoli, piperis, pisi, radicicola, robiniae y xanthoxyli. Todas las secuencias mencionadas, se compararon en la base de datos FUSARIOID-ID (https:// www.fusarium.org/page/Pairwise%20ID) para asociarlas a especies filogenéticas definidas a partir del FSSC (Crous et al., 2021). Con el programa Mega 11, se obtuvo un árbol filogenético agrupado por el método UPMGA, definiendo su distancia evolutiva por el método de Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2021). Para analizar el fragmento SN5-SN8 incluido en la secuencia de la SSU de las cepas aisladas de agave, estas se alinearon con el programa Mega 11 (Tamura et al., 2021), alineando con ellas a las secuencias del fragmento SN5-SN8 de tres cepas de la f. sp. phaseoli con los números de acceso en el Gen Bank AF150481, AF150482, AF150483 y de la f. sp. batatas con el número de acceso AF150485 (Suga et al., 2000a). Esta estrategia se realizó con el fin de corroborar en las alineaciones, la presencia de intrones en este fragmento de la SSU en la f. sp. phaseoli, y determinar su ausencia en la f. sp. batatas considerando que este es un rasgo conservado en f. spp. de F. solani, que ayuda a su identificación molecular (Suga et al., 2000a) y de esta forma se podría determinar la presencia de intrones y la longitud del inserto en
pb, en las cepas de F. solani obtenidas de A. tequilana.
Para determinar la diversidad del genoma completo de las cepas, se generaron huellas génicas de fragmentos repetidos con el marcador de ADN Rep-PCR, utilizando los iniciadores 1R (5IIIIC GICGICATCIGGC-3’) y REP 2I(5’ ICGICTTATCIGGCCTAC-3’) (Versalovic et al., 1991) y el protocolo de Rademaker
y de Brujin (1998) para amplificar, con algunas modificaciones. El cóctel de PCR (25 μL) contenía 2.5 µL de buffer10X (500 mM KCl y 100 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 µL de gelatina, 1% de Tritón, 1.5 mg/mL de BSA), 2.5 µL de dNTPs 2 mM,
1.25 µL de MgCl2 1,5 mM, 2 µL de 0.25 µM de cada iniciador, 0.5 µL de 5U de Taq ADN polimerasa Amplificasa® (BioTecMol) y 3 µL del DNA. El programa de amplificación consistió en una desnaturalización a a 95 °C por 6 min, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 6 min, anillamiento a 40 °C durante 1 min, extensión a 65 °C durante 8 min y una extensión final a 65 °C durante 16 min. Las huellas génicas se evidenciaron en geles de agarosa al 2.1%, con electroforesis a 4 °C, 40V y 40 mA durante 20 h. La diversidad determinó en base a matrices estandarizadas de presencia ̶ ausencia de fragmentos amplificados de diferente número de pb, con relación al marcador de peso molecular HyperLadder100bp plus de Bioline®. Se generó un árbol filogenético de coeficiente de disimilaridad del promedio de distancias Manhatan, mediante el método de Neighbor-Joining, utilizando el programa NTSYSpc versión 2.21 (Rohlf, 2009).
Pruebas de patogenicidad
Con el fin de evaluar la patogenicidad de cepas representantes de la diversidad genética de F. solani, en tres bioensayos independientes, plantas de Agave tequilana; Plántulas de maíz de los híbridos Magno (Aspros®), Ocelote y Faisán (Asgrow®) reportadas como resistentes a pudrición radicular por Fusarium y una variedad tradicional de maíz “Morado”; además de plántulas de frijol “Flor de Mayo”, fueron inoculadas con las cepas FsH, FsC1, FsC7 y FsCA. Adicionalmente se desarrollaron plantas de las tres especies que no fueron inoculadas y se evaluaron como control no inoculado (NI). Las confrontaciones se evaluaron mediante un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Las plantas se establecieron en invernadero, en macetas con sustrato de turba y suelo arenoso, esterilizado en horno a 100 °C por 24 h. El inoculo de cada cepa se creció en PDA durante 10 días, pregerminando una suspensión de conidios, agitándola en medio sintético mínimo (Okon et al., 1973) a 150 rpm y 28 °C durante 12 h. Se inoculó el sustrato con 4 x 105 conidios/mL, colocando 1 ml de la suspensión en tres puntos equidistantes de la planta, sin herir raíces. La severidad de pudrición radicular se cuantificó como porcentaje de la longitud necrosada internamente, de diez fragmentos de raíz de 10 cm de longitud por planta. Los tratamientos se evaluaron 90 días después de la inoculación (DDI) en plantas de agave y 42 DDI días en plantas de maíz y frijol. El análisis estadístico se realizó con Proc ANOVA y prueba de medias de Duncan a un nivel de significancia de P≤ 0.05 con el programa SAS versión 9.0 (The SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados y Discusión
Se obtuvieron 24 aislados identificados morfológicamente como F. solani (Cuadro 1). Todos aislados de plantas de agave con marchitez. Las colonias de las cepas FsP1, FsDr y FsCA, tenían un diámetro claramente menor al crecerse en medio PDA después de 5 días (Figura 3 A), en comparación del diámetro alcanzado por el resto de las cepas (Figura 3 B).
Cuadro 1 Denominación de las cepas de F. solani y Xenoacremonium spp. y la ubicación de los campos comerciales de Agave tequilana var azul, de donde se obtuvieron los aislados de Fusarium solani, ordenada por municipio y zona productora en Jalisco, México.
| Cepa de F. solani | Municipio, Estado | Zona productora de agave |
|---|---|---|
| FsF, FsG, FsH, FsP1, FsP2, FsP4 FsP FsC FsQ FsO FsA, FsK FsC7 | Acatic, Jal. Tototlán, Jal. Tepatitlán, Jal. Atotonilco, Jal. Tecolotlán, Jal. Tala, Jal. Comitán, Chis. | Altos Sur Ciénega Altos Sur Ciénaga Sierra de Amula Valles |
| FsDr | San Gabriel, Jal. | Sur |
| FsCR, FsM, FsI | Teuchitlán, Jal. | Valles |
| FsA3, FsCA, FsC1, FsD2, FsM1, FsSub, F3 | Zapotlanejo, Jal. | Centro |
Figura 3 Apariencia de colonias fúngicas después de cinco días de crecimiento en PDA a 28 °C. A) Cepa FsDr molecularmente identificada como Xenoacremonium sp. y B) Cepa FsP de Fusarium solani. C) Microfotografía de micelio y conidióforos de la cepa FsDr con ausencia de macroconidios.
Se secuenció el fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los aislados obtenidos de plantas de Agave tequilana y estas secuencias se integraron a la base datos del GenBank con las claves de acceso: FsCR MK027255; FsP2 MK027256; FsC1 MK027257;
FsM MK027258; FsSub MK027259; FsA3 MK027260; FsD2 MK027261; FsM1 MK027262; FsP4 MK027263; FsF3 MK027264; FsA KU878136; FsC KU878137; FsF KU878138; FsG KU878139; FsH KU878140; FsK KU878141; FsO KU878142;:FsP KU878143; FsQ KU878144; FsC7 KU878145; XP1
MK027287; XCA MK027288; XDr MK027289. Al compararse estas secuencias con la colección de nucleótidos (nr/nt), se ratificó molecularmente la taxonomía de 21 aislados como F. solani e integrantes del FSSC, por coincidir con entre 47 y 242 reportes de secuencias altamente similares. Las cepas FsCA, FsDr y FsP1, con los mismos criterios de búsqueda, no fueron altamente similares con F. solani o el FSSC, en cambio sí lo fueron con el género Xenoacremonium, con 15 reportes y 17 de alta similaridad con Xenoacremonium falcatum y X. recifei, que aunado a las características morfológicas antes descritas y a la descripción de Lombard et al. (2015) se consideró que taxonómicamente no eran F. solani. Cuando el fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los asilados identificados como F. solani, se compararon con la base de datos FUSARIOID-ID, se ubicaron taxonómicamente en el género Neocosmospora de acuerdo con las nuevas especies filogenéticas (Sandoval-Denis et al., 2019; Geiser et al., 2021). Por lo que las 21 cepas de F. solani, se subdividieron en: Neocosmospora falciformis (syn de Fusarium falciforme) FsM1, FsP, FsD2, FsI, FsA3 y FsC1; N. solani (syn de F. solani) FsP4, FsF3; N. martii (syn de F. martii) FsQ, FsP2, FsC7, FsC, FsCr y N. pseudoradicicola (syn de F. pseudoradicicola) FsK, FsH, FsG, FsF, FsA, FsSub, FsO y FsM. Esta subclasificación taxonómica permitió una mayor definición de su diversidad, a diferencia de solo considerarlas como F. solani. El dendograma de distancia evolutiva generado con las secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de las 21 cepas (Figura 4), evidenció una distancia considerable con la mayoría de las f. spp., con excepción de f. sp. eumartii que se ubicó contigua a las cepas de N. martii y la f. sp. radicicola que se ubicó entre las cepas de N. falciformis. Todas las cepas aisladas de plantas de Agave tequilana estuvieron evolutivamente distantes de la f.sp. phaseoli. Según reportan O’Donnell et al. (2000); Suga et al. (2000b) y Zaccardelli et al. (2008), cepas de distintas f. spp. de F. solani tienden a agruparse cercanas, cuando se analizan filogenéticamente sus secuencias de ITSs y se consideran especies biológica y filogenéticamente distintas (Coleman, 2016). Sin embargo, las cepas obtenidas de agave, no se podrían considerar una forma especial, por ser de cuatro especies filogenéticas distintas, sin especificidad patogénica, ya que a su vez todas comparten al agave tequilero como hospedero, comportándose como necrotróficos de amplio rango de hospederos (Mengiste, 2012).
Se obtuvieron las secuencias de la SSU del DNAr de las 21 cepas de F. solani
y se incluyeron en la base de datos del GenBank con los siguientes números de acceso: FsC1 MK027267; FsA MK027268; FsA3 MK027269; FsH MK027270; FsO MK027271; FsG MK027272; FsF MK027273: FsF3 MK027274; FsD2 MK027275;
Figura 4 Árbol filogenético de historia evolutiva construido con el método UPGMA, de cepas identificadas en GenBank como Fusarium solani y clasificadas en la base de datos FUSARIOID-ID como especies filogenéticas de Neocosmospora, analizadas utilizando sus secuencias ITS1-5.8S-ITS2 junto con las de once f. spp. de F. solani.
FsM MK027276; FsM1 MK027277; FsC MK027278; FsC7 MK027279; FsCR MK027280; FsK MK027281; FsQ MK027282; FsP MK027283; FsP2 MK027284; FsP4 MK027285; FsSub MK027286.
Estas secuencias se cortaron de acuerdo con el inicio y final del fragmento NS5-NS8 (Suga et al., 2000a) y al alinear estos fragmentos con las secuencias de la f. spp. phaseoli y batatas, se corroboró que la f. sp. phaseoli en la secuencia AF150481, tiene dos insertos y mide 1,457 pb; la secuencia AF150482 tiene un inserto y una longitud de 1,025 pb y la secuencia AF150483 tiene un inserto y 1048 pb de longitud, mientras la secuencia AF150484 de la f. sp. batatas no tiene insertos y tiene una longitud de 616 pb. Con estas secuencias como referencia se determinó que ninguna de las cepas de Neocosmopora obtenidas de agave, tiene insertos en el fragmento NS5-NS8 y todas tienen una longitud de 616 pb., por
lo que ninguna es similar a la f. sp. phaseoli, lo que respaldaría la sugerencia de intercalar el cultivo de frijol entre las hileras de agave en época de lluvias, o bien hacer rotación con este cultivo, cuando la marchitez del agave haya incrementado su incidencia, reduciendo el riesgo de incrementar el inoculo de Neocosmodpora spp. al haber infectado y colonizado al frijol.
Al analizar las huellas génicas Rep-PCR obtenidas con el genoma completo de las cepas obtenidas de agave, no se aprecia una clara asociación entre sí, de las especies filogenéticas N. falciformis, N. martii, N. solani y N. pseudoradicicola (Figura 5), como la que se apreció con la diversidad mostrada en el dendograma con solo la secuencia ITS1-5.8S-ITS2. Sin embargo, si se consideran cinco grupos a un coeficiente de disimilaridad de 0.30, la mayor parte de las cepas de tres especies filogenéticas se mantienen en un mismo grupo de diversidad genética, pero a su vez, se conformó un grupo de diversidad, conformado con cepas de las cuatro especies filogenéticas, incluidas las cepas de Xenoacremonium. Lo anterior puede explicar que si bien en genes conservados ITSs y Factor de elongación 1α, estas especies filogenéticas son muy similares, su genoma completo tiene un mayor grado de diversidad, pero existe afinidad entre algunas cepas.
Figura 5 Análisis de diversidad de huellas génicas obtenidas con el marcador molecular de ADN Rep-PCR, de cepas de Fusarium solani identificadas como cuatro especies filogenéticas de Neocosmospora y de Xenoacremonium spp. aisladas de plantas de Agave tequilana var azul con marchitez del agave.
Al inocularse cuatro cepas representativas de grupos de diversidad y evaluarse su patogenicidad como severidad de tejido necrótico en raíz, se determinó que las cepas FsH, FsC1 y FsC7 inoculadas en agave, provocaron una severidad del 16.35,
15.10 y 14.65% respectivamente, sin diferencia estadísticas entre ellas. Sin embargo,
las plantas inoculadas con la cepa FsCA, no evidenciaron mayor severidad de necrosis en tejido radicular respecto al control no inoculado (Cuadro 2). De esta forma se corrobora la patogenicidad de las cepas FsH, FsC1 y FsC7 en agave, como previamente reportó Ramírez-Ramírez et al. (2017) con la cepa FsG.
Cuadro 2 Severidad (%) de pudrición radicular in plantas de agave inoculadas con cepas de Neocosmospora pseudoradicicola, N. falciformis, N. martii y Xenoacremonium sp. obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
| >Cepas de F. solani | Severidad (%) | PRMDz |
|---|---|---|
| FsH N. pseudoradicicola | 16.35 | A |
| FsC1 N. falciformis | 15.10 | A |
| FsC7 N. martii | 14.65 | A |
| FsCA Xenoacremonium sp. | 8.45 | B |
| NI | 8.33 | B |
zMedias seguidas por la misma letra no difieren significativamente (prueba de rango múltiple de Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
Al inocular las cepas FsC7, FsC1 y FsH y FsCA, sobre cuatro variedades de maíz, las cepas FsC7 y FsH, indujeron necrosis más severas en plantas de maíz “Morado”, promediando 9.9 y 8.1% respectivamente. En un segundo nivel de significancia la cepa C1 provoco necrosis radicular de un 4.8 y 4.7% en maíz Magno y “Morado” respectivamente. Sin embargo, las cepas FsH, FsC7 y FsC1, cuando se inocularon en los híbridos Ocelote® y Faisán®, que se comercializan como resistentes a pudrición radicular inducida por Fusarium en maíz, no evidenciaron mayor severidad de pudrición de raíz que el control no inoculado (Cuadro 3). Considerando que aun cuando este bioensayo fue breve, en invernadero y solo incluyó cuatro materiales genéticos de maíz, evidencia que, entre los materiales de maíz evaluados, hay diversidad en susceptibilidad a las cepas de Neocosmospora spp. aisladas de A. tequilana. Esto es importante, si se considera que la rotación con cultivos no hospederos, es una de las estrategias más económicas para manejar fitopatógenos radiculares en campo, buscando reducir con el tiempo su nivel de inoculo en suelo. Pero si esta rotación no se realiza adecuadamente, el inoculo del patógeno no se reduce y la enfermedad y pérdidas del cultivo que se quiere proteger se mantienen o incluso se incrementan, como en la rotación maíz - soya realizada como estrategia de manejo de Fusarium virguliforme (F. solani f. sp. glycines), causante de la muerte súbita en soya (SDS), que al efectuarla por varios ciclos, no redujo la severidad de la enfermedad en soya, debido a que los materiales de maíz utilizados, se evaluaron como susceptibles a la infección por F. virguliforme, aunque esta infección no reducía su producción (Xing and Westphal, 2009).
Cuadro 3 Severidad (%) de pudrición radicular en cuatro variedades comerciales y un material criollo de maíz (Zea mays) inoculadas con las cepas FsH (Neocosmospora pseudoradicicola), FsC7 (N. falciformis), FsC1 (N. martii) y FsCA (Xenoacremonium sp.), obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
| Cultivar de maíz | Cepa inoculada | Severidad (%) | PRMDz |
|---|---|---|---|
| Morado | FsC7 | 9.9 | A |
| Morado | FsH | 8.1 | AB |
| Magno | FsC1 | 4.8 | BC |
| Morado | FsC1 | 4.7 | BC |
| Morado | FsCA | 4.2 | CD |
| Magno | FsC7 | 3.3 | CD |
| Magno | FsH | 2.9 | CD |
| Faisán | FsH | 2.8 | CD |
| Faisán | FsCA | 2.8 | CD |
| Ocelote | FsC7 | 2.5 | CD |
| Magno | FsCA | 1.7 | CD |
| Faisán | FsC7 | 1.7 | CD |
| Ocelote | FsC1 | 1.5 | CD |
| Ocelote | FsH | 1.4 | CD |
| Faisán | FsC1 | 1.1 | CD |
| Ocelote | FsCA | 1.0 | CD |
| Ocelote | NI | 0.7 | CD |
| Morado | NI | 0.7 | CD |
| Faisán | NI | 0.5 | D |
| Magno | NI | 0.5 | D |
zMedias seguidas por la misma letra no difieren significativamente prueba de rango múltiple
de Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
En las plantas de frijol “Flor de Mayo”, la inoculación de las cepas FsC1, FsC7 y FsH, no indujeron más necrosis radicular, que la observada en el tratamiento control no inoculado, ni la cuantificada con la inoculación de la cepa FsCa de Xenoacremonium sp de 0.28 y 0.17% de severidad respectivamente (Cuadro 4).
Cuadro 4 Severidad (%) de pudrición radicular en plantas de frijol (Phaseolus vulgare cv. Flor de mayo) inoculadas con cepas de Neocosmospora pseudoradicicola, N. falciformis, N. martii y Xenoacremonium sp., obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
| Cepa inoculada | Severidad (%) | PRMDz |
|---|---|---|
| FsC1 N. falciformis | 0.43 | A |
| NI | 0.28 | AB |
| FsC7 N. martii | 0.21 | AB |
| FsCA Xenoacremonium sp. | 0.17 | AB |
| FsH N. pseudoradicicola | 0.03 | B |
zMedias seguidas por la misma letra no difieren significativamente prueba de rango múltiple de
Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
Conclusiones
De plantas de agave tequilero con síntomas de marchitez y necrosis en la base del tallo y corona, se aislaron principalmente cepas identificadas morfológicamente como F. solani.
Al comparar sus secuencias ITS1-5.8S-ITS2 de cepas obtenidas de Agave tequilana, en la base de datos del GenBank, se identificaron molecularmente como Fusarium solani y se incluían en el complejo de especies F. solani (FSSC).
Al comparar estas mismas secuencias con la base de datos FUSAROID-ID se determinó alta similitud con las de las especies filogenéticas Neocosmospora martii, N. pseudoradicicola, N. solani y N. falciformis, que se reportan como sinónimas de Fusarium martii, F. pseudoradicicola, F. solani y F. falciformis, evidenciando su variabilidad genética.
Secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los aislados obtenidos de Agave tequilana fueron molecularmente diferentes de las f. spp. de F. solani, excepto de las f. spp. eumartii que es muy similar a N. martii y la f. sp. radicicola que es muy similar N. falciformis. Esta información, adicionada a la ausencia de intrones en la secuencia de la fracción 18S (SSU), soporta que entre las cepas obtenidas de A. tequilana ninguna es de la f. sp. phasioli.
Cepas representativas de Neocosmospora aisladas de A. tequilana, fueron fitopatógenas a agave, a maíz morado y a maces sin resistencia a Fusarium. En cambio, maíces resistentes a Fusarium, no fueron susceptibles
En pruebas de patogenicidad, ninguna de las cepas fue patogénica a las plantas
de frijol inoculadas lo que parece confirmar los hallazgos moleculares al respecto.
