Caracterización de fitoquímicos presentes en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens mediante Cromatografía de líquidos de fase inversa (HPLC-MS).

El análisis por cromatografía líquida de alta resolución en fase in- versa se realizó siguiendo la metodología de Ascacio et al. (2016), que consiste en utilizar un sistema de HPLC Varían que incluye un inyector automático (Varian ProStar 410, EE. UU.), una bomba ternaria (Varian ProStar 2310, EE. UU.) y un decantor PDA (Varian ProStar 330, EE. UU.). También se utilizó un espectrómetro de masas con trampa de iones de cromatógrafo de líquidos (Varian 500 - MS IT Mass Spectrometer, EE. UU.) equipado con una fuente de iones por electropul- verización. Se inyectaron muestras (5 μL) en una columna Denali C18 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm, Grace, EE. UU.). La temperatura del horno se mantuvo a 30 °C. Los eluyentes fueron ácido fórmico (0.2 %, V/V; disolvente A) y acetontrilo (disol- vente B). Se aplicó el siguiente gradiente: inicial, 3 % B; 0 - 5 min, 9 % B lineal; 5 - 15 min, 16 % B lineal; 15 - 45 min, 50 % B lineal. Después la columna se lavó y se reacondicionó, el caudal se mantuvo a 0.2 mL/min y la elución se controló a 245, 280, 320 y 550 nm. Se inyectó todo el efluente (0.2 mL/min) en la fuente del espectrómetro de masas, sin dividir. Todos los experimentos de EM se llevaron a cabo en modo negativo [M-H]-1. Se utilizó nitrógeno como gas nebulizador y helio como gas amortiguador. Los parámetros de la fuente de iones fueron: voltaje de pulverización 5.0 kV y voltaje capilar y temperatura fueron 90.0 V y 350 °C, respectivamente. Los datos se recopilaron y procesaron utilizando el Software MS Workstation (V 6.9). Las muestras se analizaron en primer lugar en modo de barrido completo adquiridas en el rango m/z 50 - 2000. 6,951.6

Capacidad antioxidante DPPH en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens.

Se determinó según lo descrito por Brand et al. (1995) con algunas modificaciones, se analizó por espectrofotometría, para ello se pesaron 50 mg de material seco al cual se le agregó 1.0 mL de metanol al 80 %. Posteriormente las muestras se zonificaron durante 20 min y centrifugaron 15 min a 14000 rpm. Una vez obtenido el extracto, se tomó una alícuota de 10 µL la cual fue colocada en microplacas de 96 pocillos y se añadió 290 µL del reactivo DPPH preparado con metanol absoluto al 100 µM. Posteriormente se dejó reaccionar la muestra en la os- curidad durante 30 min. Una vez transcurrido el tiempo la absorbancia fue medida a 515 nm. El porcentaje de inhibición DDPH de los extractos se determinó utilizando como testigo la absorbancia del metanol al 80 %. La CA DPPH se determinó me- diante la siguiente fórmula: Inhibición de DPPH (%) = Absorbancia del blanco /Absorbancia del extracto × 100

Capacidad de Polifenoles Totales en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens. La CPT se determinó utilizando el método de Folin-Ciocalteu descrito por Singleton y Rossi (1965) con algunas modificaciones. En el análisis se tomó una alícuota de 10 µL del extracto de metanol al 80 %, posteriormente se agregó 790 µL de agua destilada, 50 µL de Folin y 150 µL de carbonato de sodio al 20 %. Posteriormente la muestra se dejó reposar 1 h en obscuridad, una vez trascurrido el tiempo la absorbancia fue medida en un lector de microplaca a 765 nm. El CPT se determinó usando una curva estándar con ácido gálico, y se expresó como GAE mg/g (miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo).

Aislamiento e identificación de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

Se colectaron raíces y tallos de plantas de chile serrano (Capsicum annuum) Var. Platino en etapa de floración, con síntomas de marchitez, en el municipio de Escui- napa, Sinaloa, México, mediante un muestreo aleatorizado tomando 6 plantas por muestra, y se sembraron 5 muestras de tejido por caja Petri, realizando seis repeti- ciones. Las muestras se desinfectaron siguiendo la metodología de ^{Booth (1977}) se lavaron, seccionaron y sumergieron en cloro al 3 % durante 3 min, posteriormente se enjuagaron y secaron. Se sembraron en medio PDA y se incubaron a 28 °C por siete días. La purificación de los hongos se llevó a cabo mediante la técnica de punta de hifa, un método que permite obtener hongos axénicos o libres de contami- nantes. Posteriormente se realizó la identificación morfológica usando claves taxo- nómicas de Díaz et al. (2011) para la caracterización de P. aphanidermatum, y de ^{Watanabe y Matsuda (1966}) para R. solani. La identificación molecular la realizó el Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LANBA- MA) del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT). Utilizando los primers ITS1 e ITS4, los cuales amplifican la región ITS entre los genes de la subunidad ribosomal 18S y la subunidad ribosomal 28S, lo que permite una identificación específica de las especies fúngicas.

Actividad antifúngica de extractos de Agave striata y Fouquieria splendens so- bre el crecimiento micelial de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

La actividad antifúngica se determinó por el método de medio envenenado pro- puesto por Jasso et al. (2011); Se utilizaron los extractos de A. striata y F. splen- dens a concentraciones de 3.9 a 2000 mg L^-1, además se utilizó un control negativo el cual consistió solo de medio de cultivo PDA sin extracto, se utilizaron cuatro repeticiones por concentración. Se colocaron discos de 0.4 mm de diámetro con micelio activo de P. aphanidermatum y R. solani de siete días de crecimiento en el medio envenenado; y se incubaron a 28 ± 2 °C. La evaluación se realizó midiendo el crecimiento radial de los hongos diariamente, y concluyó, cuando el control ne- tativo cubrió la placa Petri por completo, repitiéndose el experimento dos veces. El porcentaje de inhibición se determinó mediante la siguiente fórmula:

Porcentaje de Inhibición= (DC-DT/DC) *100.

Donde DC es el diámetro del tratamiento control, y DT es el diámetro de las dife- rentes concentraciones.

Efecto de extractos de Agave striata y Fouquieria splendens sobre estructuras y morfología de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

Se utilizó la metodología de ^{Khaledi et al. (2015}) con modificaciones para evaluar los cambios morfológicos inducidos por los extractos en oogonios de P. aphaniderma- tum e hifas de R. solani, usando los resultados de la concentración inhibitoria al 50% (CI₅₀) de A. striata y F. splendens. Para obtener oogonios de P. aphanidermatum, se empleó el medio envenenado con las concentraciones de 199.17 y 61.22 mg L^-1 con los extractos de A. striata y F. splendens, respectivamente, en medio de cultivo Agar V8 (20 g de agar, 3 g de CaCO3, 160 mL de jugo de verduras V8 Campbell’s y 840 mL de agua destilada), en tanto que para el crecimiento del micelio de R. solani se utilizó el medio de cultivo PDA en medio envenenado con los extractos a concentraciones de 211.18 y 92.59 mg L^-1, en los dos experimentos se utilizó un control negativo sin extracto. Tras siete días de cultivo, se evaluaron los cambios morfológicos bajo microscopio óptico con el objetivo 40X y 100X, ambos experi- mentos se llevaron a cabo utilizando 6 repeticiones y se realizaron por duplicado.

Análisis estadístico. Se realizó un análisis Probit de los ensayos in vitro para de- terminar la CI₅₀ de cada tratamiento utilizando el programa estadístico Statistical AnalysisSys, V9.0., con los resultados obtenidos se realizó análisis de varianza con las concentraciones inhibitorias; y se realizaron pruebas de Tukey (p<0.05).

Caracterización de fitoquímicos presentes en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens mediante cromatografía de líquidos de fase inversa (HPLC-MS).

Los fitoquímicos identificados en los extractos de A. striata y F. splendens se pueden observar en el Cuadro 1. En el caso de A. striata se observó la presencia de dos elegitaninos (pedunculagina y terflavina B), un ácido hidroxi- cinámico (ácido cafeico), un metoxiflavonol (brasidina), un flavonol (quercetina), una flavonona (pinocepmbrina), y un terpeno fenólico (rosmadial). En A. striata se han reportado diversos compuestos bioactivos, incluyendo flavonoles (derivados de quercetina) (Almaraz et al., 2013), saponinas triterpenoides y esteroidales, así como alcaloides, carbohidratos, flavonoides (flavononas y chalconas), saponinas (triterpenoides y esteroidales), taninos (fenoles), quinonas (antraquinonas y benzo- quinonas) y cumarinas (Ramírez et al., 2023). En el caso de F. splendens se detectó la presencia de dos flavonoles (kaempferol y quercetina), dos flavones (roifolina y leutina), dos metoxiflavonoles (patuletina y dimetilquercetina), una flavanona (eriodictiol), un ácido hidroxicinámico (ácido cafeico), un dihidroflavonol (dihi- droquercetina), y otro polifenol (Phlorin). En este sentido Nevárez-Prado et al., 2021, mencionan que los fitoquímicos más característicos del género Fouquieria corresponden a flavonoides (leucocianidina, kaempferol y quercetina), los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico, y elágico, así como cumarina y escopoletina. Por otra parte, Rodríguez (2010), encontró en F. splendens presencia de grupos carbonilo, oxidrilos fenólicos, esteroles y metilesteroles, cumarinas, saponinas, sesquiterpen- lactonas y flavonoides. En los tallos y hojas se han encontrado flavonoides como el kaempferol, ermanina y cetina, además flavonas apigenina, acacetina, luteolina y crisoeriol. Entre estos, apigenina y ermanina, rutina y quercetina-3-O-glucósido fueron los principales compuestos fenólicos en las hojas (^{Wollenweber, 1994}; ^{Monreal-García et al., 2019}), también se han descubierto triterpenos, triterpenoi- des, saponinas esteroideas y compuestos iridoides (^{Takhtajan, 2009}), y en las flores los fitoesteroles y alcanos de cadena larga y corta; y en el tallo compuestos como el Dammaran-triterpeno, el fouquierol y el isofouquierol, así como el dammarendiol en las raíces (^{Hegnauer, 1989}; ^{Waterman 1985}). Por otro lado, se han aislado el pyxinol y el ocotillol, este último es una saponina triterpenoide el cual presenta actividades antimicrobianas (^{Bi et al., 2017}). López et al. (2022) identificaron los principales fenoles en hojas de F. splendens como ácido gálico, ácido elágico y kaempferol-3-β-glucósido. Además, Ramírez et al. (2023) informaron que el extracto metanólico de tallos de F. splendens contiene alcaloides, carbohidratos, flavonoides (flavononas, flavonas, flavonoles y chalconas), azúcares reductores, saponinas (triterpenoides), taninos (derivados de ácido gálico, derivados de catecol y fenoles), y quinonas (antraquinonas y benzoquinonas). Las plantas dentro de su metabolismo producen compuestos con propiedades antimicrobianas, los cuales pueden controlar enfermedades causadas por microorganismos fitopatógenos. La extracción de estos compuestos y su análisis permiten su aplicación frente a diver- sos fitopatógenos, lo que ofrece una alternativa para el manejo de enfermedades en la agricultura (^{Hernández-Lauzardo et al., 2007}). En este sentido, Ramírez et al. (2023) observaron que extractos de A. striata y F. splendens tuvieron actividad antimicrobiana contra Clavibacter michiganensis in vitro y bajo condiciones de invernadero. Siendo, el extracto de F. splendens el más efectivo al reducir la in- cidencia y severidad de la enfermedad. Los extractos de A. striata y F. splendens han mostrado actividad antifúngica en más estudio (Sánchez et al., 2005; ^{Wang et al., 2010}), sin embargo, no se ha investigado específicamente su efecto antifúngico sobre R. solani y P. aphanidermatum.

Capacidad antioxidante DPPH en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens.

Los resultados mostraron que el extracto de F. splendens mostró una actividad antioxidante significativamente mayor en comparación con el extracto de A. striata (Cuadro 2). La inhibición del radical DPPH se expresó en porcentaje (%), siendo del 68.7 para F. splendens y del 55.9 para A. striata. En este sentido, ^{Garza et al. (2012}) determinaron que el extracto metanólico de F. splendens tenía una con- centración efectiva media (CE₅₀ considerada como la concentración de la muestra requerida para atrapar el 50 % de radicales DPPH libres) de 130.2 μg. López et al. (2022) determinaron la actividad antioxidante de F. splendens con resultados de DPPH (2430.1 µmol TE/g), Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox (TEAC) de 60.4 µmol TE/g, Capacidad de Absorción de Radicales Oxigenados (ORAC) de 4948.4 µmol TE/g y Poder de Reducción Férrica (FRAP) de 7803 µmol Fe(II)/g) (p < 0.0001). En Agave ya hay investigaciones en la determinación de la capacidad antioxidante. En una investigación realizada por Ahumada et al. (2013) obtuvieron resultados que mostraron variaciones significativas en la actividad antioxidante en- tre diferentes especies de Agave. En Agave rzedowskiana presentó la mayor activi- dad antioxidante con 27.4 μM TE/g p.s., seguido de Agave ornithobroma con 19.9 μM TE/g p.s.

Capacidad de Polifenoles Totales en extractos de Agave striata y Fouquieria splendens.

Los resultados mostraron que el extracto de F. splendens exhibió po- lifenoles totales significativamente mayor en comparación con el extracto de A. striata. La CPT se expresó en valores de CFT (GAE mg/g), siendo 112.2 para F. splendens y 61.2 para A. striata (Cuadro 2). López et al. (2022) analizaron los compuestos fenólicos del extracto metanólico de hojas de F. splendens utilizando el método de Folin Ciocalteu y tras fraccionar, observaron que la fracción de ace- tato de etilo contenía la mayor cantidad de compuestos fenólicos, con 479.9 mg GAE/g (p < 0,0001). En otro estudio, Ahumada et al. (2013) encontraron variacio- nes significativas en contenido total de fenoles entre diferentes especies de Agave. A. ornithobroma tuvo el valor más alto con 12.37 mg GAE/g p.s., mientras que Aagave angustifolia mostró el valor más bajo con 2.06 mg GAE/g p.s., indicando una variabilidad considerable en los compuestos antioxidantes y fenólicos entre las especies estudiadas.

Aislamiento e identificación de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

De las muestras de chile serrano variedad Platino con síntomas de marchitez, se ais- laron e identificaron R. solani y P. aphanidermatum. En R. solani se observaron hi- fas marrones pálido de 5-8 µm de ancho, ramificadas en ángulo de 90 °C (^{Watanabe y Matsuda, 1966}), en tanto que para P. aphanidermatum se observó micelio ceno- cítico, esporangios y oogonios (Días et al., 2011), lo que corresponde a las especies R. solani y P. aphanidermatum respectivamente. En relación a la identificación molecular, las secuencias proporcionadas por el LANBAMA del IPICYT de cada especie, fueron comparadas en el BLAST del National Center for Biotechnology Information. En el caso de R. solani, su secuencia obtuvo un 100 % de cobertura y 100 % de similitud al compararse con el número de acceso JX535004.1. Por su parte, la secuencia de P. aphanidermatum obtuvo 100 % de cobertura y 100 % de similitud al compararse con el número de acceso EU245039.1. Finalmente, ambas secuencias fueron depositadas en el GenBank obteniendo los números de acceso PQ571162 para R. solani, y PQ571194 para P. aphanidermatum.

Actividad antifúngica de extractos de Agave striata y Fouquieria splendens sobre el crecimiento micelial de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

Los resultados de los extractos vegetales sobre el crecimiento micelial de

P. aphanidermatum mostraron un efecto altamente significativo. F. splendens fue el más efectivo con una inhibición del 100 % desde 250 mg L^-1, mientras que A. striata alcanzó el 100 % de inhibición a 1000 mg L^-1 (Figura 1). Los valores de CI fueron de 61.2 mg L^-1 para Fouquieria splendens y 199.2 mg L^-1 para Agave striata, mostrando significancia estadística (Cuadro 3). Un estudio realizado por Milagrosa et al. (2007) informaron que la vinaza de vino a concentraciones del 5 % inhibió al100 % a P. aphanidermathum. En tanto, los resultados obtenidos de los extractos vegetales sobre el crecimiento micelial de R. solani mostraron inhibición en el de- sarrollo micelial del patógeno. Por su parte F. splendens mostró una inhibición del 100 % desde 500 mg L^-1, mientras que A. striata alcanzó el 100 % de inhibición desde 1000 mg L^-1 (Figura 2). Las CI50 más baja fue de 92.6 mg L^-1 para F. splen- dens y 211.2 mg L^-1 para A. striata, observándose diferencia estadística (Cuadro 3). En una investigación realizada por Rodríguez et al. (2020) reportaron inhibiciones del crecimiento micelial (ICM, %) de R. solani del 100 y 50 % utilizando extractos de Larrea tridentata y Rosmarinus oficinalis, respectivamente. El ácido cafeico, presente en los extractos de A. striata y F. splendens, ha mos- trado capacidad antifúngica (^{Freires et al., 2016}), como se ha observado en estudios previos. Un ejemplo de esto es el estudio realizado por ^{Romero et al. (2009}) inves- tigaron el efecto de compuestos fenólicos como el ácido cafeico, rutina y querceti- na en el crecimiento de Aspergillus carbonarius y la producción de ocratoxina A.

Figura 1.  Inhibiciónde Pythium aphanidermatum por extractos metanólicos de Agave striata y Fouquieria splendens por el método de medio envenenado.  

Figura 2 Inhibición de Rhizoctonia solani por extractos vegetales Agave striata y Fouquieria splendens por el método de medio envenenado. 

Observaron que todos los compuestos fenólicos, a una concentración de 250 mg L^-1, tuvieron un impacto significativo en la tasa de crecimiento de A. carbonarius. Además, ^{Bisogno et al. (2007}) reportaron que la concentración mínima inhibidora (CIM) del ácido cafeico para Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Aspergillus terreus fue superior a 250 mg L^-1. Por otro lado, la quercetina presente en ambos extractos (A. striata y F. splendens) ha mostrado actividad antifúngica contra cinco especies de hongos: Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Macro- phomina phaseolina y Penicillium citrii (^{Kanwal et al., 2010}). El flavonoide pino- cembrina encontrado en A. striata tiene un papel antiinflamatorio, antimicrobiano y antioxidante (^{Rasul et al., 2013}), ha mostrado efecto inhibitorio contra Candida albicans (^{Hernández-Tasco et al. ,2018}; ^{Tundis et al., 2018}). El elagitanino ter- flavina B, presente en A. striata, ha demostrado un efecto inhibitorio contra C. albicans (Salih et al., 2022). Además, se descubrió que el tanino pedunculagina, un fitoquímico presente en A. striata, exhibió efecto inhibitorio contra A. flavus en extractos de Punica granatum. (Mostafa et al., 2011). ^{Ilk et al. (2017}) desarrollaron nanopartículas de lecitina/quitosano cargadas con kaempferol en el cual observaron la actividad de inhibición contra Fusarium oxysporum. Sin embargo, kaempferol puro también demostró ser eficaz contra C. albicans (^{Yordanov et al., 2008}). Los flavonoides eriodictiol, dihidroquercetina y luteolina, presentes en F. splendens, han demostrado actividad antifúngica contra Fusarium graminearum y Septoria zeicola en el extracto de Ficus sarmentosa var. henryi tras un proceso de fracciona- miento (^{Wang et al., 2010}).

Efecto de extractos de Agave striata y Fouquieria splendens sobre estructuras y morfología de Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani.

Ambos extractos mostraron actividad contra los oogonios de P. aphanidermatum, provocando lisis a dosis altas de 2000 a 500 mgL^-1, y malformación y deformación de hifas a con- centraciones de 199.2 y 61.2 mg L^-1 con los extractos de A. striata y F. splendens (Figura 3). ^{Lópeza et al. (2022}) probaron que lipopéptidos de Bacillus amyleloque- faciens inhibieron completamente la germinación de zoosporas de Phytophthora capsici, causando enquistamiento, malformaciones en el tubo germinal y degrada- ción celular. El uso de extractos vegetales alteró la morfología de las hifas de R. solani, que aparecían distorsionadas y fragmentadas con concentraciones de 211.2 mg L^-1 con el extracto de A. striata y de 92.6 mg L^-1 con el extracto de F. splendens (Figura 4), similar a lo descrito por ^{Khaledi et al. (2015}) con aceites esenciales de Mentha piperita, Bunium persicum y Thymus vulgaris.

Los resultados pueden atribuirse a la presencia de compuestos antifúngicos en los extractos de A. striata y F. splendens. Por ejemplo, la quercetina presente en ambos extractos es un flavonoide, que ha demostrado reducir el contenido de er- gosterol, un esterol crucial para la fluidez y estabilidad de las membranas celula- res, en Trichophyton rubrum (^{Bitencourt et al., 2013}), así también ha mostrado inhibición de la enzima CYP51, que está involucrada en la síntesis de esteroides en hongos (^{Khanzada et al., 2021}). El flavonoide pinocembrina encontrado en A. striata ha mostrado diferentes mecanismos de acción, entre los que se encuentran; la interferencia en la homeostasis energética, aumentos en la permeabilidad de la membrana celular, disminuciones en el contenido de los constituyentes intracelu- lares (proteínas solubles, azúcares reductores y lípidos totales), además, se indujo una marcada disminución en los contenidos de quitina y glucanasa de los micelios de Penicillium italicum (^{Peng et al., 2012}; ^{Chen et al., 2020}). Por otro lado, el flavonoide kaempferol encontrado en F. splendens ha sido sugerido en estudios por causar daños en las hifas y probablemente esté asociado con la alteración de la pared celular, lo que provoca fugas celulares y pérdida de integridad celular (^{Ilk et al., 2017}), también ha mostrado actividades antifúngicas sinérgicas de la histo- na desacetilasa (^{Rajasekharan et al., 2014}), así también inhibición de las enzimas CYP51 y NDK la cual es una enzima implicada en la fosforilación de nucleósidos y nucleótidos (Khanzada et al., 2021).

Figura 3 Efecto de extractos vegetales sobre oogonios de Pythium aphanidermatum a 100X. A, B y C) Fouquieria splendens, D, E y F) Agave striata, y G) Control negativo.