Introducción

La jamaica (Hibiscus sabdariffa), es considerada una especie de importancia económica (^{Chew et al., 2024}) y medicinal (^{Takada et al., 2024}). A nivel internacional, México ocupa el séptimo lugar como productor con el 5.14%. Guerrero ocupa el primer lugar como productor de jamaica en el país. Los municipios de Ayutla de los Libres y Tecoanapa son los principales productores, seguidos de Acapulco de Juárez y San Luis Acatlán (SIAP-SADER, 2022); sin embargo, el precio de venta es bajo, debido a la calidad e inocuidad desde la precosecha, por problemas ocasionados principalmente por hongos fitopatógenos (^{Aparicio et al., 2016}; ^{Dios-López et al., 2011}).

Entre las enfermedades más importantes que afectan la jamaica en Guerrero se encuentran el manchado de cáliz inducido por Corynespora cassiicola (OrtegaAcosta et al., 2015a), Phytophthora parasitica (^{Hernández-Morales y RomeroCova, 1990}), Lasiodiplodia pseudotheobromae, Fusarium incarnatum-equiseti (^{Aparicio et al., 2016}) y otros hongos fitopatógenos asociados a dicha sintomatología como F. oxysporum, F. solani y F. incarnatum (^{Ortega-Acosta et al., 2015}b). Trabajos realizados recientemente indican que la enfermedad del manchado de la jamaica, es la principal limitante para la producción de cálices, ya que se presenta en incidencias del 100 % en Ayutla y Tecoanapa (Ortega-Acosta et al., 2020).

Estudios realizados en muestras de cálices reportan que por 1,470 kg de jamaica recolectadas en Guerrero, el 40.8 % eran de calidad comercial con presencia de manchas y tizones en las puntas (equivalente a 588 g de la unidad) con cálices en malas condiciones de inocuidad. Los hongos fitopatógenos asociados a la jamaica en almacén fueron Fusarium y Corynespora (^{Ruiz-Ramírez et al., 2015}).

México posee una amplia diversidad de especies arbóreas de coníferas y latifoliadas de clima templado (^{Quiroz y Magaña 2015}), con potencial en el uso de extractos orgánicos con efecto antifúngico, para combatir los hongos fitopatógenos, capaz de reducir enfermedades, con efectos favorables en la calidad de los cálices; entre ellos el “piñón” y “linaloe”, Jatropha curcas y Bursera linanoe respectivamente, se consideran una nueva alternativa orgánica para disminuir el uso de fungicidas de origen químico (^{Del Puerto et al., 2014}). El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto inhibitorio de resinas de J. curcas, B. linanoe, la mezcla de ambas y Tiabendazol contra C. cassiicola, F. oxysporum y F. solani en condiciones in vitro mediante las técnicas de Kirby Bauer y por pozo en agar.

Las muestras de resina de J. curcas se recolectaron en fresco y la resina de lináloe (B. linanoe) se obtuvo de la colección del Instituto Nacional de Investigación Forestal Agrícola y Pecuaria (INIFAP), campo experimental de Zacatepec, Morelos. Ambas muestras de resina se obtuvieron del fruto, las cuales se depositaron en frascos estériles con tapa de rosca para su transporte en refrigeración a 20 °C de temperatura.

Las cepas de C. cassiicola con acceso en GenBank (MF000865) causante del manchado de la jamaica, F. oxysporum (KM519188) y F. solani (KM519190) asociada al síntoma de “pata prieta”, son provenientes del cultivo de jamaica del estado de Guerrero, fueron proporcionadas por el laboratorio de Sanidad e Inocuidad del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo.

Para determinar el efecto in vitro de las resinas sobre los hongos, las cepas se sembraron en cajas Petri en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) a temperatura ambiente (25 ± 2 °C). A los 7 días, se cubrió con 10 mL de solución salina estéril al 0.85 %, se agitó durante 3 minutos y se frotó en la superficie de la colonia de manera firme y suave con un asa bacteriológica. La suspensión obtenida de cada una de las cepas se vacío directamente en tubos de ensayo estéril en reposo por 2030 min. La turbidez de la suspensión de esporas fue medida por espectrofotometría, 70 75 % transmitancia a 530 nm de acuerdo a la técnica de ^{Cermeño y Torres (1998}).

Para la técnica de pozo en agar se siguió la técnica propuesta por MorenoLimón et al. (2011). Para la técnica de Kirby Bauer se siguió la metodología de ^{Gallardo-Vásquez et al. (2019}) utilizando cajas Petri con medio de cultivo PDA, se sembraron por separado 10, 20 y 30 μL de la suspensión de esporas de cada uno de los hongos, a una concentración de 1x10¹ con cuatro repeticiones.

Las cajas Petri se incubaron a 25 ± 2 °C por 7 días. Posteriormente se calculó el diámetro de crecimiento radial. El porcentaje de inhibición de crecimiento fue calculado tomando en cuenta que la inhibición es el inverso del crecimiento (^{Tequida-Meneses et al., 2002}). El efecto inhibitorio de las resinas fue determinado positivo con la aparición de un halo de inhibición de crecimiento alrededor de las perforaciones, el cual fue medido con un Vernier marca Fumetax^® de 150 x 0,02 mm cada 24 h por 7 días.

Se determinó la dosis mínima inhibitoria (DMI), la cual es definida como la menor concentración de resinas que no mostró crecimiento en los tubos de ensaye. Se utilizó medio de cultivo PDA, donde se sembraron 8 tubos con 1 mL de PDA con 10 μL de suspensión de esporas, a una concentración de 1x10¹ ajustada a 530 nm, 70 75 % de transmitancia (^{Cermeño y Torres 1998}).

Análisis estadístico. Se calcularon las medias muestrales de los factores estudiados y se agregó su desviación estándar entre paréntesis. También se hicieron gráficas de cajas para conocer su distribución. El experimento correspondió a un diseño factorial completo al azar de efectos fijos. Se estudiaron cuatro factores: técnica (Ti) con dos niveles: disco en agar o Kirby Bauer y pozo en agar, resinas (Rj) con cuatro niveles: B. linanoe, J. curcas, mezcla de ambas y Tiabendazol, volúmen (Vk) con tres niveles: 10, 20 y 30 µL y Hongos (Hl) con tres especies: C. cassiicola, F. oxysporum y F. solani, y la variable respuesta fue el diámetro del halo de inhibición. El modelo estadístico utilizado fue:

Yijklt = μ + Ti + Rj + Vk + Hl + (TR)ij + (TV)ik + (TH)il + (RV)jk + (RV)jl + (RH)kl+ (TRV)ijk + (TRH)ijl + (RVH)ikl + (RVH)jkl + (TRVH)ijkl + εijklt

ε ~ IIDN(0, σ ²); i = 1, 2; j = 1, 2, 3; k = 1, 2, 3; l = 1,2, 3, 4; t = 1, 2, 3.

Los datos se analizaron con el paquete estadístico R (R Core Team, 2020). En el análisis de varianza se usó el nivel de significancia de α = 0.05. Bajo la versión no paramétrica de rangos alineados para determinar si los efectos principales y las interacciones (^{Kay et al., 2021}). Para comparar los 72 tratamientos se usó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.

Se realizó una modificación en la concentración mínima inhibitoria (CMI) ya que, al manejar muestras crudas y naturales sin proceso con equipo de laboratorio, no se conoce la concentración que presentan, solo se trabajó con diferentes dosis (Cuadro 1). La resina de B. linanoe mostró una DMI mejor en comparación con el resto de las muestras (Cuadro 1).

Los 20 tratamientos muestran una predominación de la técnica de pozo en Agar pues aparece en 12 tratamientos; la resina B. linanoe se encuentra entre los mejores 20 tratamientos, ya que aparece en nueve tratamientos, la mezcla de resinas en cinco tratamientos y el tiabendazol en seis tratamientos; los volúmenes 10 y 20 µL aparecen en ocho y siete tratamientos respectivamente y los hongos C. cassiicola y F. oxysporum aparecen en 12 y ocho tratamientos respectivamente. La combinación Pozo en Agar y B. linanoe apareció en seis de los 20 tratamientos.

En el extremo opuesto, el grupo con menores medias del diámetro del halo de inhibición contiene a los cinco tratamientos que tuvieron un mínimo del diámetro del halo de inhibición de 13 mm (DJcV30Fo, DTV10Fs, DTV30Fs, PTV10Fs y PTV30Fs) y otros 14 tratamientos (DJcV10Cc, DTV20Fo, DJcV30Cc, DTV30Fo, PTV30Fo, DJcV20Cc, DJcV20Fs, PJcV20Fo, DJcV30Fs, PJcV30Fo, DTV20Fs, PTV20Fs, DJcV10Fs, DJcV20Fo) que hacen un total de 19 tratamientos. En estos tratamientos predominó la técnica de Disco en Agar ya que aparece en 13 tratamientos; la resina J. curcas aparece en 10 tratamientos y el tiabendazol en nueve tratamientos; los volúmenes 30, 20 y 10 µL aparecen en ocho, siete y cuatro tratamientos y los microoganismos F. solani, F. oxysporum y C. cassiicola aparecen en nueve, siete y tres tratamientos respectivamente (Cuadro 2).

Se encontró que todos los factores fueron significativos, incluyendo los efectos principales de la técnica, las resinas, el volumen y los hongos en el diámetro del halo de inhibición, así como las interacciones dobles, triples y cuádruples. La resina de B. linanoe, mostró la mayor inhibición y, por lo tanto, el mayor efecto antifúngico contra C. cassiicola y F. oxysporum, dicho efecto antifúngico puede estar asociada con una variedad de metabolitos secundarios presentes en la planta, como saponinas, fenoles, flavonoides y compuestos monoterpénicos como el acetato de linalool (^{Becerra y Noge, 2010}; ^{Cruz et al., 2016}). La respuesta antifúngica que se obtuvo de B. linanoe, va de acuerdo con ^{Arellano-Hernández (2018}) quien en estudios recientes observó que presenta propiedades bacteriostáticas y biofúngicas de sus resinas obtenidas de diferentes partes del árbol. Esto concuerda con ^{Seepe et al. (2020}) quienes mencionan que los extractos de plantas han demostrado una alta actividad antifúngica contra diferentes patógenos como el género Fusarium. Los metabolitos de las resinas como acetato de linalilo, cariofileno, undeceno reportado en lináloe (Cruz et al., 2016).

En el caso de la resina de J. curcas no se obtuvieron resultados alentadores mostrando que con la técnica de pozo agar se obtuvo un halo de inhibición en el hongo C. cassicola de 12.0 a 13.5 mm. A pesar de que ^{Córdova-Albores et al. (2016}) mencionan que el efecto del aceite de Jatropha curcas ha sido estudiado extensamente, encontrándose que tiene la capacidad de alterar parcialmente la morfología del micelio y conidios de F. oxysporum, provocando daños morfológicos y celulares, incluyendo una intensa vacuolización. Estos efectos se atribuyen a la gran cantidad de metabolitos con actividad antifúngica presentes en diversas partes de la planta (^{Saetae y Suntornsuk, 2010}). ^{Rahu et al. (2021}) mencionan también que es fundamental que los ensayos determinen el efecto fungicida de los extractos o compuestos, ya que J. curcas es una planta con mucho potencial como agente antibacteriano.

Por otra parte, la mezcla de ambas resinas (B. linanoe + J. curcas) para potenciar el efecto antifúngico fue menor a lo esperado, mostrando halos de inhibición de 16.1 a 18.7 mm, superiores a los de la resina de J. curcas, que presentó halos de inhibición de 7 a 13.1 mm, pero inferiores a los de B. linanoe, con halos de inhibición de 30 mm. Estas son medias marginales que no consideran el efecto de los otros tres factores estudiados. Por lo tanto, no se considera una buena opción mezclar ambas resinas. La mejor concentración mínima inhibitoria fue para B. linanoe (4 µL mL⁻¹), seguida de la mezcla (12 µL mL⁻¹) y, por último, J. curcas (140 µL mL⁻¹) (Cuadro 1).

El testigo comercial tiabendazol presentó control en seis de los tratamientos mostrando un halo de inhibición de 30 mm con la técnica de pozo en agar de los hongos C. cassiicola y F. oxysporum. Esto concuerda con ^{Medina-Osti et al. (2022}) quienes mencionan que tiabendazol ha demostrado su acción antifúngica derivado de su efecto directo sobre la mitosis, lo que impide el desarrollo del micelio; por lo que es eficaz en la disminución del crecimiento del micelio en especies de Fusarium. Sin embargo, el uso del tiabendazol, uno de los fungicidas más efectivos contra una amplia variedad de patógenos, ya no es un tratamiento efectivo, aunque algunos agricultores todavía hacen uso de éste para controlar algunas enfermedades causadas por patógenos (^{Seepe et al., 2021}).

En cuanto a cada especie de hongo, los mayores halos de inhibición, con 30 mm, se presentan en C. cassiicola, siendo uno de los más susceptibles y de menor resistencia, ya que mostró halos superiores en todos los volúmenes empleados. En cuanto a F. oxysporum también mostró susceptibilidad con un halo de inhibición de 30 mm, presentando halos superiores en los volúmenes de hongo de 10 y 20 µL. Esto sugiere que el uso de estas resinas odrían ser una alternativa viable contra la enfermedad del manchado de hojas y cálices de la jamaica. Estos hallazgos coinciden con los de ^{Moreno-Limón et al. (2011}), quienes evaluaron diferentes suspensiones de esporas de los géneros Aspergillus y Penicillium observando una alta variabilidad en su análisis. Sin embargo, los informes sobre C. cassiicola en jamaica son escasos en el estado de Guerrero (^{Ortega-Acosta et al., 2015}a). Por lo tanto, es importante continuar investigando para comprender los mecanismos de acción específicos de la resina de Bursera linanoe.

No se observaron diferencias significativas en la evaluación de los volúmenes de hongos utilizados, ya que los mayores diámetros en los halos de inhibición se presentaron consistentemente en volúmenes de 10, 20 y 30 µL. La resina de B. linanoe, obtenida del fruto del árbol, se considera una alternativa prometedora y eficiente como biofungicida en el control de C. cassiicola, F. oxysporum y F. solani, según resultados obtenidos in vitro. Por lo tanto, invertir en el desarrollo de productos a base de plantas medicinales para el control de enfermedades de los cultivos causadas por patógenos, es un sector en crecimiento que debe ser considerado y desarrollado (^{Seepe et al., 2021}).

Reducir el uso de fungicidas sintéticos convencionales mediante la incorporación de productos naturales efectivos es un paso crucial hacia una producción agrícola sostenible. No obstante, es fundamental comprender el mecanismo de acción de estas resinas y evaluar su efectividad en condiciones de campo.

Se obtuvo que todos los términos fueron significativos, los efectos principales de técnica, resinas, volumen de hongos y especies de hongos en el diámetro del halo de inhibición, pero también las interacciones dobles, triples y cuádruples.

Los resultados de la presente investigación in vitro permiten observar que la resina de B. linanoe mostró mayor inhibición para C. cassiicola y F. oxysporum, en las dos técnicas (técnica de pozo en agar y disco en agar o técnica Kirby Bauer), esto la convierte en el tipo de resina con mayor potencial biocontrolador.