Introduccion

Distintos agentes fitopatógenos han sido asociados a la gomosis de los cítricos. Se ha reportado principalmente a especies del género Phytophthora (^{Bright et al., 2004}; ^{Brentu y Vicent, 2015}; Graham y Feichtenberger, 2015). Sin embargo, los miembros de la familia Botryosphaeriaceae han mostrado relevancia debido a su capacidad de adaptación para enfermar a otros cultivos cercanos a las parcelas de hospedantes nativos originales (Mondragon-Flores et al., 2021).

La gomosis se encuentra distribuida en todas las zonas citrícolas del mundo. Ha causado pérdidas en Italia (^{Aloi et al., 2021}), Argelia (Linaldeddu et al., 2015; ^{Berraf-Tebbal et al., 2020}), Irán (^{Abdollahzadeh et al., 2010}) y Estados Unidos (^{Adesemoye et al., 2014}), y en México se encuentra distribuida en las zonas pro- ductoras de cítricos dulces y en limones Mexicano y Persa de los estados de: Co- lima (Rocha-Peña et al., 2003), Morelos (Valle-de la Paz et al., 2019a), Puebla, Veracruz (^{Bautista-Cruz et al., 2019}), Nuevo León y Tamaulipas (Polanco et al., 2019) con importantes daños que fluctúan del 2 al 14 % de incidencia (Medina- Urrutia et al., 2002).

Los síntomas en tallos y ramas se observan en lesiones necrosadas y la aparición de un exudado gomoso, posteriormente marchitez, amarillamiento de hojas, defo- liación y finalmente muerte parcial o completa del árbol (^{Bautista-Cruz et al., 2019}; ^{Berraf-Tebbal et al., 2020}; ^{Aloi et al., 2021}). El patógeno sobrevive en el rastrojo de plantas enfermas, y se disemina por medio de las herramientas de poda; pero también mediante lluvia, riego, viento e insectos (Moreira-Morillo et al., 2021). La enfermedad prevalece en mayor medida a temperaturas entre los 26 a 32 ^oC y alta humedad relativa (80 %) (Úrbez-Torres et al., 2010; Picos-Muñoz et al., 2015).

El control de la gomosis se ha eficientado con el uso de fungicidas químicos preventivos como Carbendazim (Da Silva Pereira et al., 2011; Valle-de la Paz et al., 2019b), Tiabendazol (Da Silva Pereira et al., 2011; ^{Camacho-Tapia et al., 2021}), Benomilo y compuestos a base de cobre (^{Everett y Timudo-Torrevilla, 2007}; Sáenz et al., 2019; Valle-de la Paz et al., 2019). También se han usado microorganis- mos antagonistas como Trichoderma spp. y Bacillus subtilis (^{Bhuvaneswari y Rao, 2001}; Rusin et al., 2021). Sin embargo, la aplicación de fungicidas químicos se debe revisar según el patógeno de estudio, así como evitar la generación de resis- tencia. Procurar alternativas biológicas para el control es importante para la con- servación de la biodiversidad. Este estudio se ha desarrollado con los objetivos de identificar los patógenos asociados a la gomosis en huertas de cítricos de Plan Chac, Sacalum, Yucatán; y evaluar alternativas de control químico y biológico que ofrezcan alternativas al manejo de la enfermedad.

Materiales y métodos

Material vegetal y aislamiento de hongos. Se usaron muestras del tejido vegetal (corteza) y de suelo provenientes de un huerto semicomercial con árboles de na- ranjo (Citrus sinensis), limón (C. latifolia) y toronjo (C. paradisi) con síntomas de exudado y necrosis. El huerto se encuentra ubicado en la localidad de Plan Chac, Sacalum, Yucatán. Las muestras fueron extraídas en julio y octubre de 2023. Para los aislamientos del tejido se cortaron fragmentos (5 mm²) que se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 % por un minuto y se lavaron tres veces con agua destilada estéril (^{Bautista-Cruz et al., 2019}). Los tejidos se dejaron secar en papel absorbente estéril y después se sembraron en cajas con medio PDA natural (200 g papa, 20 g agar-agar, 15 g de dextrosa en 1000 mL de agua) y se incubaron a 24 °C por 24 h. Las muestras de suelo fueron tomadas alrededor del tronco de árboles con sín- tomas y a una profundidad de 30 cm. Para el aislamiento de los hongos del suelo, la técnica consistió en diluciones seriadas; así en el primer tubo se añadió 1 g de suelo en 9 mL de agua destilada estéril, posteriormente se transfirió 1 mL de esa solución (suelo-agua) a una serie de tubos con las mismas características (^{Aziz y Zainol, 2018}). Se hicieron tres diluciones de cada muestra (10^-1 hasta 10^-3). Se transfirieron 20 µL de la solución final en cajas con medio PDA natural que se incubaron a 24 °C durante 24 h y se observaron al microscopio para detectar crecimiento fúngico.

Purificación de aislados e identificación.

La purificación de los aislados se obtuvo mediante punta de hifa y se sembraron en medio PDA (BD BIOXON^®, Cuautitlán Izcalli, México) y se mantuvieron durante un periodo de 7 a 14 días a 24 °C en in- cubadora (BINDER, Modelo BD53-UL, Tuttlingen, Alemania). La caracterización morfológica de los aislamientos purificados se llevó acabo con los siguientes me- dios de cultivo: PDA con antibióticos (39 g, 200 mg de estreptomicina y 1000 mL de agua,) y Agar Hoja de Clavel (CLA) (20 g agar, 1000 mL de agua, cinco fragmentos de hojas de clavel por cada caja). En el medio PDA, se determinó la pigmentación y la tasa de crecimiento de las colonias. Para estudiar la morfología del género Fu- sarium se usó medio CLA y cámaras húmedas (caja Petri, papel húmedo y trozos de aluminio) que se evaluaron a los cinco días para la medición de fiálides. Adicio- nalmente, se midieron macro y microconidios y clamidosporas; para Pestalotia se midieron conidios; y para Lasiodiplodia se midieron conidios maduros y picnidios. Después del periodo de incubación se hicieron preparaciones semipermanentes de glicerina al 50 % de cada aislado y se examinaron con un microscopio óptico (Leica DM500, Heerbrugg, Alemania) con cámara digital instalada, con un objetivo de 40x y las imágenes se procesaron a través del Software LAS EZ (versión 3.4; Leica Microsystems, Alemania).

Prueba de patogenicidad.

Con base en la mayor incidencia encontrada en los aislados, se inocularon con L. pseudotheobromae cuatro plantas de C. sinensis in- jertada en naranja agria C. aurantium. Se desinfectó la superficie del tejido sano de la planta con alcohol al 70 %, y se practicó una herida en donde se colocó un disco de crecimiento activo de L. pseudotheobomae en PDA (5 mm) de cinco días de edad (^{Bautista-Cruz et al., 2019}; ^{Berraf-Tebbal et al., 2020}). Se sellaron las heridas con algodón húmedo y papel tipo Parafilm (Bemis, EEUU). Las plantas testigo recibieron un disco PDA estéril. Las plantas fueron evaluadas en condiciones de microtúnel durante 21 días, con temperatura media de 24 °C (máx. 47 °C, mín. 11 °C) y humedad relativa de 97 % (máx. 100 %, mín. 85 %). Una vez cul- minado el periodo, se observó la presencia de signos y síntomas pertenecientes a la gomosis. Se utilizaron las hojas y tallos con lesiones, y se reaislaron los hongos en medio PDA. Cuando se desarrolló la colonia, se llevó a cabo la caracterización morfológica y cultural, para confirmar la presencia de estructuras que coincidan con el aislado original.

Evaluación in vitro de fungicidas químicos y antagonistas.

La técnica consistió en la siembra de los aislados en medio PDA con fungicida a diversas concentra- ciones (^{Dhingra y Sinclair, 1995}). Se extrajo un disco de inóculo de 5 mm de la periferia de la colonia pura del hongo en cuestión. Se evaluaron cuatro fungici- das químicos (Benomilo, Mancozeb, Carbendazim, Tiabendazol) y un producto biológico a base de B. subtilis cepa QST 713. Para los tres aislados, se usaron 7 concentraciones con tres repeticiones, incluido el testigo (Cuadro 1). Las concen- traciones se calcularon según el volumen de medio PDA e ingrediente activo. Se incubaron a una temperatura de 24 °C. Se obtuvieron los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial (PICM) y la concentración efectiva (CE). Una vez que el crecimiento micelial del testigo ocupó el área total de la caja de Petri, se calculó el porcentaje de crecimiento de cada uno de los tratamientos con la fórmula de Arce- Araya et al., (2019): % crecimiento del hongo= [(Diámetro del hongo en PDA

sin fungicida-Diámetro del hongo en PDA con fungicida) / (Diámetro del hongo en PDA sin fungicida) * 100]. La CE que inhibe el 50 % del crecimiento micelial (CE₅₀) se calculó mediante el Software GraphPad Prism (versión 8.0.1; GraphPad, San Diego, CA).

Prueba dual in vitro de Trichoderma .

Para evaluar la capacidad antagónica de Trichoderma, se utilizó la técnica de cultivo dual descrita por Morton y Stroube (1955). Se realizó la prueba con los agentes fitopatógenos obtenidos, y dos agentes antagonistas: Trichoderma harzianum y T. viride que pertenecen a la colección del INIFAP. La prueba consistió en colocar un disco de micelio de cada hongo (5 mm) en un extremo de la caja Petri y en el otro extremo se colocó un disco del agente antagonista (5 mm), a una separación de 2 cm. Para cada tratamiento se incluye- ron tres repeticiones y un testigo. Se mantuvieron a una temperatura de 24 °C. Al culminar el periodo se calculó el % de inhibición radial (PICR) con la fórmula de Osorio et al. (2016): PICR= [(Diámetro del hongo sin Trichoderma-Diámetro del hongo con Trichoderma) / (Diámetro del hongo sin Trichoderma) * 100].

Análisis estadístico.

El diseño experimental utilizado fue completamente al azar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Los resultados se analizaron con el software estadístico SAS (versión 9.0; SAS Institute, Cary, N.C.).

Resultados y discusión

Caracterización morfológica de hongos asociados a la gomosis. De las muestras vegetales, se obtuvieron colonias que corresponden a un solo hongo, con las siguientes características: un crecimiento circular de color blanco y de borde filamentoso con textura esponjada que se tornó a color verde militar y finalmente a negro (Figura 1a). Se presentaron picnidios de 133 µm de ancho x 212.69 µm de largo con

Figura 1 Anverso y reverso de aislamientos en medio de cultivo PDA de hongos asociados a la go- mosis de los cítricos. A) Colonia de Lasiodiplodia pseudotheobromae de seis días de edad, obtenida de tejido de la corteza. B) Colonia de Fusarium solani de seis días de edad. C) Colonia de Pestalotia spp. de seis días de edad, ambos obtenidos del suelo. 

conidios que medían (17.75-) 25.30 (-34.97) µm de largo x (11.37-) 13.30 (-18.08) µm de ancho, de forma subovoide a elipsoide, con ápice y base truncada (Figura 2). Los conidios son inicialmente hialinos y aseptados, y posteriormente septados de color café con estriado longitudinal. Además, se presentaron otras estructuras como células conidiógenas y paráfisis. Estas características corresponden a las descritas por Phillips et al. (2013) y Liang et al. (2020) para L. pseudotheobromae.

Figura 2 Morfología microscópica de cuerpos fructíferos de Lasiodiplodia pseudotheobromae. A, B y C) Conidiomas picnidiales globosos, D) conidios maduros septados con estriados longi- tudinales, E) células conidiógenas y paráfisis y F) conidios aseptados inmaduros. 

De las muestras de suelo, se obtuvieron colonias con crecimiento circular de color crema con borde filamentoso y de textura plana que se tornó a una tonali- dad café claro (Figura 1b). Los macroconidios triseptados ligeramente curvos de (28.99-) 35.02 (-42.76) µm de largo por (4.18-) 5.18 (-6.99) µm de ancho. Los microconidios con uno o sin septo de (6.86-) 10.02 (-14.08) µm de largo por (5.24-) 3.75 (-2.41) µm de ancho. Las fiálides largas y cilíndricas de 97.30 µm, y clamidosporas de doble pared, terminales o intercalares de 8.69 µm de diámetro (Figura 3). La anterior descripción coincide con F. solani (Leslie y Summerell,

Figura 3 Morfología microscópica de Fusarium solani asociado a la gomosis de los cítricos. A) Fiáli- des y conidios agrupados en cabezuelas, B) Macroconidios maduros septados, C) Microco- nidios maduros. 

2006). Adicionalmente, se obtuvo una tercera colonia de color blanco con forma- ción de anillos circulares, de textura algodonosa y bordes filamentosos (Figura 1c). Presencia de acérvulos de 506 µm y conidios curvos de (13.19-) 21.61 (-28.07) µm de largo por (5.93-) 8.01 (-9.97) µm de ancho, con cinco células de extremos hia- linos (terminal y apical). El extremo terminal presentó tres apéndices que medían 4.96-30.3 µm, 5.33-31.06 µm y 5.28-29.81 µm. Por otro lado, el extremo apical de un solo apéndice corto de 2.86-7.83 µm de largo. Está descripción coincide con el género Pestalotia, sin que se pueda diferenciar una especie de acuerdo con Guba (1961) y ^{Barnett y Hunter (1998}).

Prueba de patogenicidad de aislamientos.

A los 21 días se observaron lesiones necrosadas con exudados ámbar en tallos, así como presencia de picnidios en tallos y hojas (Figura 4). Similar a lo obtenido por ^{Bautista-Cruz et al. (2019}) y Berraf- Tebbal et al. (2020). Se confirmó que el agente causal de la enfermedad de la gomo- sis corresponde a L. pseudotheobromae, a través de los postulados de Koch.

Efectividad de fungicidas.

Los resultados obtenidos permitieron identificar al fungicida con mayor efectividad para disminuir el crecimiento micelial de F. sola- ni, Pestalotia spp. y L. pseudotheobromae. Para F. solani, el análisis de varianza mostró diferencias significativas entre Carbendazim, Tiabendazol y Serenade (P ≤ 0.05). El Tiabendazol fue el fungicida químico más efectivo debido a que a dosis mínimas logró inhibir a F. solani (Cuadro 2, Figura 5). Los benzimidazoles como el

Figura 4 Síntomas y signos ocasionados por Lasiodiplodia pseudotheobromae en cítricos, A) necrosamiento de tallos, B) presencia de picnidios en tallos, y C) producción de exudado o goma. 

Carbendazim y Tiabendazol han sido efectivos para controlar al género Fusarium (^{Agrios, 2005}). Zárate-Ramos et al. (2022) determinaron que el Tiabendazol fue efectivo con CE50 de 14.50 mg L^-1 contra F. incarnatum, mientras que Medina-Osti et al. (2022) reportaron que Tiabendazol fue efectivo a una CE50 de 7.2 mg L^-1 contra F. sacchari. También, el producto biológico Serenade fue efectivo (Cuadro 2, Figura 5). Se ha reportado que las bacterias del género Bacillus producen com- ponentes antimicrobianos contra Fusarium (Mardanova et al., 2017). En el caso de F. solani, para inhibir más del 50 % del hongo, fue necesario una concentración

Figura 5 Efecto in vitro de fungicidas contra hongos asociados a la gomosis de los cítricos en cinco días. Crecimeinto de Fusarium solani: A) Medio con Tiabendazol al 0.5 mg L^-1. B) Medio con Carbendazim al 0.8 mg L^-1. C) Medio con Benomil al 50 mg L^-1. D) Testigo. Crecimiento de Lasiodiplodia pseudotheobromae: E) Medio con Tiaben- dazol al 0.01 mg L^-1. F) Medio con Benomil al 0.1 mg L^-1. G) Medio con Mancozeb al 50 mg L^-1. H) Testigo. Crecimiento de Pestalotia spp.: I) Medio con Tiabendazol al 0.01 mg L^-1. J) Medio con Benomil al 1 mg L^-1. K) Medio con Mancozeb al 100 mg L^-1. L) Testigo. 

de 0.0497 mg L^-1 (Cuadro 2). Carbendazim mostró ser eficiente para inhibir su cre- cimiento micelial (Cuadro 2, Figura 5). En general, el Carbendazim ha mostrado buenos resultados contra F. oxysporum en tomate (Jahanshir y Dzhalilov, 2010) y contra F. solani en chile (Madhavi y Bhattiprolu, 2011). González-Oviedo et al. (2022) reportaron que cepas de F. oxysporum, provenientes de vainilla, fueron sen- sibles a Benomilo y Carbendazim. Sin embargo, el Benomilo fue menos efectivo, dado que el mayor porcentaje de inhibición se presentó a concentraciones elevadas (Cuadro 2, Figura 5). La aplicación de Benomilo al suelo restringió la colonización de F. oxysporum en melón (Maraite y Meyer, 1971). Se ha demostrado que el Be- nomilo reduce el índice de germinación de las conidias de Fusarium (^{Decallonne y Meyer, 1972}). Romero-Velázquez et al. (2015) determinaron que se presentó una CE50 del 0.01 mg L^-1 por B. subtilis contra Fusarium en chayote. Por otro lado, Zarate-Ramos et al. (2022) indicaron que B. subtilis fue eficiente con CE₅₀ 0.00014 mg L^-1, e inhibió completamente a Fusarium a 0.01, 0.05 y 1 mg L^-1,

Por otra parte, el análisis de varianza (P ≤ 0.05) para Pestalotia spp. mostró que existen diferencias significativas entre Benomilo y Mancozeb. El Tiabenda- zol mostró ser el más efectivo en todas las concentraciones evaluadas (Cuadro 3). Hernández-Ceja et al. (2021), reportaron que Tiabendazol a partir de 5 mg mL^-1 logró inhibir el 100 % de hongos asociados a la muerte regresiva del arándano: Pestalotiopsis clavispora, Colletotrichum gloeosporioides y L. pseudotheobromae. Con Serenade se obtuvo un valor óptimo de CE 0.04870 mg L^-1. Monroy y Liza- razo (2010), no encontraron propiedades antagonistas contra Pestalotia spp., con la siembra del hongo con bacterias Pseudomonas fluorescens y B. subtilis a una concentración 10⁶ UFC/mL⁸ en PDA. El Mancozeb fue el menos efectivo (Cuadro 3). La inhibición del 100 % del hongo se logró con la aplicación de la dosis más alta evaluada. En fresa, ^{Ara et al. (2017}) y Rajnish & Gauta, (2022), lograron inhibir a Pestalotia spp. completamente a concentraciones de 250, 500 y 1000 mg L^-1. Por otro lado, el Carbendazim y Mancozeb fueron los que controlaron a P. anacardii en mango (Patil et al., 2019).

En L. pseudotheobromae el análisis de varianza indica que no hubo diferencias significativas sobre la CE₅₀ entre Benomilo, Serenade y Tiabendazol, sin embargo, si difieren estadísticamente con Mancozeb (P ≤ 0.05). El Tiabendazol fue efecti- vo, ya que mostro un valor de CE₅₀ menor (Cuadro 4, Figura 5) y presentó mayor inhibición a partir de 0.01 mg×L^-1 (98.55 %). Los benzimidazólicos han sido efec- tivos contra L. theobromae. En 120 aislados de L. theobromae se determinó que

91.6 % fueron sensibles a benzimidazólicos con CE50 de 0.36 al 1.27 µg mL^-1 para Tiabendazol (^{Da Silva et al., 2012}). En condiciones de campo, ^{Camacho-Tapia et al. (2021}) demostraron que la aplicación de Tiabendazol, permitió un buen control de la gomosis en limón. El control con Benomilo se logró a concentraciones bajas

( Cuadro 4, Figura 5), la inhibición de Lasiodiplodia se logró la aplicación de 0.1 mg L^-1 (86.58 %) y se inhibió completamente a 10 mg×L^-1 (99.56 %). Similar a lo obtenido por Da Silva Pereira et al. (2021), donde la CE₅₀ de Benomilo para L. the- obromae fue de 0.002 a 1.75 µg mL^-1. También, algunas especies de Botryosphae- riaceae fueron controlados con Benomilo (CE a 0.36 a 0.55 µg mL^-1) (^{Bester et al., 2007}). La aplicación de Benomilo y compuestos a base de oxicloruro de cobre contra L. theobromae es efectiva en distintas fases fenológicas del cultivo (Sáenz et al., 2019). El Serenade fue menos efectivo, con valor de CE a 0.0528 mg L^-1. El Mancozeb logró controlar a L. pseudotheobromae a altas concentraciones de 50, 100, 500 mg L^-1, en comparación con los fungicidas evaluados. Esto último lo confirman ^{Dianda et al. (2020)} y Sultana y Ghaffar (2010), dado que se inhibió completamente a Lasiodiplodia a 100 y 500 mg L^-1. El Mancozeb en conjunto con Carbendazim ha permitido un control más amplio (Jadeja y Bhatt, 2010; Valle- de la Paz et al., 2019b). Por otro lado, Sultana y Ghaffar (2010), obtuvieron buenos resultados con la aplicación de B. subtilis en el control de pre y post-emergencia en el control de L. theobromae.

Efecto de Trichoderma.

Tanto T. harzianum como T. viride inhibieron el desarrollo de los hongos asociados a la gomosis de los cítricos; sin embargo, de acuerdo con el ANVA, T. harzianum causó la mayor inhibición. Se ha reportado su efectividad como agente de control biológico contra hongos, nematodos e insectos (Ferreira y Musumeci, 2021). En F. solani, el ANVA indica que T. harzianum (61.08 %) mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (22.17 %) (P ≤ 0.05) (Cuadro 5, Figura 6). También, ^{Fernández y Suárez (2009)} reportaron que la apli- cación de T. harzianum inhibió más del 50 % de Fusarium en maracuyá. En beren- jenas, Ganesh y Dwivedi (2019) reportaron que se inhibió alrededor del 20 % de

Fusarium con T. viride. Madhavi y Bhattiprolu (2011) indican que la integración de distintos tratamientos como el baño de las plántulas con Carbendazim, la adición de vermicompost, el empapado con fungicida y la aplicación de T. viride es eficaz para el control de la enfermedad del marchitamiento por Fusarium en chile. Para Pestalotia, el análisis de varianza (P ≤ 0.05) indica que T. harzianum (62.93 %) mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (53.78 %) (Cuadro 5, Figura 6). En mango, se logró inhibir al hongo con la aplicación de Trichoderma (72.88 %) (^{Bhuvaneswari y Rao, 2001}). En el caso de Lasiodiplodia, el ANVA (P < 0.05) indica que T. harzianum (35.64 %) no mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (25.45 %) (Cuadro 5, Figura 6). ^{Boat et al. (2022}), determinaron que T. harzianum redujo el 64.1 % de L. theobromae. Mientras que Bhuvaneswari y Rao (2001) reportaron que el 62.41 % del crecimiento micelial del hongo fue reducido. Asimismo, Da Silva et al. (2022) demostraron que Tricho- derma redujo el crecimiento de F. solani (34 %) y L. theobromae (89 %) asociado a Nopalea cochinillifera. En Morelos, se encontró que L. citricola fue sensible a todas las dosis evaluadas de T. harzianum (0.55, 0.39 y 0.19 g/100 mL) (Valle-de la Paz, 2019a).

Figura 6 Efecto de Trichoderma spp. en el desarrollo de hongos asociados a la gomosis de los cítricos. A) Fusarium solani vs T. harzianum. B) F. solani vs T. viride. C) Pestalotia spp vs T. harzianum. D) Pestalotia vs T. viride. E) Lasiodiplodia pseudotheobromae vs T. harzianum. F) L. pseudotheobromae vs T. viride. 

Conclusiones

La identificación morfológica y las pruebas de patogenicidad mostraron que la enfermedad de la gomosis en cítricos provenientes de la localidad de Plan Chac en Sacalum, Yucatán es causada por L. pseudotheobromae. Además, se identifi- caron otros hongos fitopatógenos: Pestalotia spp. y F. solani. El tratamiento con Tiabendazol, B. subtilis cepa QST 713 y T. harzianum controlan eficientemente F. solani, L. pseudotheobromae y Pestalotia spp. El manejo de la gomosis en cítricos se puede realizar en combinación con el uso de agentes biológicos, disminuyendo así el uso del control químico y evitando una probable resistencia con su uso a largo plazo.