Introducción

Sclerotium rolfsii causante de la pudrición de la raíz y tallo, es un patógeno polífago reportado en zonas tropicales y subtropicales (^{Gholami et al., 2019}). Sclerotinia sclerotiorum es un patógeno de amplia distribución, no específico (OrdóñezValencia et al., 2018). Colletotrichum gloeosporioides es causante de la antracnosis en hojas, flores, frutos y brotes de cítricos (^{Guarnaccia et al., 2017}). Los tres fitopatógenos se asocian con pérdidas significativas en cultivos de importancia económica, cuyo control se basa en el uso de tratamientos químicos. El uso de extractos vegetales con actividad antimicrobiana es de interés como parte de las estrategias sustentables para el manejo de enfermedades en cultivos agrícolas (^{Verdugo-Contreras et al., 2022}). Extractos metanólicos, etanólicos y acuosos de Datura discolor se han evaluado in vitro contra Aspergillus flavus, A. niger, Penicillium chrysogenum, P. expansum, Fusarium moniliforme, F. poae (Tequida-Meneses et al., 2002) y C. gloeosporioides (Verdugo-Contreras et al., 2022). Los métodos tradicionales para la extracción de compuestos fitoquímicos se basan principalmente en el uso de disolventes orgánicos y tratamientos térmicos, en los que el material vegetal es expuesto a altas temperaturas por tiempos prolongados, lo que puede provocar la pérdida y degradación de compuestos termolábiles con actividad biológica (^{Zhang et al., 2018}). Las estrategias para la extracción acuosa de compuestos vegetales por medio de la tecnología no-térmica de Procesamiento a Altas Presiones (HPP; por su abreviatura en inglés High Pressure Processing) han ganado la atención, en la industria farmacéutica y alimentaria por tener un alto impacto en la modificación de la estructura celular y en la recuperación de compuestos bioactivos, que se asocia con la destrucción de las paredes celulares y otras barreras estructurales (^{Le-Tan et al., 2022}). Pero no se han realizado evaluaciones del efecto de extractos vegetales obtenidos por HPP contra fitopatógenos. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto in vitro de extractos acuosos de Datura discolor obtenidos por HPP contra Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum y Colletotrichum gloeosporioides, agentes causales de la pudrición suave, el moho blanco y la antracnosis, respectivamente.

Obtención de los extractos.

En el experimento se usaron raíces, semillas y hojas de D. discolor, con identidad confirmada molecularmente por ^{Verdugo-Contreras et al. (2022}). El material vegetal se desinfestó con una solución de hipoclorito de sodio 1% v/v, se enjuagó tres veces con agua destilada y se secó a 60 °C durante 19 horas para su posterior pulverización. Los extractos se prepararon de cada parte anatómica, la mezcla del material vegetal se preparó a una proporción 1:10 p/v en agua destilada, se vertió en frascos de polietileno tereftalato (PET) con tapa de polietileno de alta densidad (HDPE) de doble sello y se expusieron a tratamiento de alta presión a temperatura ambiente. Se consideraron dos tratamientos continuos de alta presión, uno a 600 MPa manteniendo la presión durante 3 min y otro a 600 MPa con presión mantenida durante 6 min. Para el procesamiento de alta presión se empleó el equipo Hiperbaric 55 con canastilla para 55 litros (14.5 gal) de 200 mm (7.9 in) de diámetro, con un intensificador integrado y 62 KW de potencia. Posteriormente, las muestras sometidas a HPP se centrifugaron durante 10 min a 4000 rpm y se recuperó el sobrenadante. Los extractos fueron almacenados a 4 °C hasta su uso.

Evaluación antifúngica in vitro .

El efecto en fresco de los extractos acuosos de hojas de D. discolor se evaluó un día posterior al procesamiento contra Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum y Colletotrichum gloeosporioides, los cuales previamente fueron identificados molecularmente y se comprobó su patogenicidad (^{Martínez-Álvarez et al., 2021}; Martínez-Ereva, 2022; ^{Pérez-Mora et al., 2021}). Los experimentos se realizaron en cajas Petri con PDA (Bioxon, Cuautitlán Izcalli, Estado de México, México); los extractos se agregaron al medio de cultivo en el que se ajustaron a las concentraciones de 2, 4 y 6%; v/v. En el centro se colocó un disco de PDA de 5 mm con micelio del hongo con 5 días de crecimiento; se incluyó un tratamiento adicional consistente en el fungicida a 1 ppm (tebuconazol para S. rolfsii y S. sclerotiorum y carbendazim para C. gloeosporioides), como testigo se utilizaron placas de Petri con PDA que contenían únicamente al hongo. Las placas se incubaron a 25 °C, se registró el crecimiento diario de cada uno de los hongos, hasta que el crecimiento del micelio alcanzó el borde de la caja. El porcentaje de inhibición (PI%) se calculó como PI % = (C-T/C) x 100 donde C es el radio del hongo en la placa de control y T es el radio del hongo en presencia del extracto o el fungicida (^{Paneerselvam et al., 2012}). Los experimentos se condujeron en un arreglo completamente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento, los experimentos se realizaron dos veces. Se evaluó la vida de anaquel del extracto con la concentración más eficaz observada en las pruebas in vitro (extracto de hoja al 6%). El extracto se conservó a 4 °C, y las evaluaciones de efectividad biológica se realizaron a los seis meses después de su obtención. Estos experimentos se realizaron de la misma manera que en el ensayo in vitro descrito anteriormente.

Análisis estadístico.

Los datos se sometieron a pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk y se recurrió a las pruebas no paramétricas Kruskal-Wallis y Mann-Whitney con un valor de p<0.05. Para permitir valores de ceros en algunos tratamientos, los datos se transformaron mediante √x + 1 (^{Gomez y Gomez, 1984}). Los resultados de las pruebas in vitro mostraron porcentajes variables en la inhibición del crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum y Colletotrichum gloeosporioides, por extractos acuosos de D. discolor obtenidos (HPP), en las distintas partes anatómicas de la planta y concentraciones. Se ha documentado que especies de Datura tienen actividad antifúngica; sin embargo, este efecto varía según la concentración y los tipos de solventes, así como de la parte de la planta de donde se obtienen (Öz, 2017). En S. rolfsii, la inhibición osciló de 25 a 53%, de 25 a 45% y del 77 a 100% con los extractos de raíz, semilla y hoja, respectivamente, con respecto al testigo sin extracto, con diferencias entre tratamientos (p < 0.001); la eficacia de los extractos de hoja al 4 y 6%, independientemente del tiempo de extracción, no fue significativamente diferente del tratamiento con tebuconazol a 1 ppm que inhibió al 100% el crecimiento de S. rolfsii (Cuadro 1; Figura 1 A-D).

Un estudio in vitro realizado con extracto metanólico de fruto de D. metel a diferentes concentraciones (0.5 a 4.0%) demostró una reducción significativa de la biomasa de S. rofsii entre un 69 y 94% (^{Jabeen et al., 2014}). También, Jabeen et al. (2022) evaluaron la eficacia del extracto metanólico de hoja de D. metel para el control del crecimiento in vitro de S. rolfii, las concentraciones de extracto que oscilaron entre 0.5 y 4.0%, controlaron significativamente el crecimiento del patógeno de 29 a 88% sobre el control. Los resultados con extractos acuosos de hoja obtenidos por HPP, en el presente estudio superan a los reportados con extractos metanólicos de fruto y hoja de D. metel.

No se observó reducción del crecimiento micelial de S. sclerotiorum en ninguno de los tratamientos con extractos de raíz y semilla, ni en los de hoja al 2%, mientras que en los extractos de hoja al 4 y 6% la inhibición osciló del 15 al 56%; la eficacia de los extractos de hoja al 4% (con 6 min) y 6% (en 3 y 6 min) no fue significativamente diferente al tratamiento con tebuconazol a 1 ppm que inhibió 72% del crecimiento de S. sclerotiorum (Cuadro 1; Figura 1 E-H).

Estudios previos indican que el extracto acuoso de D. metel inhibió a S. sclerotiorum con respecto al testigo (^{Sharma et al., 2015}). El extracto etanólico de hoja de D. inoxia, que tiene una mayor concentración de fitoquímicos secundarios y flavonoides totales en comparación con los extractos acuosos, mostró una inhibición del 100% del crecimiento micelial de S. sclerotiorum en todas las concentraciones evaluadas en comparación con el testigo mientras que el extracto acuoso mostró valores de inhibición del patógeno de 29 a 94%, observándose la mayor inhibición en las concentraciones de 1600 y 2000 μg 100 mL^-1 (^{Matías et al., 2020}). Roy et al. (2021) evaluaron tres concentraciones (5, 10 y 15%) de extractos acuosos de D. stramonium in vitro contra S. esclerotiorum y reportaron porcentajes de inhibición

Porcentajes con letras común en superíndices, por parte anatómica de la planta, no son significativamente diferentes (P = 0.05; n = 8). Testigo = el patógeno en PDA sin extracto o fungicida;

CQ = el patógeno en PDA + tebuconazol o carbendazim a 1 ppm. de 28, 31 y 37%, respectivamente. Adicionalmente, ^{Kewate et al. (2020}) reportaron una inhibición in vitro del 28% de S. sclerotiorum con extractos en polvo al 10% de D. stramonium. Los resultados reportados por ^{Matías et al. (2020}) superan a la inhibición aquí reportada para extractos acuosos de hoja de D. discolor por HPP; sin embargo, estos últimos son mayores a los reportados para D. stramonium contra S. sclerotiorum. En el presente estudio los extractos de raíz no mostraron inhibición del crecimiento micelial de C. gloeosporioides, mientras que los de semilla lo inhibieron de 50 a 64%, y los de hoja del 36 al 56%; la eficacia de los extractos de semilla no

Figura 1 Efecto de extracto acuso de Datura discolor obtenido por procesamiento a alta presión durante 6 minutos. A-D Sclerotium rolfsii, E-H Sclerotinia sclerotiorum, I-L Colletotrichum gloeosporioides. Control químico = tebuconazol o carbendazim 1 ppm). 

fue significativamente diferente al tratamiento con carbendazim 1 ppm que inhibió 78% del crecimiento de C. gloeosporioides. Aunque de manera menos eficiente que el tratamiento con carbendazim 1 ppm, los extractos de hoja inhibieron de manera significativa al patógeno con respecto al testigo sin extracto acuoso (Cuadro 1, Figura 1 I-L). ^{Karim et al. (2017}) evaluaron la actividad antifúngica de extractos metanólicos de hojas, semillas y raíces de D. metel a las concentraciones de 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3%. Todas las concentraciones redujeron significativamente el crecimiento radial de C. gloeosporioides, el extracto de semilla al 1.5% mostró la mayor inhibición (80%). De manera similar, extractos de hojas de D. stramonium obtenidos con metil acetato y con metanol inhibieron significativamente el crecimiento micelial de C. gloeosporioides (^{Alemu et al., 2014}). Previamente se reportó que extractos acuosos de hojas de D. discolor (al 1, 2 y 4% p/v) inhibieron el crecimiento micelial de C. gloeosporioides en un 52-73%, sin diferencias significativas con respecto al tratamiento con carbendazim a 1 ppm (^{Verdugo-Contreras et al., 2022}). Los extractos acuosos de hoja de D. discolor al 2, 4 y 6% obtenidos a alta presión inhibieron al patógeno de un 36 a 56%, mientras que los de semilla lo inhibieron de un 50 a 64% (Cuadro 1); es decir los porcentajes de inhibición observados para C. gloeosporioides son superiores con extractos de semilla como lo reporta Karim et al. (2017). Los porcentajes de inhibición con extractos acuosos de hoja de D. discolor contra C. gloeosporioides reportado por Verdugo-Contreras et al. (2023) son superiores a los reportados en el presente estudio, lo cual puede deberse a diferencias en las concentraciones y tipo de compuestos bioactivos en los procesos de extracción, con capacidad para inhibir a C. gloeosporioides. Extractos metanólicos y etanólicos de tallo y hoja de D. discolor inhibieron el crecimiento micelial de Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Fusarium moniliforme y Fusarium poae (TequidaMeneses et al., 2002). Los extractos con solventes como etanol, metanol y metil acetato en algunos casos pueden presentar mayor efectividad contra patógenos. Aunque sería interesante evaluar el efecto de extractos de D. discolor con solventes como etanol y metanol contra S. sclerotiorum y C. gloeosporioides se busca proponer alternativas con el empleo de tecnologías limpias.

^{Sharma et al. (2015}), reportaron que el extracto acuoso de D. metel fue efectivo contra S. sclerotiorum, pero no para Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum. El extracto acuoso de hoja de D. inoxia aunque inhibió hasta en un 94% a S. sclerotiorum no afectó el crecimiento de Fusarium solani (^{Matias et al., 2020}). Extractos acuosos de hoja de D. discolor obtenidos por HPP inhibieron a S. rolfsii, S. sclerotiorum y C. gloeosporioides, lo que muestra una capacidad antifúngica del extracto con mayor espectro.

Por otra parte, excepto el tratamiento de extracto de hoja al 4% contra S. sclerotiorum, no arrojó diferencias en la inhibición de los diferentes patógenos relacionada con los tiempos de extracción, es decir, de extractos obtenidos por alta presión con duración de 3 o 6 minutos del proceso. Lo cual puede ser tomado en cuenta en evaluaciones posteriores contra otros patógenos, considerando el extracto de hoja al 6%, sometido a 3 minutos a HPP, esto contribuye a eficientizar el proceso.

Aunque los estudios fitoquímicos D. discolor son escasos; recientemente se han aislado de esta especie los whitanólidos datudiscolides A (8) y B (9) (^{González et al., 2023}); también, se ha confirmado la presencia de whitanólidos con actividad antifúngica en D. ferox, D. metel, D. quercifolia y D. stramonium (^{Siddiqui et al., 1987}; ^{Kagale et al., 2004}), por lo que la inhibición del crecimiento de los fitopatógenos evaluados pudiera atribuirse a whitanólidos presentes en D. discolor, pero se requieren estudios adicionales para confirmar esta hipótesis. Estudios fitoquímicos realizados en otras especies reportan que los principales metabolitos secundarios para el género Datura son terpenoides, flavonoides, withanólidos, taninos, compuestos fenólicos, esteroides y ácidos grasos (^{Céspedes-Méndez et al., 2021}). El potencial antifúngico de extractos de hoja de D. inoxia contra S. sclerotiorum se ha relacionado con la abundancia de alcaloides y compuestos fenólicos (^{Matías et al., 2020}). Es relevante la realización de un tamizaje fitoquímico de D. discolor que complemente las investigaciones sobre su actividad antifúngica.

El extracto de hoja al 6%, evaluado seis meses posteriores a su procesamiento, redujo el crecimiento in vitro de S. rolfsii, S. sclerotiorum y C. gloeosporioides en un 99, 54 y 39%, respectivamente. Los porcentajes observados son similares al de las evaluaciones con el extracto en fresco. ^{Verdugo-Contreras et al. (2022}) reportaron que el extracto acuoso de hoja de D. discolor al 4% obtenido por maceración con calor logró reducir el crecimiento in vitro de C. gloeosporioides hasta 3 meses después de su preparación, pero con menor efectividad. Esto sugiere una mayor estabilidad de los compuestos bioactivos obtenidos con procesos por HPP con efectividad para los patógenos evaluados.

Los extractos de hoja al 6%, independientemente del tiempo de extracción muestran actividad antifúngica contra los tres hongos y la efectividad del extracto permanece activa al menos durante seis meses. Líneas de investigación futuras deberían centrarse en caracterizar los compuestos bioactivos implicados en la actividad antifúngica de los extractos acuosos de D. discolor obtenidos por HPP, así como en estudios a nivel invernadero y campo para determinar el potencial de dichos extractos para el control de los fitopatógenos evaluados in vitro.