Introduccion

El chile (Capsicum annum) es uno de los cultivos de gran importancia económi- ca a nivel mundial (Hasan et al., 2020). Esta hortaliza es una de las más importantes en México, puesto que es el país con la mayor variedad de chiles cultivados y es el primer exportador de chile verde en el mundo. En el 2023, se sembraron 165,226 hectáreas de chile en el país, siendo Chihuahua el segundo estado productor nacio- nal de este cultivo (^{SIAP, 2023}). El cultivo es afectado por diversas enfermedades causadas por patógenos de raíz. Estas son muy difíciles de controlar y representan uno de los principales factores que reducen el rendimiento, constituyendo una ame- naza para la seguridad alimentaria (^{Rizzo et al., 2021}). En este contexto, el chile chilaca es una de las hortalizas más afectadas por estas enfermedades. Patógenos de los géneros Fusarium, Rhizoctonia y Phytophthora, causan reducciones en la producción de hasta 50% (Velarde-Félix et al., 2018). En particular, estudios sobre Phytophthora capsici han demostrado que este patógeno es uno de los más devas- tadores, llevando a la pérdida total del cultivo (^{Sánchez-Gurrola et al., 2019}).

Fumigantes y fungicidas químicos de acción rápida, como el mefenoxam (enan-tiómero activo del metalaxil), se han utilizado contra estos patógenos (Sánchez- Gurrola et al., 2019; Shi et al., 2022). Sin embargo, su uso ha llevado al desarrollo de resistencia en los patógenos y ha resultado perjudicial para el ecosistema del suelo y salud humana (^{Ma et al., 2023}). En consecuencia, la tendencia actual en la investigación en el mundo se dirige hacia un enfoque más amigable con el am- biente, buscando reducir el uso de productos organosintéticos para el control de enfermedades (^{Eke et al., 2019}).

Así, el uso de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) son una opción prome- tedora dentro del manejo integrado de P. capsici. Se ha demostrado que estos hon- gos actúan como antagonistas de los patógenos (^{Hashem et al., 2021}), además de incrementar el crecimiento y rendimiento de las plantas. Asimismo, proporcionan tolerancia a diversos factores de estrés y toxicidad por metales pesados (^{Dowarah et al., 2022}; ^{Liu et al., 2023}).

Por otro lado, las nanopartículas metálicas han recibido gran atención por su efecto biocida y su aplicación como antimicrobianos en los cultivos (^{Bawskar et al., 2021}; ^{Ávila-Quezada et al., 2023}). El impacto de estas nanopartículas sobre hongos fitopatógenos se debe principalmente al daño que ocasionan en la dinámica de la membrana de los hongos, lo que puede comprometer su integridad (Athie- García, et al., 2018). Entre las nanopartículas metálicas, las nanopartículas de plata se destacan por su potencial antifúngico, siendo ampliamente estudiadas en el contexto agrícola contra diversos patógenos de raíz, incluido P. capsici (Shen et al., 2020; Li et al., 2022; Ávila-Quezada y Rai, 2023a).

Tanto los HMA (^{Hashem et al., 2021}) como las nanopartículas metálicas (El- Shetehy et al., 2021) promueven la defensa sistémica de las plantas. Los HMA inducen actividad de enzimas de defensa como la glutación reductasa y catalasa (CAT), las cuales desempeñan un papel crucial en la eliminación de especies reac- tivas de oxígeno (ROS) (Hashem et al., 2021). Además, influyen en las actividades de CAT, la superóxido dismutasa (SOD) y la peroxidasa (POD) (Wang et al., 2022). Debido a la importancia del chile a nivel mundial y a la susceptibilidad del cul- tivo al ataque de P. capsici, el objetivo de este estudio fue analizar el efecto de los hongos micorrízicos arbusculares y nanopartículas de plata en la reducción de la marchitez del chile chilaca, así como determinar la actividad de las enzimas SOD, CAT, PER y la concentración de H2O2.

Materiales y métodos

La presente investigación se realizó en condiciones climatológicas no contro- ladas, utilizando malla sombra; la preparación de soluciones, producción de zo- osporas y el porcentaje de colonización micorrízica se realizó en la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua. El análisis de las actividades enzimáticas se llevó a cabo en el laboratorio de nutrición vegetal del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo en Delicias, Chihuahua.

Resultados

Colonización micorrízica. En este estudio, se encontró que las raíces de chile chilaca inoculadas con el consorcio de HMA (G. margarita, G. fascilatum, G. cons- trictum, G. tortuosum, G. geosporum y A. scrubicurata), presentaron una colonización micorrizica del 36%. Esta colonización se distribuyó con un 71% de hifas, 18% de vesículas y 11% de arbúsculos.

La confirmación de la colonización micorrízica se realizó mediante tinción con azul de tripano, permitiendo la observación de una diversidad de estructuras de HMA (Figura 1). Además, se descartó la contaminación cruzada en los tratamientos (I, III, IV y VI) que no incluían HMA, ya que no se observaron estructuras micorrí- zicas en las raíces de estas plantas.

Figura 1 Estructuras micorrízicas en raíces de chile chilaca inoculadas con HMA: A, B, C) Hifas (H) y Vesículas (V), d) Arbúsculos (A). 

Severidad de la enfermedad.

Los primeros síntomas de la enfermedad causada por P. capsici, aparecieron cuatro días después de la inoculación en los tratamien- tos I (AgNPs + P. capsici), II (HMA + P. capsici) y III (Control positivo con el patógeno). Al séptimo día, los tres tratamientos presentaron un 60% en la severidad de síntomas. Sin embargo, al noveno día de la inoculación, todas las plantas del tratamiento control (P. capsici) mostraron una severidad superior al 96%, debido a la agresividad del patógeno. En contraste, las plantas tratadas con HMA permane- cieron con los mismos síntomas de severidad (60%), mientras que el tratamiento con AgNPs mostró un control menos efectivo que el de los HMA con un promedio de severidad del 80% en el mismo periodo. A pesar de ello, las AgNPs lograron reducir los síntomas de marchitez en un 16.4 % respecto al control a los 9 días des- pués de la inoculación. En la Figura 2 se ilustra el incremento de los síntomas de la enfermedad conforme al promedio diario de la escala de severidad previamente descrita.

Figura 2 Porcentaje de severidad de la enfermedad causada por P. capsici en chile chilaca. La severidad se evaluó con una escala, durante 12 días después de la inoculación del patógeno. 

Los resultados del área bajo la curva de este experimento mostraron una di- ferencia estadística significativa entre el tratamiento con HMA y el control con patógeno. Se observó que las micorrizas arbusculares lograron retardar y reducir la severidad de la enfermedad (Figura 3). Al finalizar el experimento, las plantas micorrizadas no superaron el 80% de severidad, en comparación con las plantas correspondientes al control positivo que mostraron 100% de severidad reduciendo en un 17.5 % la severidad en el total de plantas analizadas a los 12 días posteriores a la inoculación.

Figura 3 Comparación de medias del área bajo la curva de la escala de síntomas de severidad de la enfermedad causados por P. capsici en chile chilaca. Error estándar 5%. Letras diferentes en cada columna indican una diferencia significativa (p ≤0.05). 

Actividad enzimática

Superóxido dismutasa (SOD). El análisis de varianza no reveló diferencias signi- ficativas (p> 0.05) entre los tratamientos para la actividad enzimática de SOD. Se observó que los tratamientos correspondientes a AgNPs+P. capsici, HMA+P. cap- sici y control positivo presentaron mayor actividad enzimática con (214.8, 199.8 y 181.8 U/mg prot) respectivamente. Representado un aumento del 84%, 70% y 54% con respecto al control negativo en la actividad de SOD, 3 días posteriores a la inoculación con P. capsici (Figura 4).

Peróxido de hidrógeno (H2O2). La mayor concentración de H2O2 se observó en los tratamientos inoculados con el patógeno (AgNPs+P. capsici, HMA+P. capsici

Figura 4 Actividad de Superoxido dismutasa (SOD) en plantas de chile chilaca inoculadas con P. capsici tratadas con HMA y AgNPs. 

y control positivo) con una concentración de 14.9,13.8 y 12.5 µmolg^-1 respectiva- mente, atribuible a una elevada actividad de la SOD como mecanismo de defensa de la planta. En contraste, los tratamientos con HMA y AgNPs sin patógeno mos- traron una reducción en la acumulación de H₂O₂ en comparación con las plantas sanas (Figura 5).

Peroxidasa (PER).

Aunque la actividad de peroxidasa no mostró diferencias esta- dísticas significativas entre tratamientos (p> 0.05), se observa una tendencia hacia una mayor producción de PER en los tratamientos AgNPs+P. capsici, HMA+P. capsici y control positivo con una concentración de 0.024, 0.024 y 0.025 µMol guaiacol mg prot^-1 min^-1 respectivamente (Figura 7).

Figura 5 Concentración de H₂O₂ en plantas de chile chilaca inoculadas con P. capsici tratadas con HMA y Ag- NPs. 

Figura 6 Actividad de catalasa (CAT) en plantas de chile chilaca inoculadas con P. capsici tratadas con HMA y Ag- NPs. 

Figura 7 Actividad de peroxidasa (PER) en plantas de chile chilaca inoculadas con P. capsici tratadas con HMA y AgNPs. 

Nuestros resultados en su conjunto indican que, frente al estrés inducido por el patógeno, la planta emplea la actividad enzimática de peroxidasa para la descom- posición de H₂O₂ en H₂O, dado que la actividad de CAT se encuentra inhibida en los tratamientos con patógeno (Figura 8).

Figura 8 Efecto en la actividad enzimática en chile chilaca en plantas inoculadas con P. capsici. Superóxido Dismutasa (SOD), Catalasa (CAT), Peroxidasa (PER). 

Discusion

En este estudio, se observó la presencia hifas, micelio y arbúsculos en áreas discontinuas del sistema radicular. Los arbúsculos tienen un papel muy importante al facilitar el intercambio de minerales inorgánicos y compuestos de carbono y fósforo dentro de las células, proporcionando nutrientes esenciales a la planta hos- pedante (^{Prasad et al., 2017}). La capacidad demostrada de las plantas micorrizadas para mitigar enfermedades se atribuye a varios mecanismos como la mejora de la nutrición vegetal, la competencia por sitios de penetración, alteraciones en la mor- fología y estructura de las raíces, modificaciones en la microbiota de la rizosfera, liberación de compuestos antimicrobianos, e inducción de resistencia en las plantas (^{Huang et al., 2003}).

La simbiosis efectiva observada en nuestro estudio se refleja notablemente en la mejora del desarrollo, como lo evidencian los parámetros de crecimiento me- didos: diámetro del tallo, altura de la planta y número de hojas. Este hallazgo es consistente con investigaciones previas que han documentado efectos positivos de las micorrizas en el desarrollo de las plantas (^{Fauziyah et al., 2017}; ^{Malik et al., 2022}). Se ha sugerido que estas mejoras pueden atribuirse, en parte, al incremento de la superficie de absorción de nutrientes del suelo mediante las hifas del hongo, que extienden su exploración en el suelo y expresan proteínas de afinidad específica al fósforo. Además, los HMA mejoran la absorción y transporte de otros elementos esenciales como N, K, Mg y Zn, así como la tasa fotosintética y la eficiencia en el uso del agua (^{Begum et al., 2019}; ^{Olalde-Portugal et al., 2020}; ^{Madrid-Delgado et al., 2021}).

Este estudio demostró el efecto benéfico de la aplicación del consorcio de HMA en el crecimiento de chile chilaca, hallazgo que coincide con investigaciones pre- vias en agave inoculado con HMA (^{Carballar-Hernández et al., 2018}). Además, los HMA en esta investigación lograron reducir la severidad de la enfermedad causada por P. capsici, siendo nuestros resultados similares a los reportados por ^{Reyes-Tena et al. (2017}), quienes observaron que a mayor colonización micorrízica, menor porcentaje de infección de P. capsici en raíces de pimiento. Estos autores sugieren un posible mecanismo de competencia por los sitios de penetración en las raíces del pimiento.

El efecto protector de los HMA también ha sido demostrado en otros cultivos como frijol y tomate, donde el HMA R. irregularis indujo protección contra S. sclerotiorum al reducir el tamaño de las lesiones (^{Mora-Romero et al., 2015}). Ade- más, se han identificado otros mecanismos de protección de los HMA, incluyendo el aumento de la resistencia de la planta frente a patógenos mediante la inducción a la expresión de los genes relacionados con la patogenia como cAPX, Osmotin, β-1,3-glucanase, fenilalanina ammonia-lyasa y NPR 1 (^{Sarathambal et al., 2023}).

Además, los HMA estimulan la Resistencia Sistemática Inducida (ISR), acti- vando así los mecanismos de defensa de las plantas, promoviendo el establecimien- to de microorganismos benéficos y modificando los niveles de exudación de las raíces (^{Reyes-Tena et al. 2017}).

Entre los compuestos de los exudados radiculares inducidos por los HMA se en- cuentra la síntesis de la fitoalexina capsidiol en C. annuum, que retrasa los síntomas de marchitez; y equilibra el estrés oxidativo (^{Reyes-Tena et al. 2017}). También se han identificado ácidos grasos como el ácido tetradecanoico, ácido n-hexadecanoi- co, ácido octadecanoico y nonacos-1-eno en raíces de pimineta negra (Saratham- bal et al. 2023), los cuales poseen propiedades antifúngicas contra P. nicotianae (^{Zhang et al., 2020}).

En contraste, en raíces infectadas por P. capsici, se han identificado otros com- puestos en los exudados como hidrocarburos alcanos como (z)-3-tetradeceno, octil- ciclohexano, 4-ciclohexilundecano y decilciclohexano (^{Sarathambal et al., 2023}). La presencia de estos hidrocarburos estimula el crecimiento micelial de este oomi- ceto (^{Zhang et al., 2020}). No obstante, la relación entre los exudados radiculares y la resistencia de las plantas sigue siendo compleja y aun incomprensible.

En relación con el reciente término “Nanofitopatología” acuñado por Ávila- Quezada y Rai (2023b), que se refiere al uso de nanomateriales para reducir o erradicar patógenos de plantas, este estudio mostró reducción en la severidad de la enfermedad al emplear AgNPs en comparación con el tratamiento de control positivo (planta+P. capsici). Hasta el quinto día después de la inoculación del pató- geno, el tratamiento (planta+P. capsici+AgNPs) redujo en un 50% el desarrollo de la enfermedad, sugiriendo que aplicaciones adicionales de AgNPs podrían retardar aún más los síntomas de marchitez en chile.

A los 9 días, la planta alcanzó una severidad de marchitez superior al 90%, mientras que el tratamiento con AgNPs logró detener al patógeno manteniendo el tallo aun verde en un 80%. Este tratamiento permitió prolongar la vida de las plantas del chile. ^{Ali et al. (2015}), realizaron un estudio en plantas de tabaco para demostrar el efecto de las AgNPs contra P. parasitica, observando un 96.3% y un 77.8% de sobrevivencia de las plantas tratadas con 100 y 10 µg ml⁻¹ de AgNPs, respectivamente, comparado con el control, 5 días después de la inoculación. Otro estudio demostró el efecto protector de las AgNPs en plantas de pimiento, encon- trando una reducción significativa de los síntomas de la enfermedad (53.3 y 95%) en la infección por P. capsici en los tratamientos de 1 y 10ppm (^{Luan y Xo, 2018}). La actividad antifúngica de las AgNPs ha sido reportada previamente, y su efecto de protección en las plantas contra patógenos se atribuye a su impacto en la membrana celular de los hongos (Abdel-Azi et al., 2018; ^{Ávila-Quezada et al., 2022}; Ávila-Quezada et al., 2023). Sin embargo, la efectividad antifúngica de las AgNPs puede variar dependiendo de la forma, tamaño de la partícula, concentración utilizada y método de aplicación en la planta (^{Le et al., 2019}), por lo cual es necesario considerar estas características y explorarlas en futuros estudios.

Los resultados de esta investigación muestran que tanto los tratamientos con HMA como con AgNPs son prometedores. Aunque no se logró evitar el daño cau- sado por P. capsici en el chile chilaca, se consiguió retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad. Para mejorar estos resultados, se sugiere en futuros estudios aplicar tratamientos múltiples a intervalos de tiempo para prolongar aún más la fase sintomática de la marchitez en el chile.

La comprensión de la actividad enzimática de la planta en respuesta al estrés biótico sigue siendo compleja; sin embargo, estudios previos ha demostrado que los genes relacionados con la defensa de las plantas se sobreexpresan ante la pre- sencia de P. capsici, lo cual conduce a la producción de enzimas de defensa y exu- dados en la raíz (^{Sarathambal et al., 2023}).

Por un lado, la expresión de SOD ante P. capsici puede relacionarse con la in- ducción de vías de transducción de señales (^{Karipçin et al., 2018}) para mitigar los efectos del estrés oxidativo provocado por el patógeno (Ingle et al., 2017). Se sabe que SOD forma parte de la primera linea de defensa contra las especies reactivas de oxígeno (ROS), y su sobreexpresion ocurre en plantas que muestran cierta toleracia al oomiceto (^{Mohammadbagheri et al., 2021}). Por lo tanto, un aumento en la acti- vidad enzimática de SOD puede beneficiar a la planta al contrarrestar los efectos nocivos de las ROS (^{Kapoor et al. 2019}).

Nuestros resultados sobre la actividad de SOD son consistentes con los hallaz- gos de ^{Hashem et al. (2021}) en tomate inoculado con HMA y Fusarium oxysporum, donde las plantas infectadas mostraron un incremento en la actividad de SOD y otras enzimas en comparación con el tratamiento control y las plantas tratadas con HMA. De manera similar, nuestro estudio reveló una acumulación significativa de SOD en las plantas afectadas por P. capsici en comparación con las plantas sanas.

En contraste, nuestros resultados muestran que las plantas inoculadas con P. capsici presentaron una disminución en la actividad enzimática de CAT. Esta re- ducción en plantas tratadas con microorganismos ha sido documentada previamen- te (^{Duc et al., 2018}), ya que CAT favorece la supervivencia del patógeno al inhibir el estrés oxidativo producido por el hospedero (Sharma et al., 2019). Aunque el equilibrio entre las actividades de SOD y CAT es crucial para mitigar los niveles tóxicos de las enzimas reactivas de oxígeno en la célula, una baja actividad de CAT podría indicar que la planta induce otros mecanismos compensatorios que involu- cran enzimas como ascorbato peroxidasa y glutation peroxidasa para reducir los niveles de SOD (^{Banerjee y Roychoudhury, 2019})

Es conocido que la producción de ROS en las plantas se induce en respuesta a desequilibrios metabólicos provocados por el estrés, incluido el primer contacto con micorrizas, que es necesario para el establecimiento de la simbiosis micorrizica (^{Branco et al., 2022}). Sin embargo, en este estudio, las plantas de chile chilaca ino- culadas con HMA aunque sin infección por P. capsici mostraron una actividad en PER, CAT y SOD similar a las plantas sanas, lo que sugiere que el estrés generado por el contacto con las micorrizas ya había sido regulado por la planta.

Respecto a la interacción de las AgNPs a 50 ppm en las plantas de chile chilaca, se observó que no inducen un desequilibrio en la actividad de las enzimas antioxi- dantes analizadas. Por el contrario, se ha demostrado que las AgNPs poseen capa- cidad antioxidante al dismutar el H₂O₂ en agua y oxigeno (^{Bharathi et al., 2018}).

Para comprender la respuesta de la planta, son necesarios estudios adicionales que incluyan la medición de la expresión genética y la actividad enzimática en chile chilaca en varios intervalos posteriores a la inoculación de HMA y patógenos, pre- feriblemente cada 24 horas durante un periodo de cinco días o más. Este enfoque temporal permitirá obtener una comprensión detallada de las respuestas dinámicas de la planta en su interacción con HMA y patógenos.

Conclusiones

La aplicación de hongos micorrízicos arbusculares incrementó significativa- mente el número de hojas, diámetro de tallo y altura de las plantas de chile chilaca. Además, estos microrganismos confirieron cierta protección contra P. capsici. Asi- mismo, las AgNPs otorgaron protección contra P. capsici retrasando el avance de la enfermedad.

La interacción planta-patógeno indujo una respuesta enzimática antioxidante. Esto se reflejó en el aumento de la actividad de SOD y PER, acompañada de una inhibición de la actividad enzimática CAT y una acumulación de H₂O₂. Estos me- canismos enzimáticos se comportaron opuesto en comparación con la aplicación de HMA y AgNPs. La combinación de HMA y AgNP surgió como una estrategia prometedora, proporcionando un mecanismo de defensa mejorado contra los pató- genos de las plantas.